Name: Ex Vivo Blood Red emolisi test cellulare per la valutazione degli agenti Endosomolytic pH-sensibile per la consegna dei farmaci citosolico Biomacromolecular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Scopri il test di emolisi su globuli rossi per valutare vettori di drug delivery pH-sensibili. Questo metodo quantifica la potenziale rottura della membrana endosomica per migliorare la consegna intracellulare di farmaci biologici.

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Gli autori riconoscono il finanziamento attraverso il Dipartimento della Difesa dal Congresso Regia programmi di ricerca medica (# W81XWH-10-1-0445), National Institutes of Health (NIH R21 HL110056), e American Heart Association (# 11SDG4890030).

1. Preparazione e sterilizzazione di buffer e agenti di test <ol><li> 150 mM NaCl tampone: sciogliere 4,383 g di cristalli di NaCl in 500 ml di acqua Nanopure. </li><li> Buffer pH: Preparare tamponi fosfato a pH 5.6, 6.2, 6.8, e 7.4 mescolando quantità appropriate di monobasico e sodio fosfato bibasico. Se i campioni devono essere sottoposti a valori di pH più bassi (pH &lt;5.6) poi un buffer più appropriato, come il tampone citrato, dovrebbe essere usato. Ricette del buffer sono facilmente disponibili, e un esempio di riferimento è stato fornito qui 12. </li><li> Sterilizzare tutti i buffer notato in precedenza attraverso una bottiglia-top gli aspiratori per filtrazione e ricontrollare tampone di pH. </li><li> 20% Triton X-100 (controllo positivo): Mescolare 20 ml puro Triton X-100 in 80 ml di acqua Nanopure. Vortex vigorosamente e ultrasuoni per sciogliere. Lasciare a temperatura ambiente per una notte prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Preparazione di eritrociti <ol><li> Ottenere 25 ml di sangue from un donatore anonimo umano, disegnato direttamente in K 2-EDTA rivestite vacutainer per prevenire la coagulazione. </li></ol> NOTA: Tutte le procedure devono essere pre-approvato dal Consiglio appropriata revisione istituzionale (IRB) e prelievo venoso e raccolta del sangue deve essere eseguita da un flebotomo addestrato al fine di minimizzare il rischio per il donatore. Procedure standard di flebotomia sono stati pubblicati altrove 13. <ol start="2"><li> Centrifugare il sangue a 500 xg per 5 minuti, ed i livelli di ematocrito marchio (rosso, strato inferiore) e plasma (giallo, strato superiore) sul tubo. </li><li> Aspirare delicatamente plasma tramite una micropipetta, aggiungere in candeggina, e gettare in rifiuti a rischio biologico. </li><li> Riempire tubo di ematocrito alla linea marcata (livello iniziale del plasma) con 150 mM di soluzione di NaCl. Chiudere e capovolgere un paio di volte per mescolare delicatamente. Centrifugare a 500 xg per 5 min. </li><li> Ripetere il passaggio 2,3-2,4 per lavare le cellule del sangue di nuovo. Poi aspirare Supernatformica e sostituirlo con PBS a pH 7,4. Capovolgere per miscelare. </li><li> Dividere il sangue in modo uniforme in quattro tubi, corrispondente a ciascun pH che sarà testato. Etichettare i tubi secondo ognuna pH da testare (5,6, 6,2, 6,8, 7,4). </li><li> Centrifugare provette a 500 xg per 5 min. Segna i livelli su tubi, quindi aspirare il surnatante. </li><li> Riempire ogni provetta di linea contrassegnata con tampone di pH adeguato (come indicato in 2.6). </li><li> Etichettare quattro provette da 50 ml coniche (uno per pH a test), e pipettare 49 ml di PBS a pH appropriato in ciascuna provetta conica. </li><li> Aggiungere 1 ml di eritrociti (pH stesso) nel tubo corrispondente per una diluizione 