Neonatale Elettroporazione zona subventricolare

Lo scopo di questa procedura è quello di marcare e manipolare geneticamente i costituenti molecolari delle cellule staminali neurali della zona subventricolare. Ciò si ottiene inserendo prima una pipetta di vetro carica di DNA nel ventricolo laterale di un P zero P.Il secondo passo consiste nell'espellere il DNA nel liquido cerebrospinale del ventricolo laterale. La corrente successiva viene applicata al P.Ciò consente il trasferimento del DNA alle cellule staminali neurali che rivestono i ventricoli laterali.

In definitiva, una combinazione di tecniche molecolari, tra cui l'immunoistochimica, la biologia molecolare, la microscopia e l'elettrofisiologia, viene utilizzata per visualizzare i cambiamenti nel destino, nella proliferazione, nella migrazione e nella maturazione delle cellule staminali neuro della zona subventricolare. L'elettroporazione della zona subventricolare neonatale può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurogenesi, come ad esempio quali percorsi molecolari sono responsabili della regolazione della proliferazione, della differenziazione, della migrazione e della maturazione delle cellule staminali neuronali e della loro progenie. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i topi transgenici, è che consente la marcatura rapida e robusta delle cellule staminali neuronali della SVZ in modo efficiente in termini di tempo ed economicità.

Innanzitutto, assicurati che il DNA da elettropurare sia di elevata purezza e concentrazione e sia privo di endotossine. Estrarre i tubi capillari in vetro di silice BO lucidato a fuoco da 10 centimetri nelle pipette. Qui viene utilizzato un estrattore per pipette PP otto da 30 ghhi PC 10 per tirare una trazione ponderata in un solo passaggio a 70,5 gradi Celsius Dopo aver estratto la pipetta, utilizzare una pinza circolare per rompere la punta.

Quindi ispezionare la pipetta al microscopio da dissezione per assicurarsi che non vi siano bordi frastagliati. Se necessario, la punta può essere smussata utilizzando una mola. Quindi posizionare le pipette versate sotto una lampada UV per 15 minuti.

Trascorsi i 15 minuti, contrassegnare la pipetta a due millimetri dal bordo della punta con un pennarello fine. Infine, preparare una soluzione fast green allo 0,1 peso per volume mescolando soluzione fisiologica sterile sterile filtrata allo 0,9% con anestetizzante dry fast green. Un cucciolo di zero a un giorno, una capsula di Petri di vetro pre-raffreddata a quattro gradi Celsius e posta sul ghiaccio occidentale Dopo circa cinque minuti, determinare lo stato di anestesia utilizzando la risposta al pizzicamento del piede.

Se non si verifica alcun movimento, iniziare l'iniezione intraventricolare. Combinare la soluzione fast green con la soluzione di DNA e aliquotare da uno a due microlitri sul biofilm. È importante che ciò avvenga appena prima dell'iniezione, poiché la combinazione di una soluzione verde veloce con il DNA può provocare una rapida evaporazione e cristallizzazione con il successivo blocco delle pipette di vetro, aspirare l'intero volume dell'aliquota con una siringa a microfilm e caricare la pipetta di vetro su un iniettore ad aria compressa.

Ora, afferra e tieni delicatamente la testa del cucciolo tra il pollice e l'indice dell'ultima mano dominante. Quindi accendi la lampada e tieni la testa del cucciolo appena fuori dal raggio di luce. Se i ventricoli non sono chiaramente visibili, inumidire la testa con soluzione fisiologica sterile per ridurre la quantità di luce riflessa dal cuoio capelluto.

Quindi, usando la mano dominante, inserire l'ago nel ventricolo laterale vicino. Il sito di iniezione deve essere approssimativamente equidistante dalla sutura OID e dall'occhio e due millimetri lateralmente alla sutura sagittale. Inserire la pipetta estratta fino al segno di due millimetri per un pop P zero, che dovrebbe garantire la penetrazione nel ventricolo laterale.

Il riempimento di liquido cerebrospinale nella pipetta può verificarsi a causa del rilascio della pressione intracranica. Se ciò accade, allentare la presa sulla testa del POP per ridurre la pressione e facilitare l'iniezione del plasmide. Una volta inserita la pipetta in modo ottimale, iniettare circa 0,5 microlitri di plasmide nel ventricolo laterale.

Impostare la tensione del generatore di funzionamento elettrico per cinque impulsi quadrati, 50 millisecondi per impulso e 100 volt con intervalli di 50 millisecondi. La specificità spaziale del funzionamento dell'elettro al plasma è data dalla direzione del trasferimento di carica, quindi è necessario considerare lo spazio per il posizionamento degli elettrodi, data la diversità delle celle della SVZ. Le persone hanno riportato cambiamenti in termini di destino cellulare e proliferazione nella dorsale ventrale fino alle posizioni CAU.

Dopo l'iniezione del plasmide dip, gli elettrodi a pinzetta si inseriscono nel PBS per massimizzare il trasferimento di carica e aiutare a prevenire le ustioni causate dalla resistività. Quindi, posizionare l'elettrodo positivo sulla parete laterale dorsale del cranio vicino all'orecchio e immergere il laterale nell'iniezione del citoplasma. Quindi posizionare l'elettrodo negativo sull'emisfero controlaterale ventrale lateralmente al muso a pop.

Questa figura mostra il corretto orientamento degli elettrodi negativi e positivi rispetto agli assi x, y, Z sul cucciolo iniettato. Avviare il trasferimento di corrente premendo il pedale dell'interruttore a pedale a impulsi e spazzare gli elettrodi dalla dorsale alla laterale utilizzando intervalli angolari di circa 25 gradi. Una volta completata l'elettroporazione, posizionare tutti i cuccioli elettroporati su un termoforo per cinque minuti.

Ruota delicatamente i cuccioli ogni 30 secondi con una leggera stimolazione. Questa immagine mostra il ventricolo laterale di un topo neonatale 24 ore dopo l'elettroporazione di un vettore codificante EGFP. Le celle elettrolitiche emerescono di colore verde.

Qui vediamo il ventricolo laterale marcato LV 28 giorni dopo l'elettroporazione della Cree ricombinasi e GFP che codifica plasmidi in topi portatori di un codice di arresto a monte di TD la ricombinazione del pomodoro induce l'espressione del pomodoro TD osservata in rosso, la successiva diluizione del plasmide risultante dal numero rimanente di cellule SVZ positive per EGFP o il pomodoro TD espresso genomicamente è espresso in modo permanente. La diluizione del plasmide, il DNA mostrato in verde è evidente dato che più cellule nello strato cellulare granulare del bulbo olfattivo etichettato OB, esprimono il marcatore genomico TD pomodoro mostrato in rosso. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare e manipolare le cellule staminali della SVZ.