Name: Sviluppo, di espansione, e In vivo Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Scopri come generare e espandere cellule NK umane da hESC e iPSC senza feeder, con imaging in vivo per monitorare l'attività antitumorale. Questo metodo offre un approccio scalabile per la ricerca immunologica.

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Gli autori desiderano ringraziare Melinda Hexum per l&#39;inizio del protocollo EB rotazione all&#39;interno del nostro laboratorio. Vorremmo ringraziare gli altri membri del laboratorio, tra cui Laura E. Bendzick, Michael Lepley, e Zhenya Ni per la loro assistenza tecnica con questo lavoro. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Brad Taylor al Caliper Life Sciences per la sua consulenza tecnica di esperti.

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).</li>
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<li>Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+describing+the+use+of+a+recombinant+protein-based%2C+animal+product-free+medium+%28APEL%29+for+human+embryonic+stem+cell+differentiation+as+spin+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies.</a> Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).</li>
<li>Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust%2C+reproducible+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106, 1601-1603 (2005).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+CD34%2B+cells%3A+efficient+production+in+the+coculture+with+OP9+stromal+cells+and+analysis+of+lymphohematopoietic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential.</a> Blood. 105, 617-626 (2005).</li>
<li>Woll, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+differentiate+into+a+homogeneous+population+of+natural+killer+cells+with+potent+in+vivo+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity.</a> Blood. 113, 6094-6101 (2009).</li>
<li>Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+NK+cells+acquire+functional+receptors+and+cytolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity.</a> Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).</li>
<li>Ni, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pluripotent+Stem+Cells+Produce+Natural+Killer+Cells+That+Mediate+Anti-HIV-1+Activity+by+Utilizing+Diverse+Cellular+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms.</a> Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).</li>
<li>Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+spin+embryoid+bodies+and+a+description+of+the+hematopoietic+blast+colony+forming+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3(2008).</li>
<li>Denman, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-Bound+IL-21+Promotes+Sustained+Ex+Vivo+Proliferation+of+Human+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells.</a> PLoS ONE. 7, e30264(2012).</li>
<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+Purification%2C+and+Functional+Assessment+of+Human+Peripheral+Blood+NK+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells.</a> J. Vis. Exp. (48), e2540(2011).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+imaging+demonstrates+that+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+CD34%2B+cells+preferentially+develop+into+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells.</a> Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).</li>
<li>Wilber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+transposon-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer.</a> Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).</li>
<li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7, 827-829 (2010).</li>
<li>Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+luminescence+assays+using+scintillation+counters+for+quantitation+in+transfected+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).</li>
<li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Imaging.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 2, 537-540 (2005).</li>
<li>Santos, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+in+vivo+imaging+of+T+cells+using+a+membrane-bound+Gaussia+princeps+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase.</a> Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Proteins+and+Their+Applications+in+Imaging+Living+Cells+and+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues.</a> Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Lymphocytes+to+Study+In+Vivo+Trafficking+and+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy.</a> Stem Cells Dev. 28, 28(2013).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Decade+of+Imaging+Cellular+Motility+and+Interaction+Dynamics+in+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System.</a> Science. 336, 1676-1681 (2012).</li>
</ol>

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NHLBI R01-HL77923 (DSK) e dal NIH MSTP concessione T32 GM008244 (DAK), Stem Cell Biology formazione di Grant T32 (DAK) (T32HD060536), Undergraduate Research Opportunities Program (UROP) Grant, University of Minnesota (AMB), il Fondo Leukemia Research della University of Minnesota Cancer Center, e il William L e Blanche Hughes Foundation.

hESCs sono una piattaforma ideale per studiare diversi tipi di cellule e mantenere un notevole potenziale per la traduzione clinica. Usiamo un, giro approccio EB definito per differenziare hESC / iPSCs di cellule progenitrici ematopoietiche. L&#39;approccio EB giro ha dato derivazione consistente di cellule progenitrici ematopoietiche e la differenziazione di cellule NK, ma, variazione esiste ancora in efficienza differenziazione tra linee di cellule e può avere bisogno di essere modificati per la generazione di altre l...

Cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), sono cellule pluripotenti indifferenziate capaci di auto-rinnovamento e multi-lignaggio differenziazione illimitata. hESCs sono stati differenziati successo in sottoinsiemi maturi e funzionali di ogni strato di germe, comprese le cellule del sistema ematopoietico 1-3. Killer (NK) naturali sono linfociti del sistema immunitario innato, che può essere derivato da cellule staminali embrionali umane per la formazione di corpi embrionali (EBS) 4,5 o co-coltura con linee di cellule stromali 1,2,6-8. Cellule NK possedere capacità anti-virali e anti-tumorale e hanno il potenziale di essere efficace contro una vasta gamma di tumori maligni, in quanto non richiedono stimolazione antigenica prima a svolgere le loro funzioni effettrici. Così, le cellule hESC-derivato NK sono un&#39;interessante fonte di cellule per l&#39;immunoterapia. Ulteriormente, la derivazione di cellule NK da hESCs fornisce un sistema geneticamente suscettibili di studiare lo sviluppo normale &lt;em&gt; in vitro. Perché forniscono un sistema geneticamente trattabili, cellule hESC-derivato NK possono essere sperimentalmente modificate per esprimere reporter fluorescenti e bioluminescenti fornendo un modello ottimale per studiare NK funzioni effettrici cellulari in vitro e in vivo. cellule NK hESC-derivati ​​possiedono attività contro una serie di obiettivi tra cui l&#39;HIV 9, leucemia (K562) e altri tipi di cancro 7,8. Tuttavia, la capacità di ricavare in modo efficiente le cellule NK abbastanza capaci di curare i pazienti rimane un ostacolo importante per la traduzione clinica ed è, in misura minore, di una limitazione per la vasta pre-clinica in vivo dello sviluppo delle cellule NK e le funzioni anti-tumorali. Qui, usiamo un approccio EB selezione per derivare progenitori emopoietici dal hESCs 4,5,10. Following 11 giorni l&#39;centrifuga EBs vengono trasferiti in coltura cellule NK con o senza alimentatori per 28 giorni. Dopo 4 settimane in coltura cellulare NK, cellule NK sono tran, trasferita a co-coltura con cellule K562 modificate per esprimere di membrana interleuchina 21 (IL-21), che servono come cellule presentanti l&#39;antigene (aAPCs artificiali). Adattare un protocollo per l&#39;espansione delle cellule NK nel sangue periferico utilizzando queste artificiale APCs 11,12, siamo in grado di espandere le cellule NK 2-log, pur mantenendo un fenotipo maturo e capacità citotossiche. Questo processo di sviluppo e di espansione fornisce sufficienti cellule hESC-derivato NK vasta caratterizzazione in vivo. Per gli studi in vivo, siamo in grado di monitorare in modo non invasivo l&#39;attecchimento a lungo termine e la cinetica di iniezione lucciola luciferasi che esprimono (Fluc +), le cellule NK hESC-derivate che utilizzano l&#39;imaging bioluminescenza. Inoltre, siamo in grado di seguire le interazioni delle cellule NK con le cellule tumorali utilizzando uno schema di imaging doppio, bioluminescente o fluorescenti. Uno studio precedente dal nostro gruppo ha utilizzato l&#39;imaging bioluminescenza in un modello anti-tumorale di seguire la progressione del tumore e CLEarance di Fluc + K562 in vivo 7. Ora, da Engineering nostri hESCs per esprimere lucciola luciferasi 13,14 siamo in grado di seguire la distribuzione biologica ed il traffico delle cellule NK per K562 cellule tumorali che esprimono la proteina fluorescente recentemente caratterizzata, turboFP650 15. Abbiamo scelto questo sistema duale giornalista per seguire simultaneamente le due popolazioni cellulari in vivo (Figura 1). La maggior parte dei modelli duali di imaging sono stati i sistemi dual-luciferasi, ma questi sistemi possono essere tecnicamente impegnativo a causa dei requisiti di consegna dei coelenterazine, il substrato necessario per l&#39;espressione del più Renilla e Gaussia reporter luciferasi 16-18. Reporter fluorescenti hanno permesso un facile monitoraggio di molte linee cellulari e costrutti in vitro, ma ha avuto un successo limitato per imaging in vivo a causa della sovrapposizione tra il tessuto e autofluorescenza pelliccia e gli spettri di molti co emissionimmonly usato reporter fluorescenti tra GFP, DsRed e tdTomato 15,19. Questa preoccupazione ha favorito lo sviluppo di proteine ​​fluorescenti far-rossi, che consentono una migliore penetranza del tessuto e del segnale specifico superiore rispetto al fondo 15,19. TurboFP650, la proteina fluorescente mostrato in questo sistema, è lontano-rosso spostato e supera molti dei problemi connessi con proteine ​​fluorescenti di imaging in animali viventi. Questo metodo per sviluppare ed espandere cellule NK derivate da hESCs ha permesso di caratterizzare ulteriormente hESC-derivato cellule NK in vitro e in vivo, che è necessario per comprendere meglio la funzione delle cellule NK e clinicamente importante migliorare attuali terapie adottive cellule NK. È anche suscettibile di derivazione e l&#39;espansione delle cellule NK iPSC-derivati. Il sistema di imaging a fluorescenza e bioluminescenti duale è ampiamente applicabile a sistemi diversi dal modello anti-tumorale abbiamo mostrato qui.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materiale&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Mezzi&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Mezzo BPEL per la generazione di EB a rotazione&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mezzo di Iscove modificato di Dulbecco (IMDM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3022801</td><td></td></tr><tr><td>Miscela nutritiva F-12 con Glutamax I</td><td>Invitrogen</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3311</td><td>La BSA disponibile in commercio può essere citotossica per le cellule ES. La desalinizzazione della soluzione può ridurre il potenziale di citotossicità.</td></tr><tr><td>Poli(vinil alcol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Acido linoleico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Acido linolenico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Synthechol 500X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5442</td><td></td></tr><tr><td>α-monotio glicerolo (α-MTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5442</td><td></td></tr><tr><td>Miscela proteina-free per ibridoma II</td><td>Invitrogen</td><td>12040077</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato 2-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione 100X Insulina, Transferrina, Selenio (ITS)</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Mezzi per differenziazione NK&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo F-12</td><td>Invitrogen</td><td>CX30315</td><td></td></tr><tr><td>Siero umano AB al 15%</td><td>Valley Biomed</td><td>HP1022HI</td><td></td></tr><tr><td>Selenito di sodio 5 ng/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Etanolammina 50 µM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico 20 ng/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapto&amp;#8211;etanolo (BME) 25 µM</td><td>Gibco</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina 2 mM</td><td>Gibco</td><td>CX30310</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep 1%</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Citochine&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">(tutte le citochine utilizzate fresche da aliquote congelate)</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>300-07</td><td>40 ng/ml nel mezzo BPEL; 20 ng/ml nel mezzo NK). Come indicato dal protocollo Elefanty e come abbiamo riscontrato con un lotto difettoso di BMP4, possono esserci differenze tra lotti di citochine riguardo alla differenziazione ematopoietica. In particolare se si acquistano citochine in grandi quantità, ottenere un campione del lotto da testare prima dell'acquisto. Confrontare direttamente con il vecchio lotto.</td></tr><tr><td>rhBMP-4</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>314-BP</td><td>20 ng/ml nel mezzo BPEL</td></tr><tr><td>rhVEGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>293-VE</td><td>20 ng/ml nel mezzo BPEL</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-02</td><td>1 x 10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt; U/ml somministrate ai topi dopo l'iniezione di cellule NK; 50 U/ml utilizzate nel protocollo di espansione delle cellule NK</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-15</td><td>10 ng/ml somministrate ai topi dopo l'iniezione di cellule NK (solo per i primi 7 giorni)</td></tr><tr><td>IL-3</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-03</td><td>5 ng/ml nel mezzo NK</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-07</td><td>20 ng/ml nel mezzo NK</td></tr><tr><td>Flt-3-Ligando</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>300-19</td><td>10 ng/ml nel mezzo NK</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;&lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; Imaging&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sale sodico di D-Luciferina</td><td>Gold BioTechnology</td><td>Lucna-500</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide TurboFP650</td><td>Evrogen, Mosca, Russia</td><td>FP731</td><td>Subclonato in un plasmide basato sul trasposone Sleeping Beauty sotto il controllo del promotore mCAGs. Le cellule sono state quindi ordinate in base all'espressione di turboFP650 mediante FACS. Cellule e plasmidi possono essere ottenuti presso il nostro laboratorio.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Attrezzatura&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sistema di imaging IVIS Spectrum</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cellule&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cellule artificiali presentanti antigene che esprimono IL-21 legata alla membrana</td><td><a href="http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> MD Anderson, Houston, TX</a></td><td></td><td>contatto: Dean A. Lee. &lt;a href="http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood" target="_blank"&gt;http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cellule staminali embrionali umane (hESC) esprimenti la luciferasi della lucciola</td><td>Università del Minnesota, Minneapolis, MN</td><td></td><td>contatto: Dan S. Kaufman. Le cellule H9 sono state modificate mediante un metodo basato sul trasposone Sleeping Beauty (riferimenti 13 e 14). L'espressione della luciferasi della lucciola è controllata dal promotore mCAGGS. Dopo il gene della luciferasi della lucciola è presente un elemento IRES all'estremità 5' di un costrutto fusione GFP:zeocina.</td></tr><tr><td>Cellule K562 esprimenti TurboFP650</td><td>Università del Minnesota, Minneapolis, MN</td><td></td><td>contatto: Dan S. Kaufman. Descrizione nella sezione commenti del plasmide</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class="jove_content"&gt;&lt;strong&gt;Tavola dei materiali.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

