Name: La adquisición de fluorescencia Time-lapse películas de levadura en ciernes y el análisis de la dinámica de una sola célula con injertos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 1 s
Description: Aprenda a obtener películas de fluorescencia time-lapse de levaduras en crecimiento y analizar la dinámica de células individuales con el software graft. Este método permite estudiar cambios en la tasa de transcripción durante el ciclo celular.

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Damos las gracias a Emily Jackson, Joshua Zeidman y Nicholas Wren para comentarios sobre el software. Este trabajo fue financiado por GM95733 (a NM), BBBE 103.316 y los fondos de inicio del MIT (a NM).

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El protocolo anterior se describe un método simple para obtener y analizar datos de series temporales de fluorescencia con experiencia limitada en la microfluídica o en el desarrollo de software. Esto permite obtener películas a intervalos de fluorescencia de las células individuales de levadura, extracto de tamaño de la celda correspondiente y las mediciones de expresión; asignaciones linaje cura y seguimiento, y analizar el comportamiento de las células en su conjunto a través del tiempo mediante un dispositivo de cul...

Análisis individual de células de la expresión génica ha impulsado nuestra comprensión de muchos aspectos de la regulación de genes. Instantáneas estáticas de expresión reportero fluorescente utilizando citometría de flujo o microscopía proporcionan información útil sobre la distribución de la expresión de una sola célula, pero carecen de la historia y la evolución de los datos de series de tiempo requeridos para informar directamente dinámica de la expresión de genes. Fluorescencia microscopía de lapso de tiempo presenta un medio para obtener ambas medidas unicelulares y su historia. Diversas técnicas experimentales y analíticos se han desarrollado para obtener y cuantificar las películas de la expresión del indicador fluorescente, impartiendo así conocimientos sobre las características de regulación génica (véase 1 para una revisión), como la variación de célula a célula de 2,3, la formación persister bacteriana 4, la transcripción iniciación y elongación de 5, transcripción estallido 6,7, la dependencia del ciclo celular 8,9, y la heredabilidad 10. Sin embargo, obtaining series de tiempo de fluorescencia de una sola célula de calidad implica retos técnicos significativos en el cultivo de una monocapa de células en un entorno controlable y en la cuantificación de alto rendimiento de las películas de fluorescencia adquiridos. Aquí se describe un procedimiento para obtener y analizar películas de fluorescencia de S. cerevisiae sin experiencia requerida en la cultura fabricación dispositivo celular o en el desarrollo de software (Figura 1). En primer lugar, vamos a detallar un protocolo de ejemplo para generar fluorescencia películas de series de tiempo para la levadura en ciernes que expresa una o más reporteros fluorescentes. Aunque cámaras de cultivo de microfluidos personalizadas se han construido y empleado con éxito previamente 11-13, se utiliza un dispositivo de microfluidos disponible comercialmente de CellAsic (Hayward, CA). El sistema confina a las células de crecimiento monocapa y permite el control continuo de la perfusión del medio ambiente. El protocolo de microscopía que presentamos es un simple medio para obtener fluorescpelículas rencia de levadura en ciernes, pero cualquier modificación del protocolo experimental (un dispositivo de cultivo a medida, las condiciones de los medios de comunicación alternativos, etc.) que producen datos de la película de fluorescencia similares de células individuales de levadura pueden ser sustituidos. A continuación, presentamos el análisis de las películas mediante una interfaz gráfica de usuario (GUI) basada en software de MATLAB (Mathworks, Natick, MA), conocido como el GUI para Rapid Analysis of Time Series fluorescencia (INJERTOS), para extraer los datos de series de tiempo para las células individuales. INJERTOS tiene características similares al versátil software de código abierto paquete identificador de celda 14 en la segmentación y seguimiento de las células y en la extracción de la intensidad de fluorescencia y la información geométrica. Sin embargo, los injertos ofrece importantes características adicionales. En primer lugar, ofrece una fácil edición interactiva de segmentación y seguimiento de los resultados para comprobar la precisión de datos, en lugar de gating estadística de valores atípicos huellas región tras el análisis. Por otra parte, se extiende el análisis a automatically designado linaje y puntos del ciclo celular de interés de la levadura en ciernes. La determinación de cuando la madre y la hija se dividen para formar dos regiones independientes de células es crucial para la determinación de células enteras (incluyendo cualquier madre brote conectado) mediciones en todo el ciclo celular 8. La suite consta de tres módulos para realizar estas tareas. Las primeras regiones celulares segmentos basados ​​en el contraste entre las imágenes de campo claro enfocadas y desenfocadas, y permite al usuario definir y visualmente comprobar los parámetros de segmentación. El segundo pistas (. Utilizando Blair y ejecución MATLAB del Crocker et al IDL rutina de Dufresne, disponible en: <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a> ) y medidas de las regiones celulares a través del tiempo; asigna automáticamente linajes, y permite la inspección visual y corrección de errores. Una sencilla interfaz gráfica de usuario trazado se incluye a las propiedades de una sola célula de la consulta. El tercer módulo atribuye la yema aparición y división times, y da salida a datos de series temporales de células enteras, así como sus derivados primero y segundo de tiempo (como se discute en 9). El módulo de análisis da salida a los datos como un archivo de texto delimitado por espacios para estudio posterior en el software estadístico de elección. Por lo tanto, el paquete permite al usuario extraer datos de series temporales de alta calidad a través de una interfaz gráfica. Hemos utilizado este método para estimar las tasas de transcripción en tiempo real en células de levadura en ciernes individuales como una función del ciclo celular 9. Mientras que los módulos han sido optimizados para la levadura en ciernes, los parámetros o, si es necesario, el código libremente disponible se puede adaptar para otros organismos y tipos de imágenes. Segmentación, seguimiento, y el linaje algoritmos de asignación pueden ser específicos de los tipos de imagen afectados y el organismo en cuestión. Los algoritmos existentes podrían ser reemplazados, pero todavía conservan la interfaz gráfica de usuario que permite la inspección visual fácil de usar y corrección de errores de segmentación y de seguimiento que invariablemente ocupantesr con cualquier algoritmo.

