Name: Neonatale Elettroporazione zona subventricolare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Impara l'elettroporazione neonatale della zona subventricolare per manipolare geneticamente le cellule staminali neurali nei cuccioli. Questo metodo rapido ed economico consente di studiare la neurogenesi e i meccanismi molecolari della proliferazione cellulare.

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Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del Dipartimento della Difesa (sviluppo premio Idea, W81XWH-10-1-0041, AB), CT cellule staminali di assegnazione (AB), e di un Istituto Nazionale della Salute NRSA 10668225 (DMF). Il materiale presente è basato sul lavoro in parte sostenuto da parte dello Stato del Connecticut sotto la ricerca sulle cellule staminali Connecticut programma di sovvenzioni. I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali dello Stato del Connecticut, del Dipartimento di Sanità Pubblica dello Stato del Connecticut o TC Innovations, Inc. I finanziatori avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta dei dati e l&#39;analisi, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

Questa procedura è in conformità con i requisiti IACUC Yale. Gli scienziati dovrebbero fare in modo che le linee guida IACUC sono approvati e seguiti secondo le proprie esigenze istituzionali. 1. Sezione 1. Preparazione di Pipette DNA, soluzioni, e vetro <ol><li> Generazione di elevata purezza (OD 260/280&gt; 1,80) ad alta concentrazione (mg / ul&gt; 2.5) privo di endotossine DNA. </li><li> Preparare soluzione fisiologica 0,9% e filtro sterile attraverso un filtro 22 micron. </li><li> Posto 10 centimetri tubi di fuoco lucido vetro borosilicato capillari (OD: 1,5 mm, ID: 1.10 mm) in un modello PP-830 Narishige PC-10 estrattore pipetta di vetro con un filo kanthal. Impostare estrattore ad un pull un passo ponderato a 70.5 ° C. Rompere le punte con pinza circolari e ispezionare sotto un microscopio da dissezione per i bordi frastagliati. Punte coniche e posto sotto una lampada UV per 15 minuti. Pipette tirato devono essere marcati a 2 mm dal bordo della punta. </li><li> Preparare 0,1% peso / volume soluzione molto veloce verdedalla miscelazione sterile filtrata soluzione salina allo 0,9% a secco verde veloce. </li></ol> 2. Sezione 2. Preparazione degli animali, pipetta di vetro di caricamento e iniezione Plasmid <ol><li> Rimuovere giorno postnatale 0-1 cuccioli individualmente dalle gabbie, posto su un piatto di vetro Petri pre-refrigerato a 4 ° C, e quindi posto in ghiaccio. </li><li> Dopo circa 5 minuti, determinare lo stato di anesthetization utilizzando la risposta pinch piede. Se non si verifica il movimento, cuccioli di soggetti ai iniezione intraventricolare. </li><li> È importante notare che la combinazione di verde veloce, DNA, e soluzione salina può provocare una rapida evaporazione, cristallizzazione, e il blocco di pipette di vetro. Di conseguenza, generare una soluzione di riserva ed aliquota 1-2 microlitri su parafilm immediatamente prima di iniezioni. </li><li> Aspirare l&#39;intero volume aliquotate con la pipetta di vetro tirato. </li><li> Tenere la testa del cucciolo tra il pollice e l&#39;indice della mano meno dominante. </li><li> Accendere una lampadad tenere la testa del cucciolo appena fuori del fascio di luce. Se necessario, mettere salino sulla testa per ridurre la quantità di luce riflessa da pup. I ventricoli dovrebbe essere illuminato. </li><li> Con la mano dominante, inserire l&#39;ago nel ventricolo laterale più vicino a voi (Figura 1A e 1B). Il sito di iniezione deve essere approssimativamente equidistante dalla sutura lambdoidea e occhio e 2 mm lateralmente alla sutura sagittale. Inserire tirato pipetta a volume 2 mm per un cucciolo P0, che dovrebbe garantire una maggiore penetrazione nel ventricolo laterale. Casualmente, è possibile visualizzare il riempimento del liquido cerebrospinale nella pipetta dal rilascio della pressione intracranica. Per ridurre la pressione intracranica, che aiuta a iniezione di plasmide, allentare la presa sulla testa del pup.Step 2.8. Iniettare circa 0,5 l di plasmide nel ventricolo laterale che utilizza l&#39;aria compressa-iniettore (Picospritzer, Parker). </li></ol> 3. Sezione 3. Elettroporazione e recupero <ol><li> Set la tensione del generatore di elettroporazione per 5 impulsi quadrati, 50 msec / impulso a 100 volt, con 950 msec. La specificità spaziale di elettroporazione plasmide è dettata dalla direzionalità del trasferimento di carica. Particolare attenzione dovrebbe essere data al collocamento data l&#39;eterogeneità delle popolazioni di cellule staminali lungo la SVZ 8. Le differenze nei tassi di proliferazione e il destino della cellula sono stati individuati per le posizioni-dorsale e ventrale rostrale-caudale 9,10. </li><li> Una volta che il plasmide viene iniettato, dip elettrodi pinzetta in PBS. Questo passo è quello di massimizzare il trasferimento di carica e per evitare ustioni causate da resistività. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo positivo sulla parete dorsale laterale del cucciolo vicino all&#39;orecchio omolaterale al sito di iniezione plasmide (Figura 1C e 1D). Posizionare l&#39;elettrodo negativo sul laterale dell&#39;emisfero controlaterale ventrale al cucciolo muso. </li><li> Avviare il trasferimento corrente premendo i piedini di impulsistrega pedale e spazzare gli elettrodi da dorsale a laterale che utilizza ~ 25 ° intervalli angolari. </li><li> Posto elettroporata cuccioli su un rilievo di riscaldamento per 5 min. Ruotare delicatamente cuccioli ogni 30 secondi con una lieve stimolazione. </li></ol>

