Name: 合成，细胞和交货在体内的树状为基础的pH值传感器应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: 了解基于树状大分子的荧光pH传感器合成方法，用于活细胞和体内成像。该技术通过电穿孔递送传感器，结合共聚焦显微镜实现高时空分辨率的pH测量，适用于神经科学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

谨此感谢 Isja de Feijter 和 Matt Baker 有益的讨论。

1. 传感器的合成
<ol>
	<li>在下述部分中，我们提供了一种将 pH 指示剂与 PAMAM 树状大分子偶联的实验方法。该相同方案经微小修改后也可适用于其他含氨基的树状大分子5,17,13,14。市售的树状大分子和染料可直接使用，无需进一步纯化。</li>
	<li>将树状大分子溶解于无水 DMSO 中（终浓度为 50 μM）。用无水 DMSO 配制 10 mM 的荧光素-NHS 和四甲基罗丹明-NHS（TMR）储备液。</li>
	<li>向树状大分子溶液中加入所需量的荧光素和 TMR。混合物中的摩尔比将决定负载在树状大分子上的染料量。通常，在微量离心管中取 1 ml G4 PAMAM 树状大分子溶液，加入 8 当量（40 μl）荧光素和 8 当量（40 μl）TMR。室温下搅拌反应 12 小时。</li>
	<li>用去离子水将反应液稀释 10 倍，然后将溶液转移至透析袋（截留分子量 MWCO = 10 kDa）中。用去离子水透析 24 小时，期间频繁更换透析液。</li>
	<li>将透析后的溶液转移至样品瓶中，冷冻干燥 24 小时，应得到紫色粉末。称量所得固体，并将其溶解于 milliQ 水中，配制成终浓度为 10 μM 的溶液。分装后于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
2. 体外 pH 测量
<ol>
	<li>对于 体外 校准：在石英比色皿中配制浓度为500 nM的树状大分子PBS（2 mM磷酸盐）溶液。建议使用极稀的PBS缓冲液（2 mM），以避免滴定过程中pH值发生剧烈变化。</li>
	<li>测量荧光素（激发波长 488 nm）和TMR（激发波长 550 nm）的发射光谱，并优化荧光计的光学设置以获得良好的信噪比。</li>
	<li>通过逐次加入少量 0.1 N NaOH 和 0.1 N HCl 进行 pH 滴定。每次加入后轻轻振荡比色皿以充分混匀，静置 1 分钟使体系平衡，然后使用 pH 微电极测量 pH 值。在每一步骤中，均应在不改变光学设置的情况下记录荧光素和 TMR 的发射光谱。</li>
	<li>绘制滴定过程中荧光强度随 pH 的变化曲线。罗丹明信号应不受 pH 影响（&#60;10%）。荧光素信号应呈S形曲线，并使用pK值为6.4的单结合模型进行拟合。</li>
</ol>
3. 细胞培养与电穿孔
<ol>
	<li>在添加了10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素（Invitrogen）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HeLa细胞。将细胞培养物置于37 °C、含5% CO2的湿化环境中培养。</li>
	<li>进行树状大分子电穿孔时，当细胞达到汇合状态，移除培养基，并用DPBS（杜尔贝科磷酸盐缓冲液）洗涤细胞。移除DPBS后加入胰蛋白酶-EDTA。用含血清但不含抗生素的培养基中和胰蛋白酶。在室温下以900–1,200 rpm离心2分钟。移除培养基后用DPBS重悬细胞沉淀并洗涤。</li>
	<li>计数细胞并取4×106个细胞，在室温下以1,200–1,500 rpm离心2分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于200 μl微穿孔缓冲液（由微穿孔仪制造商提供）中，并转移至1.5 ml微量离心管。</li>
	<li>将树状大分子水溶液加入重悬的细胞中。每份样品所需的树状大分子用量取决于PAMAM类型（阳离子型通常为250 nM，中性树状大分子为2 μM）。</li>
	<li>在微穿孔管中加入电穿孔缓冲液（由微穿孔仪制造商提供）。使用100 μl体积规格的电穿孔吸头吸取细胞与树状大分子的混合物。将微穿孔仪吸头插入吸头支架中。设置微穿孔脉冲参数：脉冲电压 = 1,005 V；脉冲宽度 = 35 msec；脉冲次数 = 2。</li>
	<li>脉冲处理后，将细胞转移至1.5 ml微量离心管中，在1,200 rpm下离心5分钟，以去除培养基中过量的树状大分子。将10 μl电穿孔后的细胞接种至35 mm玻璃底培养皿（WillCo-dish GWSt-3522）中，并加入不含抗生素的新鲜培养基。</li>
</ol>