<table><tbody><tr><td>Y04C placa de perfusión de levadura</td><td>CellAsic</td><td>Y04C-02</td><td></td></tr><tr><td>ONIX plataforma de perfusión microfluídica</td><td>CellAsic</td><td>EV-262</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Microscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objetivo</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>Cascade II Cámara EMCCD</td><td>Fotometría</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de arco de halogenuros metálicos Lumen 200</td><td>PRIOR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro dicroico de paso de banda triple y juego de filtros de excitación y emisión</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>set #89006</td><td>Utilizado para YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)</td></tr><tr><td>Controlador MAC 5000 y ruedas de filtro</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2011a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>La versión de 64 bits maneja archivos de datos grandes mejor que la de 32 bits</td></tr></tbody></table>

la adquisición de fluorescencia time-lapse películas de levadura en ciernes y el análisis de la dinámica de una sola célula con injertos

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo se ha convertido en una herramienta poderosa en el estudio de muchos procesos biológicos a nivel de una sola célula. En particular, las películas que representan la dependencia temporal de la expresión génica dar una idea de la dinámica de su regulación, sin embargo, hay muchos desafíos técnicos para la obtención y el análisis de las películas de fluorescencia de las células individuales. Se describe aquí un protocolo simple utilizando un dispositivo de cultivo de microfluidos disponibles comercialmente para generar dichos datos, y una interfaz basada en MATLAB gráfica de usuario (GUI) basada en paquete de software para cuantificar las imágenes de fluorescencia. Los segmentos de software y células pistas, permite al usuario vicario visualmente errores en los datos, y asigna automáticamente linaje y tiempos de división. La interfaz gráfica de usuario analiza aún más la serie de tiempo para producir trazas de células enteras, así como sus derivados primero y segundo tiempo. Mientras que el software fue diseñado para S. cerevisiae, su modularidad y versatilidad deben permitir que to Servir como plataforma para el estudio de otros tipos de células, con algunas modificaciones.

Un experimento llevado a cabo con éxito y analizado producirá series de tiempo sobre todo continua de células enteras individuales con realismo asignado aparición del brote y los tiempos de división. Como un ejemplo, se realizó el protocolo anterior con una cepa de levadura haploide que expresa una copia integrada de la proteína fluorescente Cerulean (PPC) impulsado por el promotor ADH1 constitutivo de observar cómo el crecimiento y la expresión global pueden variar con el tiempo en las células individ...

Se presenta un protocolo sencillo para obtener películas de microscopía de fluorescencia de las células de levadura en crecimiento, y un paquete de software basado en GUI para extraer los datos de series de tiempo de una sola célula. El análisis incluye linaje automático y la asignación por división de tiempo integrado con inspección visual y manual de conservación de los datos de seguimiento.

