Un quantitativo test per studiare proteine: DNA interazioni, Discover trascrizionali regolatori dell'espressione genica, e identificare nuovi agenti anti-tumorali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare un saggio quantitativo di legame al DNA, utile nell'esaminare le interazioni proteina-DNA, scoprire regolatori trascrizionali dell'espressione genica e nell'identificare nuovi agenti antitumorali. Ciò si ottiene preparando prima una piastra di saggio rivestita di streptavidina con un appropriato bersaglio di DNA BIOTINILATO. Il secondo passo consiste nell'aggiungere proteine dell'estratto nucleare con o senza potenziali inibitori e consentire loro di legarsi con il bersaglio del DNA.

Successivamente, i fattori di trascrizione legati vengono rilevati con anticorpi primari e anticorpi secondari accoppiati a perossidasi di rafano. Il passaggio finale consiste nell'aggiungere un substrato di perossidasi di rafano ai pozzetti per ottenere lo sviluppo del colore. In definitiva, lo sviluppo del colore viene misurato con lo spettrofotometro.

Nel tempo, la quantità di cambiamento di colore indicherà il grado di legame del DNA e l'effetto dei potenziali inibitori del legame del DNA. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altre tecniche, come il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica, è che si tratta di un saggio quantitativo di legame con un inibitore del DNA. Per iniziare, preparare un numero adeguato di colture cellulari composte da almeno tre volte 10 alle sette cellule per ogni condizione testata.

Qui vengono utilizzate cellule endoteliali del midollo osseo umano, che esprimono la proteina run X due. Una volta che le celle sono confluenti all'80%. Trattare le cellule con 0,2 microgrammi per millilitro, senza conazolo per arrestare la crescita cellulare al confine del ciclo cellulare G due M.

Questo stabilizzerà la proteina run X 2 e produrrà il massimo legame con il DNA dopo 16 ore. Licare le cellule e isolare la proteina come indicato nel protocollo di testo allegato. Una volta isolata la proteina, misurare la concentrazione proteica utilizzando un test standard di BCA.

Quindi conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius in aliquote da 10 microlitri con concentrazioni comprese tra due e cinque milligrammi per millilitro. Fissare una piastra a 96 pozzetti con una soluzione molare 0,1 di carbonato di sodio aggiungendo 300 microlitri della miscela per. Bene Preparare abbastanza bene in modo che ogni campione venga eseguito in triplice copia.

Incubare la piastra per due ore su una piattaforma oscillante a temperatura ambiente. Quindi lavare la piastra tre volte con 300 microlitri di strep avid e lavare il tampone e incubare con 100 microlitri di oligonucleotidi a doppio filamento marcati con biotina a 1,25 nanomoli per pozzetto per due ore durante l'oscillazione. Quindi, lavare le piastre altre tre volte con il tampone di lavaggio strep din.

Quindi aggiungere 100 microlitri per pozzetto della miscela master contenente un tampone legante XDNA, proteine leganti il DNA a tre-nove microgrammi per pozzetto e poli DIGC a un microgrammo per pozzetto. Quindi aggiungere la miscela master contenente qualsiasi potenziale inibitore come la vitamina D tre o l'appropriata diluizione del solvente di controllo, come l'etanolo, ai rispettivi pozzetti. Quindi coprire la piastra e posizionarla su una piattaforma a dondolo a quattro gradi Celsius durante la notte dopo l'incubazione con gli estratti nucleari.

Lavare la piastra tre volte con lo streptococco avid e il tampone di lavaggio. Quindi aggiungere 90 microlitri per pozzetto di una corsa X due anticorpi monoclonali specifici diluiti a 0,2 nanogrammi per microlitro e tampone strep avid e wash. Coprire la piastra e incubarla a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo per un'ora.

Quindi sciacquare nuovamente i pozzetti con strep avid e tampone di lavaggio e aggiungere 90 microlitri per pozzetto della miscela di anticorpi secondari contenente cinque nanogrammi per microlitro di anticorpo coniugato HRP purificato per affinità specifica fab diluito nello streptococco. AVID e tampone di lavaggio. Incubare l'anticorpo secondario per 30 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo.

Quindi lavarlo sei volte con 300 microlitri per pozzetto di Strp e tampone di lavaggio. Successivamente, sviluppare i risultati aggiungendo 50 microlitri di un substrato di tetraetilbenadina a ciascun pozzetto direttamente dal flacone di riserva per il monitoraggio continuo dei campioni. Posizionare i campioni nello spettrofotometro e misurare l'assorbanza a 635 nanometri in modo continuo.

Per una misurazione una tantum, incubare i campioni per 10-20 minuti a temperatura ambiente al buio. Durante questo periodo, i pozzetti dovrebbero cambiare da chiari a vari gradi di blu. Arresta la reazione aggiungendo 50 microlitri di acido solforico a ciascuno.

Misurare quindi l'assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nanometri utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti. Il grafico mostrato qui è un esempio di monitoraggio continuo dell'effetto della vitamina D 3 biologicamente attiva sul legame run X 2D NA. Le concentrazioni testate hanno avuto scarso effetto sul legame run X 2D NA.

Sebbene altri composti della vitamina D abbiano dimostrato di avere effetti drammatici. Il composto 5 2 2 1 9 7 5 testato qui è stato identificato utilizzando la progettazione di farmaci assistita da computer. Dopo il test, il composto ha mostrato un'inibizione dose-dipendente del legame rux two da un nanomolare a 100 micromolari Il 50% del legame renx 2D NA è stato in grado di essere inibito con solo 0,01 micromolari del composto.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come eseguire il test di legame del DNA e testare potenziali inibitori del legame del DNA.