Name: Un ortotopico cancro della vescica Modello di Gene Studi di consegna (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-01T22:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Scopri un modello ortotopico di cancro della vescica in topi mediante impianto di cellule MB49 e consegna di geni adenovirali. Questo metodo permette di valutare terapie antitumorali precliniche con saggi luciferasi.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R21 CA143505 a Christina Voelkel-Johnson.

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati esaminati e sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso la Medical University of South Carolina. Il protocollo è stato approvato in base USDA categoria D per il dolore. 1. Impianto cellulare <ol><li> Due giorni prima di eseguire la procedura, piatto 1 x 10 6 MB49 cellule in T-25 palloni. Utilizzare alta DMEM glucosio supplementato con 10% FBS (e antibiotici, se lo si desidera). Una beuta è sufficiente per ciascun gruppo di fino a cinque topi che verrà anestetizzato e impiantato in parallelo. </li><li> Il giorno della procedura, preparare tripsina per instillazione diluendo sterile 0,25% tessuto coltura grado tripsina allo 0,125% con terreno base DMEM sterile (diluizione 1:2). 1,2 ml è sufficiente per 10 topi. Mettere in bagnomaria a 37 ° C per equilibrare. </li><li> Preriscaldare una piastra elettrica e posizionarlo sotto le nosecones del sistema di anestesia che verranno utilizzati per fornire isoflurane. Posizionare un tampone assorbente pulito sopra il pad di riscaldamento. </li><li> Topi posto nella camera di induzione del sistema di anestesia e indurre anestesia con isoflurano 3%. Quando i topi hanno perso la coscienza, che è verificata la perdita del riflesso toe-pinch, trasferirli ai nosecones. Assicurarsi che ogni animale è in posizione supina e correttamente posizionato sulla piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea. </li><li> Ridurre la concentrazione di isoflurano al 2% per mantenere l&#39;anestesia. </li><li> Applicare una pomata oftalmica per entrambi gli occhi per evitare l&#39;essiccazione. </li><li> Passaggio facoltativo: Eliminare i peli addominali. Parrucchieri sull&#39;addome inferiore deve essere rimossa se ​​verrà effettuata in vivo bioluminescente imaging. <ol><li> Applicare uno strato abbondante di crema depilatoria, come Veet, al più basso 1 in piazza della pelliccia sull&#39;addome, facendo attenzione a non contattare i genitali esterni. Attendere 3 min. </li><li> Rimuovere i capelli strofinando la zona con una spugna asciutta, e quindi utilizzare una spugna umida per pulire la pelle. Ripetere una volta, se necessario. </li></ol></li><li> Cateterizzare la vescica <ol><li> Lubrificare un nuovo, sterile 24 G catetere venoso pediatrica con un gel lubrificante non irritante come KY. Rimuovere e gettare l&#39;ago. Se fuoriuscita di fluido intorno al catetere è un problema comune, vale a dire. si verifica più frequentemente che in una delle dieci topi, cateteri diametro maggiore (20 g) possono essere utilizzati. Questo può essere una considerazione importante in topi di età superiore a 8 settimane. </li><li> Tenendo il fulcro del catetere, utilizzare il pollice e l&#39;indice della mano opposta a diffondere le zampe posteriori del mouse ed esporre il meato uretrale. Inserire delicatamente il catetere nell&#39;uretra con un angolo di 45 °, modificando l&#39;angolo di una parallela con il banco per inserirlo completamente. </li><li> Dopo inserimento completo, sollevare il catetere delicatamente, mantenendolo