La adquisición de fluorescencia Time-lapse películas de levadura en ciernes y el análisis de la dinámica de una sola célula con injertos

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener películas de fluorescencia de células individuales de levadura en crecimiento y extraer series temporales de expresión del reportero para cada célula. Esto se logra primero cultivando una monocapa de células en una cámara microfluídica. El segundo paso consiste en realizar microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo para uno o más reporteros.A continuación, las películas se procesan utilizando el paquete de software graft para rastrear y medir las células a lo largo del tiempo. El paso final consiste en analizar las mediciones celulares y las asignaciones de linaje, y exportar las series temporales de expresión del reportero para cada célula completa. En última instancia, se utiliza una tasa de transcripción instantánea inferida a partir de las series temporales de expresión para mostrar los cambios en la transcripción tanto durante el ciclo celular como en respuesta a niveles cambiantes de factores de transcripción.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regulación génica, como por ejemplo qué tan rápidamente responden diferentes promotores a la adición repentina o a la sustracción de un factor

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Deleción del gen y la sobreexpresión de la proteína son métodos comunes para el estudio de las funciones de las proteínas. En este artículo se describe un protocolo para el análisis del fenotipo de desarrollo en función de la concentración de proteínas en la población y de una sola célula en los...

Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Proporcionamos un método básico reproducible para la microscopía a largo plazo del ciclo de vida sexual de la levadura de fisión. Con los pequeños ajustes descritos, el protocolo presentado permite que la investigación se centre en diferentes etapas del proceso reproductivo.

Microscopía de la levadura de fisión del ciclo de vida sexual

La cuantificación precisa de los eventos de tráfico vesicular a menudo proporciona información clave sobre las funciones de proteínas específicas y los efectos de las mutaciones. En este artículo se presentan métodos para utilizar la pHluorina supereclíptica, una variante de GFP sensible al pH, como herramienta para la cuantificación de eventos endocíticos en células vivas mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa y citometría de flujo.

Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

Este artículo presenta un protocolo optimizado para la producción de chips de microfluidos y la configuración de los experimentos de microfluidos para medir la vida útil y los fenotipos celulares de células de levadura individuales.

El uso de dispositivos de microfluidos para Medir Lifespan y Celular fenotipos en células individuales levadura en ciernes

Levadura en ciernes es un modelo ventajoso para el estudio de la dinámica de microtúbulos in vivo debido a sus potentes genética y la simplicidad de su citoesqueleto de microtúbulos. El siguiente protocolo describe cómo transformar células de levadura y la cultura, adquirir imágenes de microscopía confocal, y analizar cuantitativamente la dinámica de microtúbulos en las células vivas de levadura.

Imágenes de alta resolución y análisis de la dinámica de microtúbulos astrales individuales de levadura en ciernes

Este protocolo describe el análisis de compartimentos intracelulares etiquetados fluorescentemente en levaduras en ciernes utilizando microscopía confocal 4D (time-lapse 3D) multicolor. Los parámetros de imagen se eligen para capturar señales adecuadas mientras se limitan los fotodaños. Los plugins Personalizados ImageJ permiten rastrear y analizar cuantitativamente las estructuras etiquetadas.

Microscopía 4D de levadura

Aquí, presentamos imágenes de células vivas que es un método de microscopía no tóxico que permite a los investigadores estudiar el comportamiento de las proteínas y la dinámica nuclear en las células de levadura de fisión viva durante la mitosis y la meiosis.

Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

La levadura de fisión se utiliza aquí como huésped heterólogo para expresar proteínas citoesqueléticas bacterianas como FtsZ y MreB como proteínas de fusión traduccional con GFP para visualizar su polimerización. Además, los compuestos que afectan a la polimerización se identifican mediante imágenes con un microscopio de fluorescencia.

La levadura de fisión como plataforma para el cribado de fármacos antibacterianos dirigidos a las proteínas del citoesqueleto bacteriano

Este protocolo detalla dos métodos de detención del ciclo celular de levadura y liberación opcional, y elabora el uso de microscopía de fluorescencia para estudiar los procesos dependientes del ciclo celular en S. cerevisiae.

Manipulación y análisis de procesos dependientes del ciclo celular en levaduras en ciernes

Aprenda a obtener películas de fluorescencia time-lapse de levaduras en crecimiento y analizar la dinámica de células individuales con el software graft. Este método permite estudiar cambios en la tasa de transcripción durante el ciclo celular.

La adquisición de fluorescencia Time-lapse películas de levadura en ciernes y el análisis de la dinámica de una sola célula con injertos (Video) | JoVE Journal

La adquisición de fluorescencia Time-lapse películas de levadura en ciernes y el análisis de la dinámica de una sola célula con injertos

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