4. 活体 HeLa 细胞中的 pH 检测
<ol>
	<li>电穿孔后12小时，使用共聚焦显微镜观察细胞。</li>
	<li>可使用标准的荧光素和罗丹明滤光片组。若具备可调滤光片，可将绿色通道设置为500–550 nm，红色通道设置为580–650 nm。荧光素的最佳激发波长为488 nm，而罗丹明可使用543 nm或561 nm激光线进行成像。</li>
	<li>对样本进行聚焦，并调节激光功率和探测器增益，以最大化信噪比。若电穿孔成功，细胞在两个通道中均应呈现明亮的荧光。荧光定位取决于所用树状大分子的大小和电荷。由于内吞作用或区室化，常可见部分溶酶体定位（即核周小囊泡）。若溶酶体定位占主导，i.e. 大部分荧光定位于囊泡内，而胞质中信号微弱，则提示存在毒性，应舍弃该次测量结果。两个通道应顺序采集，必要时可多次采集图像并进行平均，以提高图像质量。</li>
	<li>为进行校准，使用含离子载体、不同pH值的缓冲液钳制细胞pH，并按上述方法每pH值至少采集20个细胞。有关该操作步骤及缓冲液组成的详细描述，请参见Bizzarri及其同事的研究16。建议至少在pH = 5.5至pH = 7.5范围内测量5个点。pH低于6的条件对细胞具有毒性，仅可短暂耐受，建议尽快完成图像采集。若细胞出现凋亡迹象，应舍弃该样本并重新开始实验。</li>
	<li>使用ImageJ或类似软件进行数据分析。导入绿色和红色通道的图像，扣除背景，并利用&#34;图像计算器&#34;工具生成逐像素的比值图像。</li>
	<li>绘制感兴趣区域（ROI），选择目标细胞，并测量其胞内绿红荧光比值。分析所有采集的图像，然后将比值对pH作图。在pH 5.5至7.5范围内，趋势应呈线性。对所得数据点进行线性拟合，即可获得校准曲线，用于将绿红比值转换为pH值。</li>
	<li>作为进一步对照，采集多个未经处理的细胞（不含离子载体），尝试利用所得校准曲线计算pH值，结果应在7.2至7.4之间。</li>
</ol>
5. 体内 样品制备
<ol>
	<li>在出生后第 28 至 70 天的 C57Bl/6J 小鼠（雄性和雌性）上进行实验。通过腹腔注射乌拉坦（i.e. 乙基氨基甲酸酯）（生理盐水配制的 20% w/v 溶液，剂量为 20 mg/kg）麻醉小鼠。实验结束后，通过过量注射乌拉坦并随后进行心内注射相同麻醉剂处死动物。</li>
	<li>术中给予地塞米松磷酸钠肌内注射（2 mg/kg 体重），以减轻皮层应激反应和脑水肿。</li>
	<li>剃除动物头部毛发，并在头皮上涂抹 2.5% 利多卡因凝胶。</li>
	<li>使用剪刀剪开覆盖双侧颅骨的皮肤瓣。</li>
	<li>用生理盐水清洗暴露的骨面，并用镊子轻轻去除骨膜。这将为胶水和牙科水泥提供更好的粘附基础。</li>
	<li>将定制的钢制头固定装置（带有中央成像腔室）放置于目标皮层区域上方，使其大致与颅骨平行，并使用氰基丙烯酸酯胶水粘合，再用白色牙科水泥（Paladur）固定。</li>
	<li>固定小鼠头部，以便在目标区域进行直径为 2–3 mm 的颅骨开窗手术。</li>
	<li>手术过程中应尽量减少皮层加热、硬脑膜撕裂或出血。</li>
	<li>持续用无菌人工脑脊液（ACSF）灌流皮层表面（含 126 mM NaCl、3 mM KCl、1.2 mM KH2PO4、1.3 mM MgSO4、26 mM NaHCO3、2.4 mM CaCl2、15 mM 葡萄糖、1.2 mM HEPES 的去离子 H2O 溶液，pH = 7.4）。</li>
</ol>
6. 小鼠脑组织中的 pH 成像
<ol>
	<li>实验过程中辅助动物呼吸以提供氧气2富氧空气。氧气浓度可富集至80%。O2 通过调节气道压和气流以获得适当的呼吸辅助。使用反馈控制的加热毯将体温维持在恒定的37 °C。</li>
	<li>通过双光子成像装置物镜下的钢柱固定动物。</li>
	<li>为了将传感器注入大脑皮层，需使用含有氯化银电极（尖端直径4 mm）的玻璃移液管，并装载树状大分子溶液（1 μM）。该电极可用于记录细胞外场电位。</li>
	<li>使用显微注射装置将移液管插入皮层，深度约为 150 μm。在 0.5 psi 的压力下注射 1–2 分钟。</li>
	<li>优化成像光学系统。应调整激光功率以尽量减少光漂白和光损伤。通常使用的激光功率约为20 mW，光电倍增管（PMT）增益保持恒定在667 V，因为先前的校准结果显示该电压可获得最佳信噪比。</li>
	<li>成像时，在820 nm激发传感器，并通过标准的FITC和TRITC滤光片同时检测荧光素和罗丹明荧光。</li>
	<li>以2 Hz的频率采集时间分辨测量的时间序列图像。</li>
	<li>为进行背景校正，需在激光快门关闭的条件下采集暗场图像，以测量光电倍增管（PMTs）产生的平均热噪声以及电子系统通常添加的基底信号。</li>
	<li>数据分析请遵循第4节中所述的相同步骤。</li>
</ol>