parallelo al banco, e confermare visivamente che viene inserito nell&#39;uretra e non la vagina, che è al di sotto di esso. Se posizionato correttamente, il catetere potrà essereserisce pienamente poiché la vagina è più corta della uretra. </li><li> Ridurre la concentrazione di isoflurano al 1%. </li></ol></li><li> Attaccare una punta di una pipetta P200 e rimuovere urina dalla vescica applicando aspirazione all&#39;estremità esterna del catetere. Rimuovere eventuali residui di urina dal mozzo del catetere. Eliminare l&#39;urina e lasciare catetere. </li><li> Pipetta con cautela 80 ml soluzione di tripsina 0,125% nel mozzo del catetere, evitando bolle d&#39;aria. Attaccare una siringa piena d&#39;aria 1 ml di raccordo del catetere e lentamente spingere il pistone 0,1-0,2 ml per consegnare la tripsina nella vescica. </li><li> Lasciare la siringa e gruppo catetere in posizione per 15 min. Ripetere i passaggi 1,8-1,11 per qualsiasi rimanenti topi anestetizzati (fino a 4). Procedere con il passaggio successivo durante il periodo di attesa. SUGGERIMENTO: Inizialmente può essere utile avere qualcuno a preparare le cellule (passo 1.12). </li><li> Preparare le cellule MB49 per l&#39;impianto. Le cellule sono state piastrate a 1 x 10 6 per T-25 pallone 48 ore prima dell&#39;impianto (punto 1.1). <ol><li> Rimuovere i supporti e aggiungere 500 ml di 0,25% tripsina al pallone. Quando le cellule si staccano aggiungere 5 ml di DMEM completo di riattivare le cellule. Rimuovere una aliquota di 50 microlitri di contare, e centrifugare il resto a 1.000 rpm per 5 min. Durante la fase di centrifugazione continuare a passi 1.12.2 e 1.12.3. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Calcolare le cellule / ml. Quindi calcolare il volume necessario per portare il pellet cellulare a 4 x 10 6 cellule / ml (2 x 10 5 cellule per 50 microlitri). </li><li> Versare il surnatante dalle cellule centrifugate e risospendere il pellet in terreno di base DMEM con il volume richiesto di sospendere le cellule a 4 x 10 6 cellule / ml (come calcolato al punto 1.12.2). Mantenere le cellule a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Quando viene raggiunto il punto di tempo di 15 min per trattamento con tripsina di vesciche, staccare la siringa piena d&#39;aria dal catetere lasciando il catetere in posizione. Tripsina speso sarà normalely rifluire attraverso il catetere. Rimuovere eventuali tripsina rimanente dalla vescica mediante aspirazione con la pipetta P200 come al punto 1.9 e scartare. </li><li> Pipettare immediatamente 50 ml di sospensione cellulare MB49 nel mozzo del catetere. Attaccare la siringa piena d&#39;aria 1 ml al mozzo del catetere e fornire le cellule alla vescica lentamente lo stantuffo 0,1-0,2 ml. Ripetere questa operazione fino a quattro volte supplementari per impiantare tutti e cinque i topi. Eliminare le celle inutilizzate. </li><li> Lasciando il gruppo catetere-siringa in loco, permettono alle cellule di abitare nella vescica per 50 min. </li><li> Prelevare delicatamente il gruppo catetere-siringa dall&#39;uretra. Girare la concentrazione di isoflurano a zero e spostare ogni mouse di un centimetro o due di distanza dal musetto di recuperare sul pad di riscaldamento. </li><li> Quando un topo ha riacquistato il suo riflesso di raddrizzamento, tornare alla sua gabbia. </li></ol> 2. Consegna intravescicale di Adenovirus (8 giorni dopo l&#39;impianto di cellule) </p&gt; ATTENZIONE: Questa parte del protocollo utilizza adenovirus, che è un agente infettivo e deve essere maneggiato secondo le linee guida BSL2 severe (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/). Tutte le procedure eseguite con agenti infettivi sono stati approvati dal Comitato di Biosicurezza istituzionale della Medical University of South Carolina. <ol><li> Otto giorni dopo l&#39;impianto di topi con cellule di MB49, verificare la presenza di ematuria. Pick up singoli animali su un pezzo di carta assorbente e premere delicatamente sul ventre per cancellare gocce di urina sulla carta. Urina che è rosa al rosso indica ematuria ed è un segno che i tumori hanno stabilito. Tasso di tumore è almeno 80% e con eccellente tecnica può essere fino al 100%. </li><li> Scongelare adenoviral azione sul ghiaccio e diluire a 10 9 PFU/50 microlitri (2 x 10 10 PFU / ml) in sterile, a temperatura ambiente PBS. </li><li> Anestetizzare topi come descritto ai punti 1.3-1.6 sopra. </li><li> Cateterizzarla topi come descritto ai punti 1.8 e rimuovere urina come al punto 1.9 </li><li> Dopo urina viene rimosso, pipettare immediatamente 50 ml di sospensione di virus nel mozzo del catetere. Attaccare la siringa piena d&#39;aria 1 ml al mozzo del catetere e consegnare il virus alla vescica lentamente lo stantuffo 0,1-0,2 ml. </li><li> Lasciando il gruppo catetere-siringa in loco, permettono al virus di abitare nella vescica per 40 min. </li><li> Prelevare delicatamente il gruppo catetere-siringa dall&#39;uretra, e gettare nella soluzione di candeggina al 10% per inattivare i virus rimanente. </li><li> Girare la concentrazione di isoflurano a zero e spostare ogni mouse di un centimetro o due di distanza dal musetto di recuperare sul pad di riscaldamento. </li><li> Quando un topo ha riacquistato il suo riflesso di raddrizzamento, tornare alla sua gabbia. </li><li> Segna gabbie per indicare che i topi sono stati instillato con adenovirus. Virus sarà versato nel letto dei gabbia per diversi giorni e tutte le gabbie e biancheria da letto deve esseremanipolati e disinfettati adeguatamente. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

La metodologia primario descritto in questo protocollo è cateterizzazione di vesciche topo, che ha applicazioni di massima per instillazione di cellule o di qualsiasi agente destinati per il recapito locale all&#39;epitelio vescicale. Il protocollo specifica di cui sopra è stato ottimizzato per studi a breve termine (~ 10 giorni). Impiantare il numero esatto delle cellule è fondamentale, dal momento che un elevato numero di cellule si tradurrà in più rapida crescita del tumore e possibile perdita di animali a causa dell...

Il cancro della vescica è il secondo tumore più comune del tratto urogenitale con circa 75.000 nuovi casi e 15.000 decessi attesi nel 2012 1. Alti tassi di recidiva richiedono follow-up permanente, che rende il cancro della vescica uno dei tumori più costoso da trattare. Cancro della vescica che ha invaso lo strato muscolare può metastatizzare fegato, polmone o osso attraverso il sistema linfatico. La terapia multimodale dei tumori avanzati risultati solo nel 20-40% di sopravvivenza dopo 5 anni. Pertanto, sono urgentemente necessarie strategie di trattamento efficaci volti a ridurre la recidiva e la progressione del tumore superficiale della vescica, nonché a migliorare il risultato terapeutico nei pazienti con malattia avanzata. Sviluppo di nuove terapie richiede modelli preclinici per valutare l&#39;efficacia seguente valutazione iniziale in vitro. Il microambiente tumorale può influenzare significativamente lo sviluppo del cancro e la risposta, che evidenzia la necessità di preclinicoAL modelli in cui i tumori