sviluppo, di espansione, e<em&gt; in vivo</em&gt; monitoraggio delle cellule nk umane da cellule staminali embrionali umane (hesc) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (ipscs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Vi presentiamo un metodo per derivare killer (NK) naturali da hESC indifferenziato e iPSCs utilizzando un approccio alimentatore-Free. Questo metodo comporta elevati livelli di NK dopo 4 settimane coltura e può subire un&#39;ulteriore espansione 2-log con cellule presentanti l&#39;antigene artificiali. hESC-e IPSC-derivato cellule NK sviluppati in questo sistema hanno un fenotipo e funzione maturo. La produzione di un gran numero di organismi geneticamente modificabili cellule NK è applicabile sia per meccanicistico di base così come gli studi anti-tumorali. Espressione di lucciola luciferasi in hESC-derivate cellule NK permette un approccio non invasivo per seguire l&#39;attecchimento delle cellule NK, la distribuzione e la funzione. Abbiamo anche descrivono un sistema dual-imaging che consente il controllo separato di due diverse popolazioni cellulari di caratterizzare più nettamente le loro interazioni in vivo. Questo metodo di derivazione, espansione, e dual imaging in vivo fornisce un metodo affidabile per la produzione di cellule NK e loro valuzione che è necessario per migliorare attuali terapie adottive cellule NK.