1:50. Ispezionare visivamente il sangue diluito, che deve essere torbida e si sistemerà, se lasciati indisturbati. Se nessuna forma di pellet, le cellule sono lisate. </li></ol> 3. Lysis Assay 96 pozzetti Piastra di supporto e di quantificazione <ol><li> Preparare soluzioni di base di tutti gli agenti sperimentali di consegna della droga, a 20 volte la concentrazione finale desiderata da sottoporre a prova (testavrà 10 ml di agente di consegna della droga + 190 ul cellule rosse del sangue diluito, che portano ad una diluizione 1/20 di un agente originale di somministrazione di farmaci in miscela di prova finale). Stock di 20, 100, e 800 pg / ml sono suggeriti, risultante in concentrazioni finali di 1, 5, e 40 pg / ml, rispettivamente. </li><li> Pipettare 10 ml di ciascuna soluzione madre in fondo a V da 96 pozzetti. Per ottenere risultati ottimali, caricare ciascun campione in triplicato o quadruplicato. </li></ol> NOTA: per facilità, si raccomanda una distinta piastra a 96 pozzetti deve essere preparato per ciascun pH da testare, con ciascun campione (per ogni concentrazione) caricato con n = 3-4 per piastra. <ol start="3"><li> Per pozzetti di controllo positivi, aggiungere 10 ml di 20% Triton X-100. </li><li> Per i pozzetti di controllo negativo, aggiungere 10 ml di tampone fosfato. Utilizzare tampone al pH stesso da testare. </li><li> Dispensare 190 ml di eritrociti diluiti (vedi 2.10) in ogni pozzetto, assicurandosi soluzione madre cella rimaneomogenea durante il trasferimento. Suggerimento: Utilizzare pipetta multicanale per semplificare questo compito. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C per un&#39;ora (Opzionale: Utilizzare un agitatore orbitale o rocker). </li><li> Centrifugare piastre per 5 min a 500 xg per eritrociti pellet intatti. Nota: quando si rimuove la placca dalla centrifuga e il trasporto al passo successivo, maneggiare con cura ed essere certi di non disturbare il pellet. </li><li> Usando una pipetta multicanale, trasferire 100 pl di surnatante da ciascun pozzetto in una chiara, a fondo piatto da 96 pozzetti. Nota: se il pellet cellulare è accidentalmente disturbato per ogni campione (s), si può ri-centrifugare la piastra e quindi procedere con il trasferimento supernatante. </li><li> Misurare assorbanza di supernatanti con un lettore di piastre. Si noti che un intervallo di lunghezze d&#39;onda possono essere utilizzati (400-541 nm). </li></ol> NOTA: lettori di piastre diverse possono avere punti di saturazione e sensibilità diverse, in modo che la scelta di una lunghezza d&#39;onda per measurements dipende se i dati di emolisi campioni sperimentali può essere normalizzati affidabile contro emolisi massima indotta dal trattamento detergente. Questo richiede una misurazione precisa valori di assorbanza dei campioni di controllo positivi. <ol start="10"><li> Utilizzo di Microsoft Excel o un simile software di analisi dei dati, trovare la media delle letture di assorbanza lo sfondo da campioni di controllo negativo create per ogni pH (punto 3.4). Sottrarre questo valore assorbanza di fondo da tutti gli altri campioni che sono stati misurati in quel pH. </li><li> Dopo sottrazione del fondo, trovare l&#39;assorbanza media del controllo positivo detergente trattati con campioni (punto 3.3). Poi normalizzare tutti i punti dati sperimentali a questo valore medio di assorbanza, che dovrebbe rappresentare il 100% emolisi. Infine, moltiplicare ogni valore ben del 100% per calcolare emolisi% che si è verificato in ogni singolo pozzetto rispetto al controllo detergente. </li></ol>

