Modello murino Spinotrapezius per valutare l'impatto della legatura arteriolare sulla funzione microvascolare e rimodellamento

La malattia vascolare periferica colpisce circa il 12-14% della popolazione ed è particolarmente comune tra i consumatori di tabacco e gli individui con diabete, obesità, ipertensione, stadio avanzato o aterosclerosi. L'obiettivo di questo intervento è quello di produrre un modello per l'ischemia del muscolo scheletrico legando una delle tre arterie di alimentazione alla metà coccola del muscolo spino trapezio speculare. Questa animazione mostra la posizione generalizzata di queste arterie e indica il sito di legatura previsto in risposta all'ischemia.

Il tessuto vascolare subirà cambiamenti caratteristici dell'agenesia arteriosa a seconda del ceppo di topo. Ciò include la formazione di garanzie a ponte o l'aumento della tortuosità del vaso. Ti mostreremo anche come eseguire una procedura di vasodilatazione funzionale sul trapezio spinale utilizzando la microscopia intravitale.

Ciò comporta l'esposizione accurata del muscolo, il posizionamento degli elettrodi stimolanti con la loro fonte di alimentazione e il controller e quindi l'impostazione del dispositivo di imaging. Infine, mostreremo come asportare il muscolo e descriveremo un processo di fissazione adatto per la colorazione immunochimica e l'imaging. Ciao, mi chiamo Shane Pierce Kotler e sono professore associato presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università della Virginia a Charlottesville.

Ciao, sono Kyle Martin. Sono uno studente laureato nel laboratorio di Shane e mi esibirò nel modello di legatura del trapezio spinale. Il nostro laboratorio studia la crescita e il rimodellamento microvascolare, in particolare nei contesti di malattie ischemiche come le malattie cardiache, l'arteriopatia periferica e l'ictus.

Abbiamo sviluppato questo modello di legatura del trapezio spinale speculare per studiare come l'ostruzione localizzata del flusso sanguigno arterioso generi adattamenti strutturali nelle reti microvascolari a valle. Riteniamo che questo modello sia complementare al modello di ischemia degli arti posteriori, ben consolidato e ampiamente utilizzato, in quanto offre una visione dell'intera rete FFA dell'arte, della neurogenesi e dell'angiogenesi in un muscolo molto sottile che non richiede il sezionamento istologico per l'analisi. Poiché questo muscolo è così sottile e poiché la legatura crea una riduzione riproducibile del flusso sanguigno, possiamo visualizzare gli effetti della legatura arteriosa su tutto il letto microvascolare e con un livello di risoluzione di una singola cellula.

Dopo che Kyle ci ha guidato attraverso la procedura passo dopo passo per eseguire il modello di legatura spino-trapezio, i nostri collaboratori di Cal Poly ci mostreranno come utilizzano questo modello per studiare la vasodilatazione funzionale. Una volta che lo vedremo, ti riporteremo all'Università della Virginia e raccoglieremo il trapezio spinale, che deve essere fatto prima dell'imaging e della colorazione. Ciao, mi chiamo Trevor Cardinal.

Sono un assistente professore presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica presso la Cal Poly State University di San Luis Obispo, in California, e il mio nome è Josh Cutz. Sono uno studente di master in ingegneria biomedica presso Cal Poly a San Luis Obispo. L'interesse primario del nostro laboratorio di ricerca è la comprensione dell'impatto dell'ischemia cronica come avviene con la malattia periferica dei VA sulle capacità funzionali del sistema vascolare di resistenza.

Quindi, dopo l'esecuzione dell'intervento di legatura dell'arteria di alimentazione del trapezio spinale, Josh dimostrerà la procedura di vasodilatazione funzionale utilizzata nel nostro laboratorio. Nel nostro laboratorio, utilizziamo la procedura di vasodilatazione funzionale per esaminare l'effetto dell'occlusione arteriosa sulla reattività vascolare e sugli strumenti di controllo del flusso sanguigno. Per prepararsi in anticipo, includere una sutura a 10 nodi, una sutura di chiusura, un porta aghi, forbici per iride, pinze standard, forbici a molla e una micro sonda piegata.