<ol><li>Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fluorescent+Toolbox+for+Assessing+Protein+Location+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of biological chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+reviews%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for intracellular pH.</a> Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).</li>
<li>Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+ion+imaging+using+fluorescent+dyes%3A+artefacts+and+limits+to+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution.</a> Pflügers Archiv: European journal of physiology. 420 (5-6), 595-602 (1992).</li>
<li>Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+and+Subcellular+Targeting+of+Dendrimer-Based+Fluorescent+pH+Sensors+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18158-18167 (2010).</li>
<li>Lee, C. C., MacKay, J. A., Fréchet, J. M. J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+dendrimers+for+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Designing dendrimers for biological applications.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1517-1526 (2005).</li>
<li>Lee, C. C., Gillies, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+dose+of+doxorubicin-functionalized+bow-tie+dendrimer+cures+mice+bearing+C-26+colon+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A single dose of doxorubicin-functionalized bow-tie dendrimer cures mice bearing C-26 colon carcinomas.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16649-16654 (2006).</li>
<li>Caminade, A. -M., Turrin, C. -O., Majoral, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimers+and+DNA%3A+combinations+of+two+special+topologies+for+nanomaterials+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%28Weinheim+an+der+Bergstrasse%2C+Germany%29%22%5BJournal%5D)">Dendrimers and DNA: combinations of two special topologies for nanomaterials and biology.</a> Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 14 (25), 7422-7432 (2008).</li>
<li>Rakow, N. A., Suslick, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+sensor+array+for+odour+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A colorimetric sensor array for odour visualization.</a> Nature. 406 (6797), 710-713 (2000).</li>
<li>Armada, M. P. G., Losada, J., Zamora, M., Alonso, B., Cuadrado, I., Casado, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocatalytical+properties+of+polymethylferrocenyl+dendrimers+and+their+applications+in+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry+%28Amsterdam%2C+Netherlands%29%22%5BJournal%5D)">Electrocatalytical properties of polymethylferrocenyl dendrimers and their applications in biosensing.</a> Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands). 69 (1), 65-73 (2006).</li>
<li>Finikova, O., Galkin, A., Rozhkov, V., Cordero, M., Hägerhäll, C., Vinogradov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin+and+tetrabenzoporphyrin+dendrimers%3A+tunable+membrane-impermeable+fluorescent+pH+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Porphyrin and tetrabenzoporphyrin dendrimers: tunable membrane-impermeable fluorescent pH nanosensors.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (16), 4882-4893 (2003).</li>
<li>Albertazzi, L., Serresi, M., Albanese, A., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimer+internalization+and+intracellular+trafficking+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells.</a> Molecular pharmaceutics. 7 (3), 680-688 (2010).</li>
<li>Albertazzi, L., Mickler, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+bioactivity+of+internally+functionalized+cationic+dendrimers+with+PEG+cores%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores.</a> Biomacromolecules. , (2012).</li>
<li>Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+Functionalization+of+Dendrimers+Regulates+Internalization+and+Intracellular+Trafficking+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells.</a> Bioconjugate chemistry. , (2012).</li>
<li>Sakadzić, S., Roussakis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nature. 7 (9), 755-759 (2010).</li>
<li>Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+GFP-based+ratiometric+excitation+and+emission+pH+indicator+for+intracellular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies.</a> Biophysical journal. 90 (9), 3300-3314 (2006).</li>
<li>Albertazzi, L., Brondi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimer-based+fluorescent+indicators%3A+in+vitro+and+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications.</a> PloS one. 6 (12), e28450(2011).</li>
<li>Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+Trackable+Dendritic+Scaffolds+and+Delivery+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (15), 3425-3429 (2011).</li>
<li>Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intracellular+chloride+and+pH+measurements+using+a+GFP-based+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor.</a> Nature methods. 7 (7), 516-518 (2010).</li>
<li>Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+Needle+in+a+Haystack%3A+Identification+of+EGFP+Tagged+Neurons+during+Calcium+Imaging+by+Means+of+Two-Photon+Spectral+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+molecular+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96(2012).</li>
<li>Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seizure+termination+by+acidosis+depends+on+ASIC1a%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a.</a> Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Molecular+Probes+Handbook%2C+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , 11th, (2010).</li>
</ol>