si presentano o possono essere stabiliti nell&#39;organo di origine. Un approccio è lo sviluppo di modelli transgenici in cui i tumori sorgono spontaneamente o possono essere indotte in maniera organo-specifica. Un protocollo ottimo di un modello di cancro della vescica transgenico è stato recentemente pubblicato 2. Lo svantaggio di modelli transgenici è che i tumori tendono a svilupparsi lentamente e con meno uniformità di quanto desiderato. Inoltre, il costo di mantenimento di una colonia di riproduzione deve essere considerato. Un&#39;alternativa ai modelli transgenici è impianto ortotopico di cellule tumorali, che ha il vantaggio di tempi brevi per lo stabilimento del tumore nei topi disponibili in commercio. Mentre alcune linee cellulari di cancro della vescica umane possono essere coltivate ortotopicamente (abbiamo utilizzato con successo UM-UC-3), può essere auspicabile stabilire tumori in topi immunocompetenti. Due linee di cellule di cancro alla vescica murini, che crescono ortotopicamente sono MBT-2 e MB49 3. Poiché MBT-2 celle sono contaminati da replicaretipo C retrovirus 4, abbiamo scelto MB49 celle per i nostri studi. È importante notare che MB49 cellule sono state isolate da un topo maschio e implantologia ortotopiche sono per ragioni anatomiche eseguite nei topi femmina. Questo ha il vantaggio di una facile identificazione delle cellule impiantate mediante marcatori del cromosoma Y, ma il disadattamento genere può essere uno svantaggio per studi immunologici. L&#39;epitelio vescicale è fiancheggiato da un glicosaminoglicani (GAG) strato, che funziona come una barriera per l&#39;infezione da microrganismi. Questa barriera può anche interferire con impianto di cellule tumorali e diversi metodi sono stati sviluppati per superare questa difficoltà (Tabella 1). Elettrocauterizzazione è stato ampiamente utilizzato come un mezzo fisico di perturbare lo strato di GAG 5-13 e dimostrando elettrobisturi protocollo è stato recentemente pubblicato in JoVE 14. Tuttavia, se una unità elettrocauterizzazione non essere disponibile, mezzi chimici per distruggere il GAG strato come il nitrato di argento o poli-L-lisina può essere utilizzato anche 15-24. I tumori sono stabiliti efficacemente da una breve esposizione della vescica di un piccolo volume di nitrato d&#39;argento (5-10 microlitri, 0,15-1,0 M, ~ 10 sec) o contatto prolungato con poli-L-lisina (100 pl di 0,1 mg / ml per 20 min) (Tabella 1). Qui si descrive un metodo che utilizza tripsina per facilitare l&#39;impianto di MB49 cellule. Nel tentativo di migliorare gli approcci terapeutici per il cancro della vescica, la terapia genica ha raccolto notevole attenzione. Da un punto di vista clinico, cancro della vescica è un bersaglio ideale per la terapia genica a causa di facile accessibilità dell&#39;organo e la capacità di fornire localmente il carico utile. Vettori virali che sono stati esplorati per la terapia genica del cancro della vescica includono una oncolytic virus herpes simplex 25, 26 retrovirus, virus del canarino 27, virus vaccinico, AAV, e adenovirus 28. Nella seconda parte del nostro protocollo, si descrive un metodo per la consegna virale che è praticamente identico a instillazione delle cellule tumorali. Di interesse nel nostro laboratorio è lo sviluppo di nuovi approcci alla consegna del gene, che valutiamo tramite bioluminescenza utilizzando un vettore adenovirale che esprime un transgene luciferasi. Tuttavia, la metodologia di cateterismo vescicale può essere utilizzato per la consegna di vari agenti e quindi ha vasta applicabilità.

