Imaging molecolare a Target trapiantate cellule progenitrici muscolari

A mezzi non invasivi per valutare il successo del trapianto di mioblasti è descritto. Il metodo si avvale di un gene reporter di fusione unificato composto da geni la cui espressione può essere ripreso con differenti modalità di imaging. Qui, si fa uso di un

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di valutare in modo non invasivo il successo del trapianto di mioblasti utilizzando un approccio genico reporter e l'imaging a bioluminescenza. Ciò si ottiene introducendo per la prima volta il gene riportato per la tri fusione che esprime f Luke, MRFP e SR 3 90 tk sotto il controllo del promotore CMV nella linea cellulare immortalizzata C 2 C 12 mioblasto. Il secondo passo consiste nel quantificare il numero di mioblasti che esprimono il gene porter.

In questo studio, l'efficienza di trasfezione viene calcolata contando le cellule che esprimono MRFP su un microscopio a fluorescenza. Successivamente, 10 alle cinque cellule ingegnerizzate in un volume uguale o inferiore a 15 microlitri vengono impiantate per via intramuscolare nell'arto posteriore di topi MDX distrofici. Le cellule trasfettate UNT vengono impiantate nell'arto posteriore controlaterale come controllo, quindi viene eseguita una scansione di base.

Il passaggio finale consiste nell'iniettare intraperitoneale, iniettare il substrato genico Lucifero riportato da Luke dopo un periodo di assorbimento di circa 20 minuti, condurre una seconda scansione di bioluminescenza per acquisire un'immagine delle cellule impiantate. In definitiva, l'assorbimento di Lucifero è stato osservato in modo specifico nelle cellule che esprimono f Luke senza bioluminescenza rilevabile nelle cellule di controllo che non esprimono il gene report. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della tecnologia di trasferimento di perdite lievi, come la migrazione delle cellule dopo l'impianto, nonché la sopravvivenza delle cellule dopo il trapianto.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia per malattie muscolari come la distrofia muscolare di Duchenne perché è un mezzo rapido e affidabile per colpire le cellule in modo non invasivo. Dopo il trapianto, possiamo quindi valutare l'area trapiantata nel tempo e valutare il successo o il fallimento del trattamento. A dimostrare la procedura saranno Kelly gutpe, uno studente laureato, e Rebecca Mcg, un tecnico di ricerca del nostro laboratorio, scusate, Coltura C due mioblasti C 12 in terreno di aquile modificate dcos ad alto glucosio con il 10% di siero fetale bovino secondo le procedure standard per questa linea cellulare. Non permettere alle cellule di diventare confluenti per più dell'80% poiché ciò impoverirebbe la popolazione miotica.

Per preparare prima le cellule per la trasfezione, raccogliere le cellule dal pallone di riserva coprendo brevemente lo strato di cellule di risciacquo HBSS con tripsina. Quindi aspirare rapidamente la tripsina e posizionare il pallone nell'incubatore di coltura tissutale per cinque minuti. Durante l'incubazione, preparare due fiasche T 75 contenenti ciascuna nove millilitri di terreno di coltura.

Al termine del tempo di incubazione, aggiungere 10 millilitri di terreno al pallone e sciacquare il terreno sul fondo del pallone quattro o cinque volte per garantire la raccolta di tutte le cellule. Quindi seminare ciascuno dei matracci T 75 con un decimo della sospensione cellulare dal pallone T 75 di serie. Quando si tenta per la prima volta questa procedura, eseguire un test MTT per valutare l'effetto della marcatura cellulare sulla sopravvivenza e la differenziazione cellulare e la vitalità dei mioblasti ingegnerizzati prima del trapianto.

Una volta che le cellule hanno raggiunto il 50% di confluenza, tranfettare una fiaschetta T 75 con 36 microgrammi del gene reporter di fusione CMV Tri in un volume ottimale di 4,5 millilitri utilizzando Lipofectamine 2000 secondo le istruzioni del produttore. Inoltre, eseguire una finta trasfezione del secondo pallone T 75 utilizzando solo lipo 2000 e optimum senza DNA come controllo negativo. Lasciare trasfettare le cellule per almeno 20 ore a 37 gradi Celsius il giorno successivo, aspirare il terreno di trasfezione e sostituirlo con il volume adeguato di terreno di coltura utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita.