<ol><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , 4th, Garland Science. (2002).</li>
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</ol>

IRB di approvazione: Procedure che coinvolgono soggetti umani sono stati approvati dal Comitato di Revisione Vanderbilt University Consiglio Istituzionale (IRB; protocollo # 111251). Nessun conflitto di interessi dichiarati.

pH-sensibili polimeri o altri agenti destinati endosomolytic funzione può essere rapidamente ed efficacemente proiettato sulla base di lisi dei globuli rossi a pH incontrate in endosomi (Figura 1; pH 6,8 - endosoma precoce, pH 6,2 - endosoma tardi, pH 5,6 - lisosoma). 14-17 pH-dipendente emolisi è stato utilizzato per schermare la capacità dei vettori di mediare endosomal rilascio di peptidi terapeutici biomacromolecular (ad esempio, siRNA, ODN, proteine), ed i risultati di questa an...

Sebbene vi siano molti potenziali obiettivi terapeutici impatto elevato all&#39;interno della cellula, la consegna intracellulare di agenti rappresenta una sfida significativa. Spesso, i farmaci biologici, in particolare, vengono internalizzati dalle cellule e trafficata in vescicole che o portare al degrado del loro contenuto tramite l&#39;endo-lisosomiale via, o vengono trasportati indietro fuori dalla cellula tramite esocitosi. 1 In quest&#39;ultimo processo, il pH interno delle vescicole viene acidificata a circa 5-6, che è il pH ottimale per l&#39;attività di enzimi che funzionano in questo vano, ad esempio il lisozima. 2 Recentemente, un certo numero di materiali sono stati specificamente progettati per sfruttare l&#39;acidificazione di endosomi per facilitare l&#39;erogazione citosolico del loro carico. Un esempio di questo approccio utilizza nanoparticelle polimeriche sintetiche, micelle cui anima è zwitterionici e carica neutra a pH fisiologico (cioè 7,4). Tuttavia, a pH 6,0- 6,5, i polimeri diventano protonati e acquisire una carica positiva netta che destabilizza il nucleo micelle, e segmenti polimerici esposti interagire e distruggere la membrana endosomiale. Questa attività è stato dimostrato per promuovere la fuga endosomiale di peptidi e acido nucleico-terapie basate, consentendo loro di accedere ai bersagli citosolico. 3,4 Altri esempi di metodi sviluppati per mediare fuga endosomiale che distruggere la barriera membrana includono &#39;fusogenico&#39; peptidi o proteine ​​che possono mediare la fusione della membrana o transitoria formazione di pori nel doppio strato fosfolipidico. 5 omopolimeri di acidi acrilici anionici alchile come acido poli (propylacrylic) sono un altro approccio ben studiato, e in questi polimeri, lo stato di protonazione di acido carbossilico detta sospensione transizione in una idrofobica, membrana dirompente stato in endo-lisosomiale intervalli di pH. 6,7 Un sistema modello utile per lo screening di comportamento endosomolytic è l&#39;indirizzox pH-dipendente vivo dosaggio emolisi. 8 In questo sistema modello, la membrana eritrocitaria serve come un surrogato della membrana a doppio strato lipidico che racchiudono endo-vescicole lisosomiali. Questo modello generalizzabile è stato utilizzato da altri per valutare il comportamento endosomolytic di penetrazione cellulare peptidi e altri sistemi polimerici consegna del gene. 8-11 In questo esperimento, globuli rossi umani e materiali di prova sono co-incubate in tampone a pH definiti che mimano extracellulari (7.4), precoce endosomali (6.8), e la fine del endo-lisosomiale (&lt;6.8) ambienti. La quantità di emoglobina rilasciata durante il periodo di incubazione è quantificato come misura di lisi dei globuli rossi, che viene normalizzato alla quantità di emoglobina rilasciata in campioni di controllo positivi lisate con un detergente. Da screening di una piccola libreria di materiali di prova potenzialmente endosomolytic, si può dedurre che i campioni che non producono emolisi a pH 7.4, ma orlo significativamente elevatiolysis a pH &lt;6.5, saranno i candidati più efficaci e cytocompatible per la consegna della droga citosolico. Materiali che soddisfano questi criteri dovrebbe rimanere inerte e non indiscriminatamente distruggere le membrane a doppio strato lipidico (cioè che potrebbe causare citotossicità) fino ad essere esposto ad una diminuzione del pH locale dopo interiorizzazione in endo-compartimenti lisosomiali. In questo protocollo, eritrociti sono isolati da un donatore umano e co-incubate a pH 5,6, 6,2, 6,8, 7,4 o con agenti farmaci sperimentali endosomolytic consegna. Eritrociti intatti sono pellettizzati, ei surnatanti (contenenti emoglobina rilasciata da eritrociti lisati) vengono analizzati per l&#39;assorbanza caratteristica di emoglobina mediante un lettore di piastre (Figura 1).

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubi </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-253-145 </td><td> Per la raccolta del sangue </td></tr><tr><td> BD Vacutainer sangue aghi di raccolta, 20,5 scartamento </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-665-31 </td><td> Per la raccolta del sangue </td></tr><tr><td> BD Vacutainer tubo porta / ago Adattatore </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-289-953 </td><td> Per la raccolta del sangue </td></tr><tr><td> BD Marca isopropilico tamponi imbevuti di alcool </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-680-63 </td><td> Per la raccolta del sangue </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-657-6 </td><td> Per la raccolta del sangue </td&gt; </tr><tr><td> Acido cloridrico (conc.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td> Per la regolazione del pH del D-PBS. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td> Controllo positivo </td></tr><tr><td> Dulbecco PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene MF75 sterile monouso Bottle-Top Unità Filtro con membrana SFCA </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-740-44A </td><td></td></tr><tr><td> BD piastre a 96 pozzetti, a fondo piatto, di coltura trattata con polistirolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-2C </td><td> Per piastra di lettura al termine del saggio. </td></tr><tr><td> BD piastre a 96 pozzetti, fondo tondo, di coltura trattata con polistirolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-17 </td><td> Per incubazione di globuli rossi con agenti sperimentali. </td></tr></table&gt;