Dopo aver preparato gli strumenti chirurgici anestetizzare il topo, qui utilizziamo la formula di visualizzazione e il dosaggio. Confermare l'anestesia con la punta del piede, il test del riflesso di pizzicamento, quindi applicare IGEL protettivo utilizzando una forma di rasoio elettrico, una grande macchia di pelo dalla schiena dell'animale. Sebbene la legatura del trapezio spinale richieda solo una piccola area da liberare vicino alla scapola, il prelievo di tessuto del trapezio spinale da eseguire entro pochi giorni richiederà una superficie libera molto più ampia.

Affrettare via il pelo in eccesso, quindi applicare la crema depilatoria seguendo le istruzioni del produttore. Lavare la parte posteriore con una spugna bagnata. Quindi applicare tre set di salviette Betadine imbevute di alcol alternate che terminano con Betadine odine.

In buone condizioni di illuminazione, il miglior sito di incisione può essere trovato mediante l'identificazione transdermica del cuscinetto adiposo dorsale. Poiché l'arteria di alimentazione attraversa bruscamente il muscolo trapezio spinale, il bordo del cuscinetto adiposo coccola la pelle in questa posizione e porta le forbici dell'iride direttamente dall'alto perpendicolarmente alla dorsale dell'animale e taglia per fare un'incisione lineare da tre a cinque millimetri. Se l'illuminazione o la pigmentazione della pelle non consentono l'identificazione transdermica.

Posizionare l'incisione a cinque millimetri di distanza dalla prominenza ossea della scapola, estendere l'incisione attraverso gli strati cutanei ed espanderla lateralmente secondo necessità per trovare il trapezio spinale. Sezionare la fascia sovrastante per accedere al sito di legatura. Se un vaso superficiale è danneggiato e presenta emorragie come in questo caso, attendere che il tempo di sanguinamento si fermi e applicare pressione se necessario, utilizzare con soluzione fisiologica per evitare l'essiccazione.

L'arteria indicata si trova lungo la faccia dorsale del trapezio spinale e poi attraversa il muscolo e nel cuscinetto adiposo ventrale. Trova il bordo laterale del trapezio spinale e riflettilo, sollevandolo in modo da essere quasi invertito. Questo rivela il suo aspetto ventrale e il sito trasversale dell'arteria seziona il cuscinetto adiposo ventrale che oscura il vaso.

Fare attenzione alla pressione del forcipe per evitare lesioni da schiacciamento. Qui il chirurgo indica l'arteria spina trapezio da legare. Si noti la presenza di coppie di vene, può essere applicato vasodilatatore come l'adenosina a breve durata d'azione o la papina a lunga durata d'azione.

In questo caso, l'arteria si trova tra altri due vasi, come indicato dalle frecce. Uno è di dimensioni simili all'arteria e si vedrebbe giacere più lateralmente se il muscolo non fosse riflesso, mentre l'altro è molto più grande e giacerebbe più immediatamente. I due siti di legatura sono contrassegnati da ai.

La prima legatura è posta nella direzione a valle rispetto alla seconda. Ciò garantisce che il vaso sia ancora pieno di sangue e visibile durante il posizionamento della seconda legatura. A indica la regione da sezionare.

Si noti la posizione B, dove l'arteria e la sua vena accoppiata sono entrate nel cuscinetto adiposo ventrale delineato da C. Questo ci fa sapere che il secondo vaso più piccolo è una vena. Si noti anche che il muscolo trapezio dell'arte spinale stesso delineato da D.Alcuni suggerimenti per discriminare l'arteria dalla vena sono forniti nel protocollo di testo allegato. Ma in breve, il nostro metodo preferito è quello di ostruire il flusso sanguigno applicando pressione con una micro sonda.

Se il vaso è un flusso arterioso sarà ostruito nella direzione a valle verso il muscolo riflesso che si applica. La tecnica qui esclude il vaso più grande. Se necessario, utilizzare la microsonda piegata a 80 gradi per separare l'arteria dagli altri vasi.