默认： 作者无任何利益冲突需要披露。

成功使用基于树状大分子的传感器进行pH成像的关键步骤包括：i）选择合适的树状支架及其偶联的指示剂数量，以及ii）优化传感器在细胞内的递送方案 体内
合成过程相当简便，几乎可适用于所有含氨基的超支化聚合物。该类传感器可通过市售的树状大分子和NHS活化染料一步法获得。我们相信，这种模块化且直接的合成方法将有利于此类传感器在多种生物学问题研究中的进一步应用。未结合染料可通过透析有效去除，实现产物的纯化。树状支架的选择至关重要，需根据具体应用需求而定。已有研究表明，不同类型的树状大分子由于与细胞内结构存在特异性相互作用，表现出独特的细胞内定位行为。中性树状大分子（例如乙酰化的PAMAM G4）在细胞内无明显相互作用，呈现弥散性分布，因此是全细胞成像的理想选择。相反，不同代数（G2至G6）的带正电荷树状大分子则会与带负电的生物分子发生静电相互作用，即 RNA）从而实现特异性细胞定位。因此，阳离子型树状大分子非常适用于细胞器特异性成像。
传感染料的选择至关重要。多种pH指示剂和pH不敏感染料具有不同的发...

荧光分子用于标记特定的生物学相关分子，彻底改变了我们研究生物系统的方式。宽场显微镜和共聚焦显微镜实现了对生物过程的实时高分辨率可视化，如今已成为研究生物事件最常用的技术之一 体外，在细胞中 体内.1 荧光指示剂的开发代表了一项重要改进， 即 其荧光依赖于特定分子实体浓度的染料。尤其是pH值和钙离子指示剂，由于H⁺和Ca²⁺在细胞生理学中具有极其重要的作用，这些指示剂对细胞生理学研究产生了巨大影响+ 和 Ca2+ 生物学中的离子2,3
然而，大多数传感染料因其小分子特性而存在若干内在局限性，例如：i）难以实现亚细胞器靶向；ii）在水中溶解度差，因而生物相容性差；iii）易从细胞中泄漏，从而无法进行长时间的延时成像。4 此外，许多探针的信号无法校正染料浓度依赖性的影响（非比率成像），因此难以在细胞内进行绝对定量测量 体内 是不可能的。
我们最近描述了一种简单且有效的策略，以克服这些局限性，该策略基于将传感染料偶联到树状大分子支架上。5 树状大分子是一类单分散的超支化聚合物，具有非常理想的生物学应用特性。6 特别是，已有多种树状结构被开发并用于药物7和基因递送。8 直到最近，才有多个研究团队开始探索这些分子作为传感装置支架的潜力。9,10,11
我们先前描述了一种基于NHS活化酯对不同聚酰胺-胺（PAMAM）支架进行功能化的简便合成路线。12 通过仅采用透析作为纯化手段，即可一步获得偶联产物。有趣的是，该方法可轻松应用于多种树枝状或聚合物支架。13,14
为了实现比率成像，树枝状大分子用两组染料进行双重标记：i) 一种pH指示剂（即荧光素）和ii) 一种pH无关的荧光基团（即罗丹明）。这使得我们能够进行精确的pH成像，因为荧光素与罗丹明的比值仅依赖于pH，而不再受探针浓度的影响。解决该问题的另一种有趣方法是使用基于荧光寿命的探针15。由于荧光寿命不依赖于探针浓度，这类测量无需进行比率校正。然而，寿命测量需要更复杂的仪器装置，且其时间分辨率对于快速生理过程而言不够理想，从而限制了其潜在应用范围。
为了进行细胞内成像，需要将探针递送穿过质膜进入细胞质。由于树枝状大分子因其尺寸和亲水性而无法穿透细胞膜，因此可通过电穿孔实现细胞内递送。该技术在生物学转染中被广泛应用，可高效地将标记的大分子递送入细胞，从而实现高质量成像。此外，电穿孔可避免树枝状大分子通过内吞作用进入细胞所带来的复杂性，因为大分子可被直接递送至细胞质中。有趣的是，电穿孔后，即使不含任何特异性靶向序列，不同的树枝状大分子在细胞内仍表现出不同的定位分布5。这种仅由树枝状大分子理化性质决定的被动靶向效应，可用于实现细胞器特异性的pH成像。
比率成像可通过共聚焦显微镜实现。将共价连接至树状支架的荧光素和罗丹明分别成像，并生成逐像素的比率图。已有多种利用离子载体控制活细胞内pH值的方法被报道。离子载体是一类能够跨质膜转运离子的小型疏水性分子；针对H+ 离子，例如尼日里菌素（nigericin），有售并可用于校准基于树状大分子的传感器。16 这些测量结果显示出对 pH 的线性响应，与所观察到的现象相似。 体外根据校准结果，细胞内pH值可被准确测量。这些测量结果表明，基于树状大分子的传感器在研究H+ 活细胞中的稳态及涉及pH调节功能障碍的病理过程。
我们最近证明，基于树状大分子的 pH 传感器也可被应用 体内在麻醉小鼠的脑组织中进行pH成像。17 由于活体组织环境的复杂性，需要高质量 体内 传感在技术上具有挑战性。本文展示了以下实验方案的详细描述： 体内 脑部pH成像及其准确实施过程中需重点关注的关键问题。双光子显微镜被采用主要基于两个原因：i）红外光的使用克服了传统共聚焦显微镜组织穿透能力不足的局限；ii）荧光素和罗丹明具有宽广的双光子吸收谱，可实现同时激发，避免了使用两种不同激发波长所带来的复杂性。在小鼠脑组织中成功实施了pH测量；传感器能够快速响应由缺氧引起的脑细胞外空间pH变化。这些测量结果表明，基于树状大分子的指示剂可有效用于揭示pH的生理与病理变化。 体内 在动物模型中。