ex vivo blood red emolisi test cellulare per la valutazione degli agenti endosomolytic ph-sensibile per la consegna dei farmaci citosolico biomacromolecular

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Doppi strati di fosfolipidi che costituiscono endo-lisosomiale vescicole possono rappresentare un ostacolo alla consegna di farmaci biologici a bersagli intracellulari. Per superare questo ostacolo, una serie di trasportatori di farmaci sintetici sono stati progettati per interrompere attivamente la membrana endosomiale e consegnare cargo nel citoplasma. Qui, descriviamo il saggio emolisi, che può essere usato come un rapido, ad alta resa per la schermata citocompatibilità e attività endosomolytic dei sistemi intracellulari drug delivery. Nel saggio emolisi, globuli rossi umani e materiali di prova sono co-incubate in tampone a pH definiti che imitano extracellulari, endosomali precoce e tardiva endo-lisosomiali ambienti. A seguito di una fase di centrifugazione a pellet intatti cellule rosse del sangue, la quantità di emoglobina rilasciata nel terreno viene misurata spettrofotometricamente (405 nm per migliore dinamica). Il rosso per cento rottura delle cellule del sangue viene poi quantificato rispetto al controllo positivo samples lisate con un detergente. In questo sistema modello la membrana eritrocitaria funge da surrogato per la membrana lipidica a due strati che racchiudono endo-lisosomiale vescicole. Il risultato desiderato è emolisi trascurabile a pH fisiologico (7,4) ed emolisi robusta in endo-lisosomiale intervallo di pH da circa pH 5-6,8.

<html> In genere, gli agenti che presentano ideale pH-dipendente comportamento emolitica hanno il più alto potenziale per la consegna citosolico di farmaci, acidi nucleici, o altre molecole bioattive. Questo è esemplificato da Agent # 1 come rappresentato in figura 2, che presenta emolisi minima a pH 7,4, ma un forte aumento comportamento emolitica a intervalli di pH endosomiali (&lt;6,5). Alcuni agenti possono esibire livelli significativi di comportamento emolitica a intervalli di pH fisiologici (Agent...

Un saggio di emolisi può essere usato come un rapido, ad alta resa di schermo citocompatibilità sistemi di rilascio di farmaci e l&#39;attività endosomolytic per la consegna del carico intracellulare. Il saggio misura la rottura di membrane eritrocitarie in funzione del pH.

Ex Vivo Blood Red emolisi test cellulare per la valutazione degli agenti Endosomolytic pH-sensibile per la consegna dei farmaci citosolico Biomacromolecular