Questo viene fatto perforando il tessuto connettivo sotto il vaso e facendo brevi movimenti laterali per espandere uno spazio. Fino a quando la sonda non può essere facilmente fatta passare attraverso l'ago di sutura, ora può essere infilato più facilmente sotto l'arteria. In questo caso, una piccola vena è stata intaccata causando un sanguinamento minore.

Questo vaso si trova abbastanza lontano dalla zona ischemica da avere un impatto minimo. Durante la procedura, fare un singolo nodo del chirurgo e preparare la sutura successiva. Di nuovo, passando attraverso la fessura preformata e legando il nodo di un altro chirurgo qualche millimetro a monte della legatura precedente.

Tieni presente che il muscolo è riflesso e la direzione del flusso può essere opposta a quella prevista. Dopo che entrambe le legature sono state posizionate, cerca prove di una colonna di globuli rossi ostruita. Se il flusso non è stato interrotto, è necessaria un'altra legatura.

In caso contrario, sezionare il vaso tra le legature, notando se si verifica un'emorragia, in questo caso la legatura è andata a buon fine e non si osserva alcuna emorragia arteriosa. Un metodo alternativo impiega una singola legatura e la transezione nella direzione a valle. Consulta la documentazione allegata per sapere quando questo metodo è preferibile.

Riportare il muscolo all'orientamento originale, riposizionare il tessuto adiposo e la fascia spostati e chiudere con sutura adot-non riassorbibile. Infine, posizionare il topo in una gabbia di recupero riscaldata sotto osservazione e analgesico per la microscopia intravitale spino-trapezio. Il topo viene prima anestetizzato con fluoro in una camera di induzione e poi collegato a un flusso continuo di fluoro attraverso un cono nasale.

Inserire la sonda di temperatura rettale e impostare il termoregolatore a 35 gradi C Gli strumenti per prepararsi in anticipo includono forbici per iride, pinze standard, forbici a molla e un tampone PBS inumidito. Praticare un'incisione cutanea all'estremità della coccola del trapezio spinale usando le forbici dell'iride e le pinze brevettate standard. Estendere l'incisione craniale al cuscinetto adiposo, creando un'incisione a ferro di cavallo e coprire il lembo cutaneo con un involucro di plastica per evitare l'essiccazione smussata, sezionare il tessuto connettivo sottocutaneo con una pinza fine per massimizzare la visibilità.

Posizionare gli elettrodi stimolanti, tenendoli il più vicino possibile per ridurre al minimo le dimensioni del campo di corrente, posizionarli all'estremità della coccola del muscolo esposto appena lateralmente alla colonna vertebrale. Ancorare con argilla. Esegui una stimolazione di prova per confermare il posizionamento degli elettrodi utilizzando un sistema di acquisizione dati di laboratorio di potenza, uno stimolo, un isolatore e un software per grafici di laboratorio impostato su onde quadre della durata di 200 microsecondi, ampiezza di due milliampere e erogato a un hertz.

Copri di nuovo il muscolo esposto con pellicola trasparente. Per evitare l'essiccazione, attendere 30 minuti per diametro del recipiente per equilibrarsi e quindi acquisire l'immagine o il video. Posizionare il microscopio intravitale sul muscolo trapezio spinale per visualizzare l'architettura vascolare.

Se si utilizza una lente a immersione, posizionare una goccia di PBS tra l'obiettivo e l'involucro di plastica a partire dall'arteria principale, che è il vaso più grande visibile. Manipola lo stadio nel piano XY per individuare la nave di interesse. Stimolare il muscolo con onde quadre della durata e dell'ampiezza precedenti, ma erogate a otto hertz e per 90 secondi subito dopo la stimolazione.

Fotografare il recipiente e continuare a farlo ogni minuto fino a quando non è tornato al diametro di riposo. L'analisi dei dati può essere eseguita in tempo reale con calibri video o offline con software di analisi delle immagini. Ripetere la procedura dall'incisione iniziale all'imaging utilizzando il muscolo controlaterale.

Al termine. Eutanasia del topo seguendo il protocollo standard A CUC per il prelievo del tessuto della spina trapezio. Avremo bisogno di forbici per iride, pinze standard e forbici a molla.

Anestetizzare il topo come descritto in precedenza. Inizia praticando un'incisione di alcuni millimetri cranici sulla scapola del topo. Espandere l'incisione lateralmente e poi rivestire su entrambi i lati.