<table><tbody><tr><td>PAMAM G4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>412449</td><td></td></tr><tr><td>羧基荧光素 NHS 酯</td><td>Life technologies</td><td>C-1311</td><td></td></tr><tr><td>TMR NHS 酯</td><td>Life technologies</td><td>C-1171</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>透析袋</td><td>Spectrum Labs</td><td>132117</td><td></td></tr><tr><td>WillCo 培养皿</td><td>WillCo Wells</td><td>GWSt-3512</td><td></td></tr><tr><td>氨基甲酸乙酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td></td></tr></tbody></table>

合成、细胞递送及 在体 树状大分子基ph传感器的应用

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

荧光探针的发展为生命科学领域带来了一场革命。具有感应能力的基因编码荧光蛋白和合成荧光染料使得生物相关物质能够以高空间和时间分辨率被可视化。合成染料因其高度可调性以及可检测分析物的广泛范围而备受关注。然而，这些小分子存在若干局限性，包括溶解性差、靶向困难，通常无法进行比率成像。本文介绍了基于树状大分子的传感器的开发，并提供了一种用于pH测量的实验方案。

关键词：荧光探针，基因编码荧光蛋白，合成染料，感应能力，空间分辨率，时间分辨率，可调性，分析物，小分子行为，溶解性，靶向，比率成像，树状大分子，pH测量 体外，在活细胞中 体内我们选择树状大分子作为传感器的理想平台，因其具备多种理想特性（单分散性、可调控的性质、多价性），使其成为多种生物医学装置中广泛使用的支架结构。将荧光pH指示剂与树状大分子支架偶联后，显著提升了其传感性能。特别是树状大分子表现出更低的细胞泄漏、更优的细胞内靶向性，并可实现比率型测量。这些新型传感器已成功用于活体HeLa细胞内的pH测定。 体内 在小鼠脑中。

图1展示了将传感染料与不同树状支架连接的示意图。这些所得到的探针可通过一步简便的合成方法，由市售产品制备得到。将含氨基的树状大分子与NHS活化的染料在DMSO中反应，再通过透析纯化。该通用方法已成功用于标记多种树状大分子：i) 第2、4和6代PAMAM树状大分子12；聚乙二醇修饰的PAMAM树状大分子17以及PEG-树状杂合体18。由于不同的树状大分子与细胞和组织的相互作用（如定位、毒性、通透性和扩散性）各不相同，因此树状结构的选择与预期应用及目标样本密切相关。
传感器包含两组荧光染料：i）pH 指示剂和 ii）作为内部参比的 pH 不敏感基团。尽管有多种指示剂和参比物质可供选择，但使用荧光素和四甲基罗丹明所获得的结果最为理想。通过在反应中使用不同摩尔当量，即可简单调节两种染料的比例。 图2 显示一个典型的 体外 pH传感器的滴定。荧光素和罗丹明可分别在488 nm和550 nm处激发，从而最大限度地减少两个通道之间的串扰。如图所示...

