Metabolomica non mirati da fonti biologiche Uso UltraPerformance cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di confrontare istantanee dei profili metabolici di diversi gruppi di campioni biologici. Ciò si ottiene utilizzando un'estrazione liquida e liquida per separare le molecole organiche e polari. In una seconda fase, le molecole vengono ulteriormente separate mediante cromatografia liquida e analizzate mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione, che fornisce dati sul tempo di ritenzione, sul rapporto massa/carica e sull'intensità per ulteriori analisi.

Le successive esecuzioni di cromatografia liquida vengono allineate e le caratteristiche vengono rilevate, quantificate e ordinate. Al fine di identificare le caratteristiche differenzialmente abbondanti tra i gruppi. I risultati mostrano le differenze nelle caratteristiche tra le condizioni di trattamento in base all'abbondanza differenziale di analiti rilevata dalla cromatografia liquida e dalla spettrometria di massa ad alta risoluzione.

Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per studiare il metabolismo cellulare, può anche fornire informazioni sulla scoperta di biomarcatori o sul metabolismo biotico zenobiotico. Per le linee aderenti, aggiungere 1,5 millilitri di terreno alle celle in una piastra da 10 centimetri. Posizionare la piastra sul ghiaccio e raschiare delicatamente per sollevare le cellule.

Trasferire 1,5 millilitri di sospensione cellulare sollevata in una provetta da centrifuga in vetro da 10 millilitri pre-marcata. Quindi, aggiungere sei millilitri di metanolo cloroformio due a uno a ciascuna delle provette di vetro da 10 millilitri contenenti i campioni. Agitare i campioni a bassa velocità per 30 minuti Dopo l'agitazione, centrifugare i campioni con un'impostazione di decelerazione a bassa accelerazione a 1,935 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per separare completamente le fasi utilizzando una pipetta da pascolo a stelo lungo.

Trasferire lo strato organico in una nuova provetta da centrifuga in vetro da 10 millilitri pre-etichettata. Quindi, trasferire lo strato acquoso in una provetta di plastica pulita da due millilitri. A questo punto, far evaporare i campioni organici e acquosi sotto azoto gassoso.

Ricostituire i campioni essiccati in 50-100 microlitri della soluzione di partenza per il metodo UPLC desiderato. Pipettare delicatamente il campione su e giù per facilitare la dissoluzione degli analiti. Quindi trasferire ogni campione in un filtro a tubo di nylon da 0,22 micron e centrifugare fino a 14.000 volte G per circa cinque minuti fino a quando il campione non è completamente passato attraverso il filtro.

Ispezionare il campione per assicurarsi che non rimangano precipitati visibili nel campione. Trasferire il surnatante del campione filtrato in una fiala UPLC pre-marcata con inserire il tappo della fiala. Quindi sfioralo per rimuovere eventuali bolle dal fondo della fiala del campione.

Posizionare il campione nel campionatore di auto refrigerato. Ora crea una corsa per il campione organico utilizzando il software di controllo per il cromatografo liquido. Successivamente, creare una corsa per il campione organico in base alle condizioni UPLC ottimizzate.

Utilizza le condizioni UPLC ottimizzate per creare un metodo anche per la fase acquosa. Se un insieme noto di analiti target è di grande interesse, ottimizzare le condizioni UPLC utilizzando l'analogo marcato pesante di questi composti e generare un metodo. Utilizzando queste condizioni, consentire all'UPLC di equilibrarsi adeguatamente.

Ciò dovrebbe includere un adescamento completo dei solventi Prima di collegare una colonna e seguire le indicazioni del produttore per il volume di equilibrio di una nuova colonna, mantenere un registro delle contropressioni iniziali per aiutare a diagnosticare problemi futuri utilizzando il software di controllo per lo spettrometro di massa ad alta risoluzione. Creare un metodo in modalità positiva. Quindi, utilizzando le stesse condizioni, creare un metodo in modalità negativa.

Pulire e calibrare lo strumento. Stabilire uno spruzzo stabile nello spettrometro e lasciare che la soluzione di calibrazione si disperda adeguatamente dalla sorgente e dall'ottica. Una stabilità accettabile dello spray dovrebbe fornire una deviazione standard relativa dell'intensità dal tre al 5% su almeno 100 scansioni con iniezione di soluzione di calibrazione alla stessa velocità di flusso del metodo lc utilizzato.

