Sperimentale trasporto pneumococco umano

Lo scopo di questa procedura è quello di stabilire un trasporto sperimentale dello pneumococco umano. Ciò si ottiene diluendo e quantificando prima i batteri nell'inoculo. Nella seconda fase, il volontario viene inoculato per via intranasale con streptococcus pneumoniae.

Successivamente, il volontario esegue un lavaggio nasale nei giorni due, sette e 14 dopo l'inoculazione. Infine, la microbiologia classica viene utilizzata per determinare se il volontario è portatore degli occupanti inoculati. In definitiva, il trasporto sperimentale dello pneumococco umano può essere ottenuto utilizzando questo metodo sicuro e riproducibile.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai modelli di trasporto murino esistenti è che questa tecnica offre un modello di trasporto nell'ospite naturale dello pneumococco umano. Inoltre, questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello pneumococco, come ad esempio quali sono i correlati immunologici della protezione? Qual è l'effetto immunizzante del trasporto e qual è l'effetto della pressione dell'ospite sull'agente patogeno nella nicchia nasofaringeo?

Le applicazioni di questa tecnica includono il suo utilizzo come metodo per selezionare nuovi vaccini antipneumococcici. Abbiamo in programma di utilizzare la prevenzione del trasporto come surrogato dell'immunità indotta dal vaccino. A dimostrare la tecnica clinica saranno suor Angie Wright e l'infermiere David Shaw.

30 minuti prima dell'appuntamento programmato per l'inoculazione volontaria attraverso una provetta di inoculo prelevata dal congelatore a meno 80 gradi Celsius. Quindi centrifugare l'inoculo in una microcentrifuga per tre minuti a 17.000 volte. G, mentre il tubo gira, scaldare alcune piastre di agar sanguigno in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.

Quindi rimuovere il brodo dall'inoculo di centrifuga e lavare il pellet in un millilitro di soluzione fisiologica. Ripetere la fase di centrifugazione e lavaggio. Eseguire una serie di diluizione per la concentrazione di inoculo desiderata, quindi quantificare la quantità di batteri nell'inoculo con un metodo simile a miglia e misra.

Le colonie adulte diventeranno visibili il giorno seguente. Portare l'inoculo al volontario che dovrebbe essere seduto comodamente in una posizione semi sdraiata. Quindi utilizzando un perpe P 200 e puntali filtranti sterili.

Aspirare 100 microlitri di inoculo nella punta del perpe e inserire la punta appena all'interno della cavità nasale. Espellere lentamente l'inoculo sulla mucosa nasale con un movimento circolare. Non posizionare la punta della pipetta troppo indietro, altrimenti l'inoculo scorrerà lungo la gola.

Ripetere l'inoculazione per le altre narici per evitare che i batteri entrino nel flusso sanguigno. Fare attenzione a non danneggiare la mucosa con la pipetta. Quindi chiedi al volontario di rimanere in posizione semi sdraiata per 10 minuti per consentire ai batteri di disperdersi attraverso la mucosa.

Dopo aver somministrato l'inoculo ai volontari, ripetere la quantificazione batterica in laboratorio. Quindi etichettare il tubo con la data e la dose di inoculo e conservare l'inoculo a meno 80 gradi Celsius. Prima di iniziare il lavaggio nasale, fai sedere comodamente il volontario con la testa inclinata all'indietro di 30 gradi rispetto alla verticale.

Quindi chiedi al volontario di fare un respiro profondo mentre spinge la lingua su e indietro contro il palato. Fai in modo che il volontario segnali quando questa posizione è raggiunta. Ora lava la cavità nasale quattro volte con 20 millilitri di soluzione fisiologica, scaricando cinque millilitri di soluzione salina alla volta nello spazio nasale anteriore.

Chiedi al volontario di piegarsi immediatamente in avanti ed espirare rapidamente attraverso il naso in una ciotola di alluminio per espellere il liquido dopo ogni lavaggio salino di cinque millilitri. Dopo aver lavato la cavità nasale con i quattro 20 millilitri, riunire tutti i campioni raccolti in una provetta da centrifuga. Ora centrifugare i campioni di lavaggio nasale volontario per 10 minuti a 3, 345 volte G.Rimuovere il supinato e conservarlo come aliquote da un millilitro in provette einor etichettate a meno 80 gradi Celsius.

Aggiungere 100 microlitri di terreno STGG al pellet e mescolare accuratamente, quindi determinare il volume totale nel tubo. Successivamente, una goccia di 20 microlitri del pellet risospeso su una piastra di agar sanguigno contenente gentamicina e striare l'intera piastra. Se il lavaggio nasale è post inoculazione, utilizzare 10 microlitri di STGG contenente il pellet risospeso.

Per la quantificazione batterica con il metodo miles e Misra, aggiungere altri 800 microlitri di STGG al tubo di lavaggio nasale e mescolare accuratamente. Quindi impiattare 25 microlitri della soluzione di cellule batteriche STGG su un'altra piastra di agar sanguigno e 25 microlitri su una piastra di agar di cioccolato, strisciando l'intera entrambe le piastre. Quindi congelare i batteri rimanenti in due fiale criogeniche a meno 80 gradi Celsius.

Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per una notte in anidride carbonica al 5%. Il giorno successivo, esaminare le piastre per lo pneumococco e altri potenziali agenti patogeni respiratori. Le piastre di agar sanguigno, inoculate con lavaggi nasali, possono essere difficili da leggere.

Questa immagine mostra un esempio di una lastra facile da leggere con gli pneumococchi ben visibili. Questa piastra, tuttavia, contiene molta flora cocolonizzante che rende più difficile determinare se gli pneumococchi sono presenti ad ogni appuntamento. Ai volontari è stato chiesto di descrivere eventuali sintomi del tratto respiratorio superiore, se presenti, ed è stato evidenziato il confronto tra portatori e non portatori.

Delle 145 persone a cui è stato recentemente somministrato lo pneumococco, 28 hanno lamentato sintomi come riassunto in questa tabella. Otto di questi volontari erano portatori, 20 no. Tutti i reclami sono stati esaminati dal comitato per la sicurezza esterno e a seguito di indagini approfondite.

Nessun sintomo è stato attribuito alla malattia pneumococcica. I sintomi più comuni erano mal di gola, naso chiuso e malattia simil-influenzale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante disporre di un piano di sicurezza molto approfondito, che copra ogni fase del metodo, soprattutto per la sicurezza dei volontari.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire il trasporto sperimentale dello pneumococco umano e rilevare il trasporto utilizzando un lavaggio nasale.