荧光传感器是生命科学中的有力工具。本文介绍了一种合成和使用基于树状大分子的荧光传感器以测定活细胞内pH值的方法 体内树突状支架可增强共轭荧光染料的性能，从而改善其传感特性。

合成、细胞递送及 在体 树状大分子基pH传感器的应用

荧光指示剂的发展为生命科学领域带来了一场革命。具有感应功能的基因编码和合成荧光团……

以下实验的总体目标是开发基于Dun鼓手（Dun drummers）的新型荧光传感器，以改善其在活细胞体外及体内pH成像中的性能。该目标首先通过将pH敏感染料与树状支架以及其他官能团（如靶向基团或pH不敏感染料）进行共轭连接来实现，随后进行体外测量以生成pH校准曲线，进而用于活细胞内的pH成像。通过电穿孔递送传感器，并利用共聚焦显微镜对脑细胞外空间的pH进行成像，从而生成pH图谱。在生理和病理神经活动期间，将传感器微量注射至麻醉小鼠的脑内，随后使用双光子显微镜采集荧光数据。实验结果表明，基于荧光的传感器能够在活细胞及体内以高空间和时间分辨率成功检测 pH 值的变化。尽管已有多种具有 pH 敏感特性的荧光染料被使用，但这些染料存在若干缺陷，例如细胞内移动性差和易发生细胞泄漏。此外，它们也无法实现快速的绝对值定量测量。本文展示了将pH敏感性染料与D基因支架结合的方法，由于该方法能够实现高空间和时间分辨率的精确测量，因此可作为研究活细胞中由pH调控的生理与病理过程的有效工具。神经系统中pH调节的紊乱与中风、癫痫等多种疾病状态相关，而现有的pH传感器效果不佳，这促使了本研究中所述传感器的设计。尽管本方法在此处应用于pH成像，但它是一种通用策略，也可拓展至其他具有生物学意义的分子物种的检测。通过选择荧光传感染料，这种简便且通用的合成方法使得这些操作流程变得简单直接。今天演示该实验步骤的人员为 Giovanni re、Barbara ti、Marco Brody 和 Sebastian Suli。将 pH 指示剂与 Piam Demers 进行偶联时，首先将引物溶解于无水 DMSO 中，终浓度为 50 µM。在微量离心管中，用无水DMSO配制浓度为10微摩尔的荧光素NHS和四乙基罗丹明NHS（又称TMR）储备液。将1毫升G4聚酰胺-胺树状大分子溶液与8当量（即40微升）的荧光素及8当量（即40微升）的TMR混合。混合物中的摩尔比将反映染料在树状大分子上的负载量。室温下搅拌该溶液12小时。接下来，用去离子水将混合物按1:10稀释，将反应混合物装入截留分子量为10千道尔顿的透析袋中，用去离子水透析，并在24小时内更换三次透析液。次日，将溶液转移至玻璃小瓶中，在-80℃下冷冻数小时。待溶液完全冻结后，将小瓶转移至冷冻干燥机中，冷冻干燥24小时。应得到紫色粉末，呈波浪状固体，将其溶解于超纯水中，终浓度为10微摩尔。将溶液分装至1.5毫升微量离心管中，每管50微升，于-20摄氏度保存。进行体外校准，需在石英比色皿中用2毫摩尔磷酸盐缓冲液（PBS）配制500纳摩尔的D drummer溶液。使用极稀的PBS缓冲液以避免滴定过程中pH值发生剧烈变化。测定荧光素和TMR的发射光谱，并优化荧光分光光度计的光学参数，以获得良好的信噪比。接下来，通过加入少量 0.1 N 氢氧化钠和 0.1 N 盐酸进行 pH 滴定。每次加入后，振荡 Q vet 以混匀。等待一分钟使其平衡，然后使用 pH 计测量 pH 值。每一步骤均应记录荧光素和TMR的微电极发射光谱，且不得有任何改变。在光学设置中，绘制荧光强度随pH变化的曲线。在滴定过程中，杆状结构域信号应不受pH影响。荧光素信号应呈S形曲线，并使用单结合模型进行拟合，电穿孔的PK值为6.4。将六次10的5次方个HeLa细胞转移至72微升溶液中，加入1.5毫升微量离心管，使细胞重悬。加入浓度为2微摩尔的树状大分子或水溶液，再向微量纯化管中加入3毫升电穿孔缓冲液。然后使用10微升电穿孔枪头吸取细胞与引物混合物。接着，将微量移液器插入移液器工作站，并在此处设定微电穿孔脉冲条件。脉冲电压设定为1005伏特。脉冲宽度设置为35毫秒，脉冲次数在脉冲板后设置为两次。将20微升电穿孔后的细胞接种到含新鲜培养基（不含抗生素）的玻璃底培养皿中。电穿孔12小时后，使用针对荧光素和罗丹明的标准滤光片组，通过共聚焦显微镜观察细胞。聚焦样品，调节激光功率和探测器增益，以最大化信噪比。如果电穿孔成功，细胞在两个通道中均应呈现明亮的荧光。定位情况取决于所用D的大小和电荷。通常如此。由于内吞作用或共区室化，可见小的核周囊泡中存在Sun溶酶体定位。若溶酶体定位占主导，即大部分荧光信号位于囊泡内部，而细胞质中可见孔信号，则表明存在毒性，相关测量结果应予弃用。依次采集两个通道，采集多幅图像并进行平均以提高图像质量。