L'obiettivo è esporre il muscolo trapezio spinale, che si estende da T tre a L quattro dopo aver praticato l'incisione. La pelle può essere separata dalla parte posteriore tirando delicatamente o tagliando attentamente il tessuto connettivo, tenendolo in posizione, super fuso con soluzione salina per prevenire l'essiccazione e facilitare la manipolazione dei tessuti. Utilizzare la dissezione smussata per rimuovere il tessuto adiposo dorsale ed esporre il muscolo trapezio spinale.

Allo stesso modo, rimuovere il tessuto adiposo ventrale. Dopo aver riflettuto il muscolo, qui viene identificato il trapezio spinale destro dell'animale. Quindi, rimuovere il più possibile la fascia sovrastante.

Questa parte della procedura può essere noiosa, ma altrettanto importante per prevenire artefatti durante la microscopia. Una volta rimosso il tessuto connettivo, asportare il tessuto come mostrato tagliando prima il bordo laterale approssimativamente parallelo al dorso e muovendosi in direzione craniale a coccola. Quindi tagliare trasversalmente attraverso la massima estensione cranica e infine lungo il bordo mediale, più vicino alla colonna vertebrale per raccogliere il muscolo controlaterale.

Seguire la stessa procedura. Prima rimuovendo il tessuto adiposo dorsale, poi il tessuto adiposo ventrale e infine la fascia sovrastante durante il taglio. Potrebbe essere più facile passare da uno strumento all'altro con la mano meno dominante.

Il tessuto asportato può essere fissato e lavato seguendo la procedura qui descritta dopo che l'animale è stato soppresso. Secondo un protocollo A CUC migliorato. Vedere la documentazione allegata per i dettagli su una procedura alternativa di fissazione della perfusione.

Qui mostriamo un diagramma etichettato del muscolo spino trapezio riflesso. Dopo aver esposto l'arteria di alimentazione, le lettere indicano le regioni come in precedenza. Tieni presente che ogni animale ha un'anatomia unica.

Questo particolare topo è considerato piuttosto difficile per questa procedura a causa della vicinanza degli altri due vasi. Qui viene mostrato un animale più tipico. Si noti la separazione relativamente grande dell'arteria indicata dalla vena para appena sopra di essa e l'assenza di un terzo vaso.

Qui vediamo un montaggio al microscopio confocale di un muscolo trapezio spinale destro legato che è stato colorato per l'alfa actina del muscolo liscio. In condizioni ischemiche, si è verificato un rimodellamento nella regione indicata a valle del sito di legatura. Questi cambiamenti possono essere quantificati con il software di analisi delle immagini, che utilizziamo qui per misurare la tortuosità come rapporto tra la lunghezza del percorso dell'arteria e la distanza del core.

Alcuni dati campione mostrati qui indicano un risultato statisticamente significativo per l'aumento della tortuosità del vaso rispetto al controllo controlaterale. Dimostriamo anche le misure funzionali della reattività dei vasi utilizzando il software medico MicroVision a VA su un microscopio a campo scuro offline. I diametri dei vasi video vengono misurati prima e dopo la stimolazione e poi confrontati tra loro come variazione percentuale.

I dati del campione mostrati qui indicano un risultato statisticamente significativo per l'aumento del diametro del vaso per le arterie terminali dopo la stimolazione. Ciao, sono Alexander Ell e sono lo studente universitario del laboratorio Pierce Scholer che ha montato questo video. Insieme, ti abbiamo appena mostrato come creare un modello per l'ischemia del muscolo scheletrico nel muscolo trapezio di spin speculare.

Successivamente abbiamo dimostrato una procedura di vasodilatazione funzionale adatta a misurare la reattività vascolare e il controllo del flusso sanguigno. Infine abbiamo mostrato come asportare il muscolo per prepararsi alla fissazione adatta per la colorazione immunochimica e l'imaging. A nome dei miei collaboratori a San Luis Obispo e qui a Charlottesville, vorrei ringraziarvi per avermi guardato e augurarvi addio e buona fortuna per i vostri sforzi di ricerca.