La generazione di cellule progenitrici ematopoietiche che utilizzano il metodo EB rotazione consente una ottimale sviluppo delle cellule NK da hESCs e iPSCs. Come mostrato nella Figura 2, il giorno 11 di spin EBs contiene alte percentuali di cellule progenitrici che esprimono CD34, CD45, CD43, e CD31. Alti livelli di CD34 e CD45 consente il trasferimento diretto alle condizioni NK senza necessità di cernita o di supporto cellule stromali. Se vi è subottimale rotazione differenziazione EB, si raccomanda ...

Questo protocollo descrive lo sviluppo, l&#39;espansione e immagini in vivo di cellule NK derivate da hESCs e iPSCs.

Sviluppo, di espansione, e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare cellule natural killer umane o NK da cellule staminali sfocate e potenti. Ciò si ottiene generando prima le cellule progenitrici ematopoietiche. Nella seconda fase, le cellule progenitrici ematopoietiche vengono differenziate in cellule NK attraverso l'uso di citochine definite.Successivamente, le cellule NK possono essere testate in una varietà di saggi funzionali. Nella fase finale, il dual imaging viene utilizzato per monitorare la capacità delle cellule NK di uccidere i bersagli tumorali in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi tradizionali esistenti, come la differenziazione mediata da cellule stromali o la formazione regolare di EB, è che il sistema B spinoso fornisce un approccio completamente definito senza alimentatore per l'espansione su larga scala di cellule progenitrici che possono essere differenziate in cellule natural killer.Le implicazioni di questa tecnica si espandono verso il trattamento delle infezioni virali croniche, così come del cancro, poiché le cellule NK hanno dimostrato di essere importanti cellule effettrici in entrambe queste malattie. Per prepararsi alla placca

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Bioingegneria

La capacità di cellule staminali embrionali umane per auto-rinnovarsi e differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo suggerisce che essi sono molto promettenti per le applicazioni mediche e come strumento di ricerca per affrontare questioni fondamentali per lo sviluppo e la malattia. Qui, mettiamo a disposizione una concisa, passo-passo il protocollo per la derivazione di cellule staminali embrionali umane da embrioni da immunosurgical isolamento della massa cellulare interna.

Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery

Con il crescente interesse per le terapie con cellule staminali, le tecniche di imaging molecolare sono ideali per il monitoraggio del comportamento delle cellule staminali dopo il trapianto. Geni reporter luciferasi hanno permesso non invasiva, la valutazione ripetitivo della sopravvivenza cellulare, la posizione e la proliferazione in vivo. Questo video dimostra come monitorare la proliferazione hESC in un topo vivo.

In vitro e in Imaging bioluminescenza gene reporter in vivo di cellule staminali embrionali umane

Qui si descrive un metodo per estendere in modo efficiente e purificare un gran numero di cellule NK e valutare la loro funzione.

Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

La qualità di fibroblasti embrionali di topo (MEF) è dettata dal ceppo destro del mouse, ad esempio CF-1. Pluripotenza-solidale MEF e mezzi condizionati (CM) ottenuti da questi dovrebbe contenere le concentrazioni ottimali di Activin A, Gremlin e Tgfβ1 necessari per la Activin / Nodale FGF e percorsi di co-operativamente mantenere il self-renewal e la pluripotenza.

Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

Qui mostriamo un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs umani da 3-4 ml di sangue periferico utilizzando un singolo vettore lentivirale riprogrammazione. La riprogrammazione delle cellule del sangue prontamente disponibili promette di accelerare l'utilizzo della tecnologia iPSC rendendola accessibile ad una comunità di ricerca più ampio.

Generazione di cellule pluripotenti indotte umane staminali da sangue periferico mediante il STEMCCA lentivirale Vector

Qui, presentiamo protocolli di coltura di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), basati sulla crescita di singole cellule dissociate in monostrato (NCM) di tipo non coloniale. Questo nuovo metodo, che utilizza inibitori della chinasi Rho-associati o l'isoforma 521 della laminina (LN-521), è adatto per la produzione di grandi quantità di hPSC omogenee, la manipolazione genetica e la scoperta di farmaci.

Le colture per pluripotenti umane alternative staminali produzione di celle, manutenzione e analisi genetica

I protocolli descrivono due sistemi di test in vitro di tossicità dello sviluppo (UKK e UKN1) a base di cellule staminali embrionali umane e studi trascrittoma. I sistemi di test prevedono pericolo tossicità per lo sviluppo umano, e possono contribuire a ridurre studi sugli animali, i costi e il tempo necessario per le prove della sicurezza chimica.

Umano cellule staminali pluripotenti Basato Tossicità per lo sviluppo saggi per Chemical Screening e Safety Systems Biology generazione dati

I protocolli descritti consentono ai laboratori di eseguire colture di cellule staminali scalabili e aderenti ad alta produttività con un costo minimo di manodopera, esperienza e investimento in attrezzature utilizzando un robot programmabile per la manipolazione dei liquidi e piastre da 96 pozzetti.  Le iPSC sono passate più di 20 volte su questo sistema, hanno mantenuto la pluripotenza, cariotipi normali e si sono differenziate in cardiomiociti.

Scalabile piastra a 96 pozzetti Based iPSC cultura e di produzione utilizzando un sistema robotico Liquid Handling

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Il presente protocollo mostra come differenziare le cellule CD3−/CD45+CD56+ con citotossicità lieve dalle cellule staminali umane a potenziale espanso (hEPSC) sia in condizioni di coltura 3D che 2D. Ciò consente la convalida fenotipica di routine senza la distruzione del complesso microambiente.

Generazione di cellule Natural Killer da cellule staminali umane espanse

Qui, presentiamo un metodo per differenziare ed espandere le cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) derivato da iPSC umano con una migliore uccisione contro vari tumori maligni. Questo protocollo dimostra la differenziazione e l'espansione di cellule CAR-NK derivate da iPSC ottimizzate per natural killer (NK) e la misurazione dell'attività antitumorale contro varie linee cellulari tumorali.

Progressi nelle cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico derivato da cellule staminali pluripotenti umane

Scopri come generare e espandere cellule NK umane da hESC e iPSC senza feeder, con imaging in vivo per monitorare l'attività antitumorale. Questo metodo offre un approccio scalabile per la ricerca immunologica.

Sviluppo, di espansione, e In vivo Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) (Video) | JoVE Journal

Sviluppo, di espansione, e

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