为生成pH校准曲线，使用在不同pH条件下含有opfor的缓冲液，使细胞内和细胞外的pH值保持一致。每个pH值下至少采集20个细胞的图像，并在pH 5.5至pH 7.5范围内测量至少五个pH点。需注意pH B六对细胞具有毒性，但可短暂耐受，因此应尽可能缩短成像时间。若观察到细胞凋亡迹象，应弃用该批细胞并重新开始实验。成像完成后。使用 ImageJ 或类似软件进行数据分析。首先，确定绿色与红色的比值。然后将该比值对 pH 作图，得到一条线性趋势，从而获得标准曲线，可用于在后续实验中将比值转换为 pH 值。进行活体样本制备时，选用出生后28至70天的C57BL/6J雄性小鼠和雌性小鼠。用乌拉坦麻醉小鼠后，实施足趾挤压以确认动物已完全麻醉，并涂抹眼膏以减少皮层应激反应和脑水肿。手术期间，按每公斤体重2毫克的剂量，肌肉注射地塞米松磷酸钠。接下来，使用手术剪刀剃除动物头部的毛发，然后放置手术巾，并在头皮上涂抹2.5%利多卡因凝胶。用剪刀剪开覆盖两侧大脑半球颅骨的皮瓣。用生理盐水冲洗暴露的骨面，并用镊子轻轻去除骨膜。这将提供更好的粘附表面。使用胶水和牙科水泥时，安装一个定制的钢制头柱，其带有中央成像腔，并用氰基丙烯酸酯将头柱粘附固定，位置大致与颅骨平行，覆盖目标皮层区域。用白色牙科水泥将头柱固定到位。固定小鼠头部，并在目标区域钻取直径为2至3毫米的颅骨窗。钻孔过程中需频繁使用注射器向颅骨施加新鲜无菌人工脑脊液（aCSF），以尽量减少手术期间皮层的热损伤。完成颅骨开窗后，将动物转移至成像平台，使头部在物镜下保持稳定。将成像室旋紧至可调节支架上。连接一个自制的塑料面罩至氧气供应端，该面罩用于在实验过程中提供富氧空气，以辅助动物呼吸。为了将传感器注入大脑皮层，使用尖端直径为四毫米的玻璃微量移液管，并装入氯化银电极。使用一微摩尔的drimmer ER溶液时，该电极将有助于通过微注射装置记录细胞外场电位。将移液管插入皮层，深度约为150微米。以每平方英寸0.5磅的压力注射一到两分钟，以优化成像的光学设置。调整激光功率以最小化光漂白和光损伤。通常使用的激光功率约为20毫瓦，且光电倍增管（PMT）增益保持在667伏特恒定不变。将激光波长设置为820纳米以激发传感器，并通过标准的FTSE和Trit滤光片，指导软件同时检测荧光素和罗丹明的荧光信号。同时将采集频率设置为每秒2帧，用于背景校正。在激光快门关闭的情况下采集暗场图像，以测量PMT和基底产生的平均热噪声。最后，采集pH依赖性荧光图像并储存以供后续分析。按照之前的方法分析数据，以评估荧光素和鲁明在体外的行为。将负载后的微粒置于荧光分光光度计上，进行pH滴定。该图展示了一个典型的pH传感器滴定过程。荧光素和鲁明可分别在488纳米和550纳米处被激发，从而在两个通道之间实现最小的串扰，这一点可以清楚地观察到。荧光素表现出pH依赖性行为，而R domine信号在生理pH范围内无明显变化。因此，这两个信号的比值不依赖于传感器浓度，而仅取决于pH值。为了将指示剂递送至细胞内，采用电穿孔法将Dedere传感器导入HeLa细胞，并按照本视频所述方法进行共聚焦成像。这些共聚焦图像在左侧显示的是荧光素通道的细胞，在中间显示的是R domine通道的细胞，右侧则以pH比值图的形式呈现。观察到强烈的荧光素和罗丹明信号，二者共定位，表明传感器结构完整。通过将两幅图像逐像素相除重建比率图，并以伪彩色标度表示。为校准传感器在细胞内的响应，采用离子载体进行pH钳定，如下所示。指示剂对 pH 值变化响应迅速，其绿色与红色的比值随之改变。所得数据用于绘制校准曲线，以实现精确的 pH 值测量。校准曲线呈现的线性趋势表明，该传感器能够响应 pH 值变化，且不受细胞环境干扰。为了展示树状大分子传感器如何用于活体成像，对注射了树状大分子的麻醉小鼠脑部进行了pH成像。使用820纳米激发光同时获取荧光素和罗丹明信号，并基于像素逐点构建比值图，方法类似于活细胞测量。值得注意的是，这些指示剂定位于细胞外空间，图像中无荧光的区域对应细胞体或微小血管，可用于验证传感器对pH的响应。我们采用了高碳酸血症方法。事实上，二氧化碳已知可改变血液和组织中碳酸盐缓冲系统的平衡，从而导致组织酸化。如本图所示，吸入30%的二氧化碳足以引发传感器产生强烈反应，且在恢复对小鼠通气后，该反应可完全逆转。这些结果表明，基于er的传感器在揭示活细胞和体内pH的生理及病理变化方面具有巨大潜力。此外，我们的实验方案可与其他测量方法（如电生理记录）兼容，从而能够同时获得有关正在进行的生物过程的互补信息。该方法在建立后，为细胞生物学和神经生物学领域的研究人员探索培养细胞及活体中受pH调控的过程铺平了道路。