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+methods+to+identify+and+manipulate+newly+born+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 5, 64(2011).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS ONE. 3, e1883(2008).</li>
<li>Chesler, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+gene+expression+by+postnatal+electroporation+during+olfactory+interneuron+nurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis.</a> PloS ONE. 3, e1517(2008).</li>
<li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).</li>
<li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls%3A+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Development. 6, 13(2011).</li>
<li>de Chevigny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-7a+regulation+of+Pax6+controls+spatial+origin+of+forebrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons.</a> Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).</li>
<li>Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+neurogenesis+generates+heterotopias%2C+olfactory+micronodules+and+cortical+infiltration+following+single-cell+Tsc1+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion.</a> Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).</li>
<li>Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+controlled+conditional+knockdown+system+using+the+Tol2+transposon-mediated+technique%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique.</a> PloS ONE. 7, e33380(2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno rivelazioni da fare.

Qui dettaglio la tecnica di elettroporazione neonatale SVZ, una tecnica per etichettare in modo rapido e robusto e manipolare le cellule staminali SVZ e la loro progenie. Ci sono diversi vantaggi che elettroporazione ha rispetto ad altre tecniche. Prima, data l&#39;etichettatura focale di cellule, si è in grado di discernere cellule effetti autonomi e non autonomi cella. In secondo luogo, la manipolazione genetica utilizzando sistemi inducibili permette di confrontare gli effetti prima o dopo l&#39;integrazione sinaptic...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Heavy Tubi lucido borosilicato </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF150-110-10 </td><td></td></tr><tr><td> Doppio-Stage Glass Micropipetta Puller </td><td> Narishige </td><td> PC-10H </td><td></td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Fischer Scientific </td><td> 0521192205 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 Onda quadra generatore di impulsi </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 45-0052 </td><td></td></tr><tr><td> Tweezertrodes </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 45-0488 </td><td></td></tr><tr><td> Fibra ottica Sorgente luminosa </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-562-36 </td><td></td></tr><tr><td> Tungsteno alogenalampada </td><td> USHIO America, Inc </td><td> 1002247 </td><td></td></tr><tr><td> Picospritzer II </td><td> Parker Instruments </td><td> 052-0312-900 </td><td></td></tr></tbody></table>

neonatale elettroporazione zona subventricolare

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Cellule staminali neurali (NSC) linea ventricoli postnatali laterali e danno luogo a diversi tipi cellulari che includono neuroni, astrociti e cellule ependimali 1. La comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della NSC auto-rinnovamento, l&#39;impegno, e la differenziazione è fondamentale per sfruttare il loro potenziale unico per riparare il cervello e capire meglio disturbi del sistema nervoso centrale. Metodi precedenti per la manipolazione dei sistemi di mammifero richiede l&#39;impegno lungo e costoso dell&#39;ingegneria genetica a livello animale intero 2. Così, la maggior parte degli studi hanno esplorato le funzioni di molecole NSC in vitro o in invertebrati. Qui, una dimostrazione della tecnica semplice e rapida per manipolare NPC neonatali che si riferisce a come neonatale zona subventricolare (SVZ) elettroporazione. Tecniche simili sono state sviluppate una decina di anni fa per studiare cellule staminali neurali embrionali e hanno aiutato studi sulla cortica3,4 l di sviluppo. Più di recente questo è stato applicato per studiare il proencefalo roditore postnatale 5-7. Questa tecnica comporta l&#39;etichettatura robusto SVZ cellule staminali neurali e la loro progenie. Così, postnatale SVZ elettroporazione fornisce un costo e un&#39;alternativa tempo efficace per mammiferi ingegneria genetica NSC.

Neonatali subventricolare elettroporazione risultati della zona nella etichettatura di quasi tutti glia radiale contigua alla dorsale, zona dorsale subventricolare laterale e laterale seguendo il movimento &quot;spazzare&quot; dell&#39;elettrodo pinzetta (Figura 1E). Tuttavia, elettroporazione può essere adattato al requisito dell&#39;esperimento rispettivo ma non spazzare l&#39;elettrodo e utilizzando il posizionamento e l&#39;orientamento specifico come dettagliato nel video. Ad esempio, poiché locali...

Dimostriamo una tecnica minimamente invasiva denominata neonatale elettroporazione zona subventricolare. La tecnica consiste nell&#39;iniettare DNA plasmidico nei ventricoli laterali di cuccioli neonati e l&#39;applicazione di corrente elettrica per fornire e manipolare geneticamente le cellule staminali neurali

Neonatale Elettroporazione zona subventricolare

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Lo scopo di questa procedura è quello di marcare e manipolare geneticamente i costituenti molecolari delle cellule staminali neurali della zona subventricolare. Ciò si ottiene inserendo prima una pipetta di vetro carica di DNA nel ventricolo laterale di un P zero P.Il secondo passo consiste nell'espellere il DNA nel liquido cerebrospinale del ventricolo laterale. La corrente successiva viene applicata al P.Ciò consente il trasferimento del DNA alle cellule staminali neurali che rivestono i ventricoli laterali.In definitiva, una combinazione di tecniche molecolari, tra cui l'immunoistochimica, la biologia molecolare, la microscopia e l'elettrofisiologia, viene utilizzata per visualizzare i cambiamenti nel destino, nella proliferazione, nella migrazione e nella maturazione delle cellule staminali neuro della zona subventricolare. L'elettroporazione della zona subventricolare neonatale può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurogenesi, come ad esempio quali percorsi molecolari sono responsabili della regolazione della proliferazione, della differenziazione, della migrazione e della maturazione delle cellule staminali neuronali e della loro progenie. Il vantaggio pr

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