Utilizzando un generatore di numeri casuali e una chiave, impostare i campioni in modo casuale per evitare qualsiasi effetto batch introdotto dall'analisi. Imposta la sequenza per tutti i campioni. Impostare il volume di iniezione appropriato ed eseguire un bianco prima del primo campione.

Se si sospetta un carryover o un effetto matrice tra i campioni, eseguire i blank o i lavaggi adeguati, iniziare la sequenza e monitorare periodicamente i problemi, tra cui le fluttuazioni di pressione o la perdita di intensità del segnale durante la seduta. Se vengono rilevati problemi gravi, interrompere la corsa. Pulire e calibrare lo strumento.

Stabilire uno spruzzo stabile nello spettrometro e lasciare che la soluzione di calibrazione si disperda adeguatamente dalla sorgente e dall'ottica. Prima di iniziare l'analisi differenziale, controllare manualmente le correnti ioniche totali o esaminare i cromatogrammi filtrati per qualsiasi composto noto nel campione. Per garantire la riproducibilità delle sequenze e la stabilità dello slash di iniezione UPLC slash spray in tutti i campioni, trasferire i file di dati RAW dallo spettrometro di massa al disco rigido della workstation in cui è installato il setaccio.

Setaccio aperto. Inizia un nuovo esperimento e carica i file appropriati nel setaccio. Assegnare gruppi di confronto e selezionare un singolo file di riferimento per consentire a SIE V di generare i parametri per l'analisi.

Segui le istruzioni e regola i parametri in base ai requisiti di ogni singolo esperimento. Caricare l'elenco degli addotti corretto per la modalità positiva o negativa nei parametri. Una volta terminata l'analisi, controlla che sullo schermo sia stato popolato un elenco di fotogrammi.

Assicurarsi che l'allineamento lc si sovrapponga a tutti i picchi di riferimento. Se una qualsiasi delle corse di lc non allineate mostra una grande deviazione nei picchi di riferimento. Ciò potrebbe indicare un problema con il campione.

Traccia i dati in base al coefficiente di variazione all'interno di una popolazione campione simile. Ordina l'elenco in base alle caratteristiche desiderate. Successivamente, esaminare ogni picco per verificare l'allineamento appropriato tra i gruppi.

Integrazione dei picchi, gaussiana, intensità del segnale della forma dei picchi, isotopi e assegnazione degli addetti. Esporta i dati come desideri per ulteriori analisi o per generare elenchi di massa mirati per la conferma e gli esperimenti MS alla fine. Un gran numero di colpi sono stati identificati dai due programmi utilizzati per i punti verdi differenziali sono caratteristiche più abbondanti nel controllo, mentre i punti rossi sono più abbondanti nel trattamento.

Una dimensione del punto maggiore indica una maggiore entità della variazione di piega tra i gruppi e l'intensità del colore dimostra un valore P decrescente con l'aumentare della saturazione del colore raffigurato. Ecco i cromatogrammi che mostrano la modalità ionica positiva in fase organica: la finestra di analisi UPLC MS mostra la corrente ionica totale da S Civ 2.0. Il cromatogramma ionico estratto per la caratteristica identificata come pannello D da XCMS viene visualizzato nella finestra B.La finestra C mostra il cromatogramma ionico estratto per la caratteristica identificata come marciume noto da sve.

La finestra D mostra il cromatogramma ionico estratto per la caratteristica identificata come marciume noto da sve normalizzato alla corrente ionica totale. Una caratteristica differenzialmente abbondante ridotta nel gruppo trattato con marciume noto è stata provvisoriamente identificata come d panadina mediante un'accurata ricerca di massa nel database. L'identità dell'analita è stata confermata con la spettrometria di massa tandem U-P-L-C-H-R.

Di seguito è riportato un confronto tra i cromatogrammi e gli spettri di massa del campione e del composto puro. Non dimenticare che lavorare con il cloroformio può essere estremamente pericoloso e che è necessario seguire precauzioni adeguate, come una cappa ben ventilata.