synthesis-cellular-delivery-vivo-application-dendrimer-based-ph

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

合成，细胞和交货<em&gt;在体内</em&gt;的树状为基础的pH值传感器应用

我们介绍了基于磷光猝灭的氧气检测原理，并综述了用于生物系统中氧气成像的卟啉类树状纳米传感器的设计。...

生物系统中用于氧成像的磷光纳米探针的合成与标定

本文详细介绍了基于微针的多重传感器的构建方法。该装置正在被开发用于对多种分析物进行原位采样和电化学分析，具有快速且选择性高的特点。我们预期这类基于微针的传感器将在临床医学和生物医学研究中得到应用。...

基于中空微针的多通道透皮电化学传感传感器

可生物相容的pH响应型溶胶-凝胶纳米传感器可被整合至聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）电纺支架中。所制备的自报告支架可用于 在 原位...

用于三维细胞培养的自报告支架

使用溶液法合成不对称的二茂铁化合物具有挑战性。本报告重点介绍通过固相合成法，采用简便且洁净的反应制备二茂铁-生物素生物偶联物的方法。实验表明，引入硫醇盐基团可赋予该化合物在金表面固定化的能力。...

通过固相树脂法合成不对称二茂铁衍生的生物共轭体系的方法学

本方案描述了一种树状磁共振成像（MRI）对比剂的制备与表征方法，该对比剂携带基于环烯的巨环螯合物，可配位顺磁性钆离子。通过一系列MRI实验...

制备与 体外 用于磁共振成像的树状大分子对比剂的表征

我们介绍一种利用两亲性聚合物和DNA对近红外荧光单壁碳纳米管（SWNTs）的晕相进行工程化改造的实验方案，旨在开发针对尚无已知识别元件的分子靶标的传感器。...

在单壁碳纳米管上利用仿生聚合物构建分子识别系统

本文描述并应用了一种制备基于树状大分子的非均匀纳米图案的方法，该方法可实现对局部精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）表面密度的纳米尺度调控，用于研究细胞黏附和软骨发生分化。...

基于树状大分子的非均匀纳米图案用于局部调控表面黏附性：一种引导软骨细胞定向分化的技术方法

本文介绍了一种利用分子印迹技术结合电容型生物传感器检测和定量复杂溶液中低丰度分子的实验方案。...

基于分子印迹电容型生物传感器的生物标志物超灵敏检测

DetectSyn：一种快速、无偏倚的荧光方法用于检测突触密度的变化

本方案描述了一种由CRISPR-Cas介导的多组分合成尿液生物标志物检测方法，可通过体外分析肿瘤相关蛋白酶活性，实现癌症的即时诊断。...

基于CRISPR-Cas的多组分合成尿液生物标志物检测用于便携式诊断

本研究旨在提供一份实用指南，帮助研究人员使用溶剂浇铸法（也称为微模塑法）制备自己的 DMAP...

通过溶剂浇铸法制备的可溶性微针阵列贴片及基于微针的生物医学器件的关键表征

了解基于树状大分子的荧光pH传感器合成方法，用于活细胞和体内成像。该技术通过电穿孔递送传感器，结合共聚焦显微镜实现高时空分辨率的pH测量，适用于神经科学研究。

合成、细胞递送及在体树状大分子基pH传感器的应用

探索更多视频

合成、细胞递送及 在体 树状大分子基pH传感器的应用

探索更多视频

合成、细胞递送及在体树状大分子基pH传感器的应用