Acquisisci immagini in campo chiaro e in fluorescenza rossa per calcolare l'efficienza di trasfezione. Dopo aver raccolto il mioblasto trasfettato dalla tripsina e aver sospeso le cellule in quattro millilitri di terreno completo, utilizzare un emocitometro per eseguire una conta cellulare. Pipettare 10 delle sei cellule in una microprovetta sterile da 1,5 millilitri con un'efficienza di trasfezione di circa il 10%Questo numero di cellule dovrebbe dare origine a 100.000 array di Lucifero rilevabili che esprimono cellule dopo il trapianto, il volume finale di iniezione dovrebbe essere di 15 microlitri.

Se il volume nella provetta è maggiore di questo, centrifugare le microprovette a 2000 giri/min per un minuto, asate il supinato e poi piegare in un volume massimo di 15 microlitri di crescita. Mezzo privo di FBS Dopo aver indotto l'anestesia nel topo utilizzando il 2% di fluoro, passare all'1,5% di fluoro per il mantenimento dell'anestesia. Durante la procedura, posizionare il mouse in posizione prona e strappare i peli dall'area dorsale degli arti posteriori.

Assicurarsi che i mioblasti C 2 C 12 siano ben sospesi, quindi caricare la sospensione cellulare in una siringa da insulina. Iniettare le cellule direttamente nella testa laterale del muscolo gastro con un angolo di 30 gradi. Dopo aver iniettato i mioblasti trasfettati nell'arto posteriore destro, ripetere la procedura con i mioblasti trasfettati UNT nell'arto posteriore controlaterale.

Eseguire una scansione della bioluminescenza di base. Una persona dovrebbe trasferire rapidamente il mouse sul tavolino nello scanner ottico posizionando il mouse in posizione prona. Una seconda persona collega contemporaneamente la linea di anestesia per assicurarsi che il topo rimanga anestetizzato.

Estendi delicatamente gli arti posteriori e usa del nastro adesivo per tenere l'arto in posizione in modo che entrambe le aree di iniezione siano visibili. Chiudere la camera e assicurarsi che nessuna luce possa accedere all'interno dello scanner in quanto ciò aumenterà il segnale di fondo rilevato. Lo scanner deve essere impostato sui parametri inclusi nelle istruzioni del produttore per l'imaging a bioluminescenza.

Disegna una regione di interesse attorno all'area iniettata e avvia la scansione per ottenere l'immagine di base mentre il topo è anestetizzato. Intraperitoneale. Iniettare 150 milligrammi per chilogrammo di substrato luciferasi lucciola Lucifero in. Metti il topo in una gabbia pulita e lascialo riprendersi dall'anestesia.

Attendere un periodo di assorbimento di 15 minuti prima di preparare il mouse per la scansione successiva. Dopo il periodo di assorbimento di 15 minuti. Anestetizzare il mouse e trasferirlo sullo scanner come prima.

Eseguire una seconda scansione a luminescenza allo stesso modo della scansione in background. Il periodo di assorbimento totale di 20 minuti dovrebbe fornire la massima intensità del segnale, ma se lo si desidera può essere eseguita una scansione successiva. Questo schema mostra il costrutto del reporter CMV Tri Fusion.

Il pannello di sinistra mostra l'immagine in campo chiaro di due mioblasti C 12 trasfettati con il plasmide reporter di fusione, mentre il pannello di destra mostra la stessa regione di un'immagine a fluorescenza come si vede qui. Viene disegnata una regione di interesse per racchiudere l'area degli arti posteriori strappati dove sono stati iniettati i mioblasti. La bioluminescenza non viene rilevata durante una scansione in background.

A 23 minuti dall'iniezione di Luciferian, viene rilevato un chiaro segnale dall'arto posteriore destro dove sono stati iniettati i mioblasti che esprimono la luciferasi. Come si è visto, non viene rilevata alcuna bioluminescenza nell'arto posteriore controlaterale iniettato con mioblasti non resecati. Qui l'immunoistochimica con un anticorpo luciferasi di lucciola conferma l'impianto intramuscolare di cellule C 2 C 12 trasfettate.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare tecniche di coltura tissutale asettiche e pratiche di manipolazione degli animali appropriate dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie muscolari per esplorare l'efficacia della terapia cellulare per ora in piccoli modelli animali preclinici di una malattia. Poi, più avanti in ambito clinico nei pazienti, dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come impiantare le cellule e di come localizzare in modo non invasivo i mioblasti trapiantati ingegnerizzati utilizzando l'imaging a bioluminescenza.