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare quantitativamente il potenziale di perturbazione della membrana di vettori per il rilascio di farmaci destinati al trasporto intracellulare di biologici, utilizzando globuli rossi come modello biologico della membrana endosomiale. Questo video è stato prodotto dal laboratorio di terapie avanzate della Vanderbilt University. Tutte le procedure che coinvolgono soggetti umani sono state approvate dal comitato etico istituzionale della Vanderbilt.Prima di tutto, una breve introduzione all'endocitosi, all'emolisi e all'emolisi. I vettori di prodotti biologici vengono internalizzati nelle cellule all'interno di endosomi mediante endocitosi non specifica o mediata da recettori. Successivamente all'endocitosi.Il carico viene degradato nei lisosomi oppure trasportato per l'esocitosi nuovamente nello spazio extracellulare. Come mostrato, tuttavia, la diminuzione del pH in un endosoma può essere sfruttata mediante vettori farmacologici sensibili al pH che, in risposta all'ambiente acido, diventano in grado di alterare la membrana, creando pori fisici e/o destabilizzando la membrana endosomiale; una volta che l'endosoma è alterato, il farmaco può essere rilasciato nel citoplasma e diffondere verso le sedi bersaglio nel citoplasma, nei mitocondri o nel nucleo. In questo saggio, i globuli rossi vengono utilizzati come modello della membrana endosomiale a pH fisiologico.I veicoli di somministrazione ideali rimarranno stabili e non altereranno la membrana dei globuli rossi. Tuttavia, al diminuire del pH, il veicolo di somministrazione diventerà instabile, determinando interazioni idrofobiche che distruggono la membrana dei globuli rossi, liberando l'emoglobina. L'emoglobina può quindi essere isolata dai globuli rossi e quantificata spettrofotometricamente mediante assorbanza a 405, 450 o 541 nanometri.Valori più elevati di assorbanza corrisponderanno a un comportamento endolitico più potente. Questo può essere visualizzato mediante microscopia a intervalli a pH fisiologico. I globuli rossi rimangono stabili in presenza del veicolo farmacologico.Tuttavia, a un pH più basso caratteristico del percorso endosomale, i veicoli di consegna alterano e distruggono rapidamente le membrane dei globuli rossi. I materiali necessari per questo studio includono cloruro di sodio 150 millimolare, preparato con 500 millilitri di acqua deionizzata e 4,383 grammi di cloruro di sodio sterilizzato mediante filtrazione a vuoto con un apparato di filtrazione su bottiglia. Successivamente, soluzioni di salina tamponata al fosfato a pH 7,4, 6,8, 6,2 e 5,6 sono state preparate mescolando le opportune quantità di tamponi fosfato monosodico e disodico e sterilizzate mediante filtrazione a vuoto con un apparato di filtrazione su bottiglia.Il pH è stato monitorato con un pHmetro e/o strisce per pH, utilizzando diversi metodi per garantire l'accuratezza delle misurazioni. Il 20% di Triton X è stato preparato sciogliendo 20 millilitri di Triton X-102 in 80 millilitri di acqua nano pura, agitando vigorosamente e sonicando per favorire la dissoluzione, dopo l'approvazione del comitato etico. Chiedere all'infermiere dello studio o al flemobotomista di prelevare 25 millilitri di sangue intero da un donatore anonimo in contenitori sottovuoto rivestiti con EDTA potassico per prevenire la coagulazione.In questo video viene utilizzato un ago per il prelievo di calibro 20,5 collegato a un adattatore per provette vuotate. Il sangue raccolto viene centrifugato a 500 ×g per cinque minuti. Al termine della centrifugazione, dovrebbero risultare evidenti lo strato di plasma e lo strato di globuli rossi.Attenzione a non agitare i livelli con movimenti di agitazione. Segnare i livelli del plasma, quindi aspirare delicatamente con una micropipetta o un aspiratore a vuoto e smaltire nell'ipoclorito di sodio. Sostituire il plasma con cloruro di sodio 150 millimolare fino alla linea segnata.Chiudere la provetta e capovolgerla più volte per mescolare delicatamente; quindi centrifugare per la seconda volta a 500 G per cinque minuti, seguita dall'aspirazione del sopranatante. Sostituire il sopranatante fino alla linea segnata con cloruro di sodio 150 millimolare e capovolgere più volte per mescolare delicatamente; quindi centrifugare per la terza volta a 500 G per cinque minuti. Aspirare il sopranatante e sostituirlo fino alla linea segnata con PBS a pH 7,4.Distribuire equamente il campione di sangue in quattro provette, una per ciascun valore di pH da testare, inclusi il pH fisiologico di 7,4, il pH degli endosomi precoci di 6,8, il pH degli endosomi tardivi di 6,2 e il pH degli endosomi tardivi o lisosomiale di 5,8. Ripetere la centrifugazione per la quarta e ultima volta a 500 G per cinque minuti.Segnare i livelli del supernatante ed aspirare delicatamente, smaltendo il supernatante nell'ipoclorito di sodio. Sostituire il supernatante con PBS del pH appropriato. Le soluzioni finali di globuli rossi si preparano diluendo le soluzioni