Un quantitativo test per studiare proteine: DNA interazioni, Discover trascrizionali regolatori dell'espressione genica, e identificare nuovi agenti anti-tumorali

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un saggio quantitativo di legame al DNA, utile per esaminare le interazioni proteina-DNA, scoprire regolatori trascrizionali dell'espressione genica e identificare nuovi agenti anti-tumorali. Questo viene realizzato preparando innanzitutto una piastra per saggio rivestita con streptavidina e un opportuno bersaglio di DNA BIOTINILATO. Il secondo passaggio consiste nell'aggiungere proteine da estratti nucleari, con o senza potenziali inibitori, permettendo loro di legarsi al bersaglio di DNA.

Successivamente, i fattori di trascrizione legati vengono rilevati mediante anticorpi primari e anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano. L'ultimo passaggio consiste nell'aggiungere un substrato per la perossidasi di rafano ai pozzetti per indurre lo sviluppo del colore. Infine, lo sviluppo del colore viene misurato con il fotocolorimetro.

Nel tempo, l'entità del cambiamento di colore indicherà il grado di legame al DNA e l'effetto di potenziali inibitori del legame al DNA. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altre, come il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica, è che si tratta di un saggio quantitativo per il legame di inibitori al DNA. Per iniziare, preparare un numero adeguato di colture cellulari costituite da almeno tre volte 10 alla sette cellule per ciascuna condizione testata.

Qui vengono utilizzate cellule endoteliali del midollo osseo umano, che esprimono la proteina run X due. Una volta che le cellule hanno raggiunto una confluenza dell'80%, trattare le cellule con 0,2 microgrammi per millilitro di no conazolo per arrestare la crescita cellulare al confine del ciclo cellulare G due M.

Questo stabilizzerà la proteina di run X due e produrrà un legame massimale con il DNA dopo 16 ore. Lisare le cellule e isolare la proteina come indicato nel protocollo testuale allegato. Una volta isolata la proteina, misurare la concentrazione proteica utilizzando un saggio BCA standard.

Successivamente, conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius in aliquote da 10 microlitri con concentrazioni comprese tra 2 e 5 milligrammi per millilitro. Fissare una piastra a 96 pozzetti con una soluzione 0,1 molare di carbonato di sodio aggiungendo 300 microlitri della miscela per pozzetto. Preparare un numero sufficiente di pozzetti in modo che ogni campione venga analizzato in triplice replicato.

Incubare la piastra per due ore su una piattaforma oscillante a temperatura ambiente. Quindi lavare la piastra tre volte con 300 microlitri di strep avid e buffer di lavaggio e incubare con 100 microlitri di oligonucleotidi a doppio filamento marcati con biotina a 1,25 nanomoli per pozzetto per due ore, agitando. Successivamente, lavare le piastre altre tre volte con il buffer di lavaggio strep din.

Quindi aggiungere 100 microlitri per pozzetto della soluzione madre contenente un buffer di legame XDNA, proteine di legame del DNA a una concentrazione di tre-nove microgrammi per pozzetto e poli DIGC a un microgrammo per pozzetto. Successivamente, aggiungere la soluzione madre contenente un eventuale inibitore, come la vitamina D3, o l'opportuna diluizione del controllo del solvente, come etanolo, nei rispettivi pozzetti. Quindi coprire la piastra e posizionarla su una piattaforma oscillante a quattro gradi Celsius durante la notte, successivamente all'incubazione con gli estratti nucleari.

Lavare la piastra tre volte con il tampone di lavaggio strep avid. Quindi aggiungere 90 microlitri per pozzetto di un anticorpo monoclonale specifico run X due, diluito a 0,2 nanogrammi per microlitro nel tampone di lavaggio strep avid. Coprire la piastra e incubare a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante per un'ora.

Quindi risciacquare nuovamente le pozzette con strep avid e tampone di lavaggio e aggiungere 90 microlitri per pozzetta della miscela di anticorpo secondario contenente cinque nanogrammi per microlitro di anticorpo purificato per affinità specifico per fab coniugato con HRP, diluito nello strep. AVID e tampone di lavaggio. Incubare l'anticorpo secondario per 30 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante.

Quindi lavare sei volte con 300 microlitri per pozzetto di tampone di lavaggio Strp. Successivamente, sviluppare i risultati aggiungendo 50 microlitri di un substrato di tetraetilbenzidina direttamente da la provetta stock in ogni pozzetto per il monitoraggio continuo dei campioni. Posizionare i campioni nello spettrofotometro e misurare l'assorbanza a 635 nanometri in modo continuo.

Per una misurazione singola, incubare i campioni da 10 a 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Durante questo periodo, i pozzetti dovrebbero passare da trasparenti a diverse sfumature di blu. Arrestare la reazione aggiungendo 50 microlitri di acido solforico a ciascuno.

Quindi misurare l'assorbanza di ogni pozzetto a 450 nanometri utilizzando un lettore per piastre a 96 pozzetti. Il grafico mostrato qui è un esempio di monitoraggio continuo dell'effetto della vitamina D biologicamente attiva tre sul legame di run X 2D NA. Le concentrazioni testate hanno avuto un effetto minimo sul legame di run X 2D NA.

Sebbene altri composti di vitamina D tre siano risultati avere effetti drammatici, il composto 5 2 2 1 9 7 5 testato in questo studio è stato identificato mediante progettazione assistita da computer di farmaci. Dopo il test, il composto ha mostrato un'inibizione dipendente dalla dose del legame di rux due, da un nanomolare a 100 micromolari; il 50% del legame di renx 2D NA è stato inibito con soli 0,01 micromolari del composto.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire il saggio di legame al DNA e testare potenziali inibitori del legame al DNA.