<table><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Topi femmina di 6-8 settimane </td><td>Jackson Laboratories</td><td>Nome ceppo: C57BL/6J Numero di stock: 000664</td><td> < </td></tr><tr><td> p>Tripsina* </td><td>MediaTech</td><td>MT25-053-CI</td><td> Ottenuto tramite Fisher </td></tr><tr><td> DMEM* </td><td>MediaTech</td><td>MT10-017-CV <</td><td>p>Ottenuto tramite Fisher </td></tr><tr><td> FBS </td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td> Inattivato a caldo </td></tr><tr><td> T25 matracchette* </td><td>Corning Costar</td><td>Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63</td><td> Ottenuto tramite Fisher </td></tr><tr><td> MB49 cellule </td><td>N/A</td><td>N/A</td><td> Ottenuto dal Dr. Boehle (vedi riferimento11) </td></tr><tr><td> Puralube Vet Unguento* </td><td>Pharmaderm</td><td>Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869</td><td> Ottenuto tramite Fisher < </td></tr><tr><td> p>Crema depilatoria: Veet </td><td>farmacia locale</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Lubrificante: K-Y Jelly </td><td>farmacia locale</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Cateteri* </td><td>Exel International</td><td>Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21</td><td> Ottenuto tramite Fisher </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td>Terrell</td><td>NDC 66794-011-25</td><td> Ottenuto tramite farmacia ospedaliera </td></tr><tr><td> 1 ml siringhe TB con punta a scorrimento </td><td>Becton Dickinson</td><td>BD309659 Fisher:14-823-434</td><td> </td></tr><tr><td> D-Luciferina </td><td>Biotecnologie dell'oro</td><td>L-123-1</td><td> </td></tr><tr><td> Ad-CMV-Luc </td><td>VectorBiolabs</td><td>1000; Richiedi amplificazione e purificazione di CsCl su larga scala per in vivo uso</td><td> Agente infettivo che richiede il contenimento di BSL2 </td></tr><tr><td> Steady-Glo&nbsp; Sistema di dosaggio della luciferasi </td><td>Promega</td><td>E2510 (10 ml), E2520 (100 ml) o E2550 (10 x 100 ml)</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">*disponibile presso diversi fornitori</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td> Sistema per anestesia </td><td>E-Z Systems, Euthanex Corporation</td><td>Sistema per anestesia: EZ7000 5 porte dispositivo di respirazione del mouse: EZ109</td><td> Ottenuto tramite Fisher </td></tr><tr><td> Xenogen IVIS 200 </td><td>Caliper Life Sciences</td><td>http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm</td><td> </td></tr><tr><td> FLUOstar Optima </td><td>BMG Labtech</td><td>http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2</td><td> </td></tr></tbody></table>

un ortotopico cancro della vescica modello di gene studi di consegna

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Il cancro della vescica è il secondo tumore più comune del tratto urogenitale e nuovi approcci terapeutici che possono ridurre la recidiva e la progressione sono necessari. Il microambiente tumorale può influenzare significativamente lo sviluppo tumorale e risposta alla terapia. È pertanto spesso desiderabile crescere le cellule tumorali nell&#39;organo da cui sono derivati. Questo protocollo descrive un modello ortotopico di cancro della vescica, in cui murine cellule di carcinoma della vescica MB49 sono instillato nella vescica tramite cateterizzazione. Impianto di cellule tumorali successo in questo modello richiede interruzioni dello strato protettivo glicosaminoglicani, che può essere effettuata con mezzi fisici o chimici. Nel nostro protocollo vescica viene trattata con tripsina prima dell&#39;instillazione cella. Cateterizzazione della vescica può anche essere usati per fornire terapie una volta che i tumori sono stabiliti. Questo protocollo descrive la consegna di un costrutto adenovirale che esprime un gene reporter luciferasi. Mentre oprotocollo ur è stato ottimizzato per studi a breve termine e si concentra sulla consegna del gene, la metodologia di topo cateterismo vescicale ha vaste applicazioni.

Ematuria è osservato in quasi tutti i topi entro 8 giorni dopo l&#39;impianto di 200.000 MB49 cellule. Come mostrato in Figura 1, peso vescica è più del doppio di 34,7 ± 3,3 mg (range 31-37 mg, n = 4) in topi non tumorali cuscinetto a 87,5 ± 19,2 mg (range 77-120 mg, n = 10) in topi che sono stati impiantati con MB49 cellule. In termini di consegna del gene, abbiamo trovato che l&#39;imaging topi 24 ore dopo l&#39;instillazione virale produce un segnale più forte dopo 48 ore (Figura 2)....

Impianto di cellule tumorali nell&#39;organo di origine può servire come un modello preclinico utile per valutare nuove terapie. Cellule di carcinoma della vescica MB49 possono essere coltivate all&#39;interno della vescica seguente instillazione intravescicale. Questo protocollo dimostra cateterizzazione della vescica topo a scopo di impianto tumorale e consegna adenovirale.