stock di 50 volte in un tampone del pH appropriato.In questo caso, un millilitro di globuli rossi concentrati è stato aggiunto a 49 millilitri di PBS; capovolgere delicatamente il flacone diverse volte per mescolare i globuli rossi prima della preparazione del sangue. Preparare soluzioni stock dei veicoli di somministrazione a una concentrazione 20 volte superiore. Per i polimeri, suggeriamo 2100 e 800 microgrammi per millilitro come concentrazioni iniziali di prova; una volta diluite, la concentrazione finale sarà di 105 e 40 microgrammi per millilitro. Per l'incubazione, utilizzare piastre con fondo conico o rotondo in modo che i globuli rossi integri possano essere rimossi mediante centrifugazione. Pipettare 10 microlitri di soluzione polimerica 20 volte concentrata in ogni pozzetto.Si consiglia di eseguire i campioni in almeno triplicato o quadruplicato per ottimizzare i risultati. Il Triton X lisierà tutte le cellule e può essere utilizzato come controllo positivo a una concentrazione finale dell'1%. Il PBS a pH 7,4 può essere utilizzato come controllo negativo. Pipettare 190 microlitri di eritrociti diluiti in ogni pozzetto, assicurandosi che la soluzione di eritrociti rimanga omogenea, il che potrebbe richiedere un leggero agitazione o mescolamento per mantenerli in sospensione.Si noti che una volta aggiunti i globuli rossi, si potrebbe già osservare l'inizio della lisi per composti estremamente emolitici. Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius per consentire la lisi dopo un'ora. Rimuovere le piastre per la centrifugazione e centrifugare le piastre a 500 G per formare il pellet dei globuli rossi.Quindi trasferire con attenzione 100 microlitri del sopranatante in una piastra piatta da 96 pozzetti. È fondamentale non disturbare il pellet di globuli rossi, quindi assicurarsi di maneggiare con cura. Misurare l'assorbanza di ogni pozzetto con un lettore di piastre a 450 nanometri.Se l'emoglobina è troppo concentrata e si ottengono letture di ASSORBENZA elevate, le piastre possono anche essere lette a 541 nanometri. In alternativa, se l'emoglobina è troppo diluita e si ottengono letture di assorbenza basse, le piastre possono essere lette a 405 nanometri per massimizzare l'assorbenza. Per analizzare i dati, la percentuale di emolisi può essere calcolata assumendo che il PBS non lisi alcun globulo rosso e che il Triton X lisi il 100% dei globuli rossi.L'equazione mostrata fornirà la percentuale di omolisi per ogni campione. Software come Microsoft Excel possono essere utilizzati per analizzare rapidamente esperimenti provenienti da centinaia di pozzetti. Di seguito sono riportati risultati rappresentativi a diverse concentrazioni nei range di pH discussi.Questa formulazione mostra una risposta ideale al pH e non dimostra attività emolitica a pH fisiologico, ma presenta un comportamento simile a un interruttore a pH endosomiale che provoca un significativo danneggiamento della membrana, come indicato dalla freccia rossa. Avete appena guardato il video del nostro laboratorio che descrive il saggio di emolisi dei globuli rossi dipendente dal pH. Si tratta di un saggio relativamente economico, di facile utilizzo e ad alto rendimento, che può essere impiegato per analizzare librerie combinatorie di serie di polimeri progettati per il rilascio biologico di farmaci con attività litica.Abbiamo riscontrato che questo saggio è altamente predittivo per il rilascio citosolico e l'attività biologica di una vasta gamma di prodotti biotecnologici, inclusi proteine, peptidi e acidi nucleici. Tuttavia, va menzionato che esistono alcune potenziali limitazioni di questo saggio. Si ritiene che sia uno strumento predittivo adeguato per polimeri o peptidi che effettivamente alterano fisicamente la membrana endosomiale.Tuttavia, non è uno strumento predittivo adeguato per polimeri o altri sistemi che agiscono mediante un meccanismo basato sull'effetto spugna protonica. Inoltre, si deve considerare che la composizione del bilayer lipidico dei globuli rossi non riproduce esattamente quella delle membrane endosomiali o lisosomiali. Per quanto riguarda la composizione lipidica e il contenuto di colesterolo, si deve sempre essere pronti a effettuare ulteriori verifiche.Qualsiasi risultato di emolisi dei globuli rossi deve essere confermato con tecniche e saggi complementari. Ad esempio, la microscopia fluorescente utilizzata in combinazione con coloranti endosomiali o lisosomiali può essere impiegata in studi di codistribuzione per visualizzare l'uscita dei farmaci biologici dai percorsi endolisosomiali. Inoltre, la misurazione dell'attività biologica o degli effetti a valle del farmaco o del biologico somministrato dovrebbe sempre rappresentare il passaggio finale.Infine, ricordarsi di manipolare e smaltire sempre correttamente i rifiuti biologici pericolosi secondo le norme definite dalla propria istituzione. Questo conclude il nostro video. Buona fortuna nei vostri esperimenti.

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