Un ortotopico cancro della vescica Modello di Gene Studi di consegna

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre in modo costante e rapido tumori nelle vesciche dei topi, che possono quindi essere utilizzati per testare terapie contro il cancro della vescica. Questo risultato si ottiene innanzitutto instillando cellule tumorali nelle vesciche dei topi mediante cateterizzazione. Otto giorni dopo, la cateterizzazione viene ripetuta per instillare un adenovirus che esprime un gene reporter luciferasi.Quindi, 24 ore dopo, l'espressione genica virale viene misurata mediante un saggio di luciferasi. Si ottengono risultati che mostrano le condizioni in cui può essere raggiunta un'espressione genica ottimale. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale perché le fasi di cateterizzazione e di instillazione sono difficili da apprendere e perché esiste il rischio di danneggiare la vescica e/o provocare perdite del materiale instillato.Due giorni prima di eseguire l'impianto cellulare in fiaschi T25, seminare un milione di cellule MB49 in DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con FBS al 10% nel giorno della procedura. Preparare la tripsina per l'uso diluendo in mezzo basale DMEM la tripsina sterile al 0,25% di grado per colture cellulari. Collocare la soluzione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per l'equilibrazione, preriscaldare una piastra riscaldante e posizionarla sotto i coni nasali del sistema di anestesia che verrà utilizzato per somministrare l'isoflurano.Posizionare un tampone assorbente pulito sopra il termoconvettore dopo aver anestetizzato i topi con isoflurano al 3%. Eseguire una compressione del dito del piede per verificare il livello di sedazione. Posizionarli in posizione supina sul termoconvettore e applicare un cono nasale con isoflurano al 2%.Utilizzare un gel lubrificante non irritante per lubrificare un nuovo catetere venoso pediatrico sterile da 20 G 4. Rimuovere quindi e gettare l'ago tenendo il connettore del catetere. Utilizzare il pollice e l'indice dell'altra mano per separare le zampe posteriori del topo ed esporre la mucosa uretrale.Inserire delicatamente il catetere nell'uretra con un angolo di 45 gradi, modificando successivamente l'angolo in modo da renderlo parallelo al piano del bancone per completare l'inserimento. Sollevare con delicatezza il catetere mantenendolo parallelo al bancone e verificare visivamente che sia posizionato nell'uretra e non nella vagina, che si trova al di sotto. Ripetere l'operazione con i restanti topi anestetizzati.Quindi ridurre la concentrazione di isoflurano al 1%. Applicare una punta a una pipetta P200 ed estrarre l'urina dalla vescica applicando aspirazione all'estremità esterna del catetere. Rimuovere qualsiasi urina residua dal connettore del catetere, quindi scartare l'urina e lasciare il catetere in posizione. Pipettare con attenzione 80 microlitri della soluzione di trips calda nel connettore del catetere, evitando bolle d'aria.Collegare una siringa da un CC piena d'aria al connettore del catetere e premere lentamente lo stantuffo. Iniettare da 0,1 a 0,2 cc per somministrare la tripsina nella vescica. Lasciare la siringa e il catetere in posizione per 15 minuti.Per preparare le cellule per l'impianto, rimuovere il mezzo dalle cellule MB 49 precedentemente seminate e aggiungere 500 microlitri di tripsina 0,25% al flacone. Quando le cellule si staccano, aggiungere cinque millilitri di DMEM completo per risospendere le cellule, prelevare un'aliquote di 50 microlitri per il conteggio e centrifugare il resto a 1000 giri/min per cinque minuti mentre le cellule sono in rotazione.Utilizzare un emocitometro per contare le cellule e calcolare il numero di cellule per millilitro, nonché il volume di mezzo necessario per portare il pellet cellulare a quattro volte 10 alla sei cellule per litro. Versare via il sopranatante dalle cellule centrifugate e risospendere. Sospendere il pellet in mezzo base DMEM.Mantenere le cellule a temperatura ambiente. Dopo il trattamento con tripsina di 15 minuti, staccare la siringa dal catetere lasciando il catetere in posizione. Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere per aspirazione qualsiasi residuo di tripsina dalla vescica e smaltire immediatamente. Pipettare 50 microlitri di sospensione cellulare MB49 nel connettore del catetere.Quindi collegare una siringa da 1 cc riempita con aria all'estremità del catetere ed erogare lentamente le cellule nella vescica premendo il pistone. 0,1-0,2 cc. Lasciare l'insieme catetere-siringa in posizione.Lasciare le cellule a contatto con la vescica per 50 minuti. Successivamente, rimuovere delicatamente l'assemblaggio catetere-siringa dall'uretra. Ridurre l'isoflurano allo 0% e permettere ai topi di riprendersi dall'anestesia sul tappetino riscaldante.Quando un topo ha recuperato il riflesso di scrittura, riporlo nella sua gabbia. Attenzione: questo protocollo utilizza l'adenovirus, che è un agente infettivo e deve essere manipolato seguendo rigorose linee guida di biosicurezza di livello due. Tutte le procedure eseguite con agenti infettivi sono state approvate dal Comitato istituzionale per la biosicurezza dell'Università Medica della Carolina del Sud.Otto giorni dopo l'impianto delle cellule MB 49 nei topi, verificare l'ematuria posizionando singoli animali sopra un foglio bianco di carta assorbente e premendo delicatamente sull'addome per far cadere gocce di urina sulla carta. L'urina di colore rosa fino al rosso indica ematuria ed è un segno che i tumori si sono stabiliti; scongelare la scorta di adenovirus sul ghiaccio e utilizzare PBS sterile a temperatura ambiente per diluirla a 10, nove pfu per 50 microlitri. Dopo aver anestetizzato e cateterizzato i topi e aver rimosso l'urina come descritto in precedenza in questo video, pipettare immediatamente 50 microlitri di sospensione virale nel connettore del catetere, quindi collegare una siringa piena d'aria e premere lo stantuffo per somministrare il virus alla vescica. Lasciare in sede l'assemblaggio catetere-siringa per permettere al virus di permanere nella vescica per 40 minuti.Quindi ritirare delicatamente l'assemblaggio catetere-siringa dall'uretra e smaltirlo in una soluzione di candeggina al 10% per inattivare qualsiasi virus residuo. Consentire al topo di riprendersi dall'anestesia prima di riposizionarlo nella gabbia; contrassegnare le gabbie per indicare che i topi sono stati inoculati con adenovirus, poiché il virus verrà espulso nella lettiera della gabbia per diversi giorni e tutte le gabbie con lettiera dovranno essere maneggiate e disinfettate in modo appropriato. Ematuria viene osservata in quasi tutti i topi entro otto giorni dall'impianto di 200.000 cellule MB 49, come mostrato qui.Il peso della vescica raddoppia più che altro, passando da 34,7 più o meno 3,3 milligrammi nei topi senza tumore a 87,5 più o meno 19,2 milligrammi nei topi impiantati con cellule MB 49. Per quanto riguarda il trasferimento genico, l’imaging dei topi eseguito 24 ore dopo l’installazione virale produce un segnale più intenso rispetto a quello ottenuto dopo 48 ore. Il trasferimento adenovirale presenta una variabilità elevata tra gli animali, aspetto da considerare attentamente nella pianificazione della dimensione dei gruppi ai fini statistici.Se non è disponibile un sistema di imaging per piccoli animali, un approccio alternativo per misurare l'espressione del transgene della luciferasi consiste nel rimuovere e omogeneizzare la vescica per un'analisi in vitro, come dimostrato qui. Il confronto tra l'analisi in vivo mediante il sistema per piccoli animali IVIS 200 e l'analisi in vitro mediante il kit a luminescenza stabile indica un'eccellente correlazione tra i set di dati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come cateterizzare la vescica di un topo e instillare cellule tumorali o agenti terapeutici.

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