Allo steady-state, Pre-steady-state, e Single-fatturato di misura cinetica per il DNA Glycosylase Activity

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare i tassi di escissione di otto OXO Guinea e il rilascio di prodotto per otto OXO Guine, DNA glicosilato umano utilizzando tecniche cinetiche rapide. Ciò si ottiene misurando prima un andamento temporale in stato stazionario con una bassa concentrazione di enzimi per determinare se si verifica una fase rapida durante il primo turnover. Se il primo turnover è rapido, l'andamento temporale allo stato stazionario non estrapola a zero, ma riflette invece la concentrazione dell'enzima attivo come secondo passo.

Il tasso di formazione del prodotto durante lo stato prestazionario può essere misurato mediante tecniche di miscelazione rapida e tempra con una concentrazione enzimatica più elevata per osservare una quantità significativa di prodotto durante il primo turnover. Successivamente, la fase chimica può essere monitorata anche in condizioni di singolo turnover in cui il substrato è saturo di enzima. Al fine di isolare gli eventi nel sito attivo dell'enzima senza cicli catalitici, i risultati mostrano che il rilascio di prodotto dall'enzima è limitante durante lo stato stazionario sulla base dell'osservazione che l'andamento temporale non estrapola a zero prodotto al tempo zero.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riparazione delle labbra del DNA. Ciò include l'influenza della struttura del DNA, il ruolo dei residui del sito attivo, l'effetto degli ioni metallici e delle proteine accessorie cellulari sulla chimica e sul rilascio del prodotto. In primo luogo, preparare il substrato di DNA a doppio filamento contenente otto OXO G mescolando cinque oligonucleotidi marcati con fam prime six con il suo filamento complementare con un rapporto molare da uno a 1,2 in un tampone in ginocchio in un tubo microfuge da 1,5 millilitri.

Mettere il tubo in un galleggiante in acqua bollente per cinque minuti. Lasciare raffreddare lentamente l'acqua a temperatura ambiente prima di rimuovere il tubo dal galleggiante. Preparare separatamente il substrato di DNA e le soluzioni OG G one in tampone di reazione in provette micro fuge da 1,5 millilitri su ghiaccio.

Si noti che la concentrazione di DNA è di 400 nanomolari e la concentrazione apparente di Ogg uno è di 30, 60, 90 o 120 nanomolari, come determinato da un saggio di Bradford sulle proteine. Dopo che le provette di reazione sono state rimosse dal ghiaccio, preincubare ciascuna soluzione posizionando la provetta in un blocco termico impostato a 37 gradi Celsius per un minuto. Successivamente, iniziare la reazione mescolando volumi uguali del substrato di DNA e delle soluzioni OG one per ottenere le concentrazioni finali di 200 nano molari di DNA e 15, 30, 45 o 60 nanomolari OG G. Rimuovere le aliquote da 10 microlitri agli intervalli di tempo indicati e spegnere la reazione mescolando con un microlitro di idrossido di sodio molare come controllo per i corsi temporali.

Mescolare 10 microlitri della miscela di reazione senza enzima con un microlitro di idrossido di sodio molare. Posizionare i campioni di reazione in un blocco termico a 90 gradi Celsius per cinque minuti per scindere il sito AP del prodotto risultante. Dopo il riscaldamento, aggiungere un microlitro di acido cloridrico molare per neutralizzare ogni campione.

Successivamente, aggiungere 12 microlitri di tampone di caricamento del gel a ciascun campione di reazione, quindi posizionare la miscela in un blocco termico impostato a 95 gradi Celsius. Dopo due minuti, rimuovere il tubo dal blocco termico e metterlo sul ghiaccio. Caricare cinque microlitri di ciascun campione su un gel di poliacrilammide denaturante al 15%.

Una volta che il gel è stato analizzato, scansionarlo utilizzando un imager in grado di rilevare il DNA marcato in fluorescenza e visualizzare il substrato e le bande del prodotto. Dopo l'imaging del gel, quantificare le bande se si osserva una scissione del fondo dopo il trattamento del substrato con idrossido di sodio, sottrarre questo fondo dalla quantità misurata di ciascun prodotto di reazione. Quindi, traccia la quantità di prodotto formata ad ogni tempo di reazione.

Analizza i dati grezzi utilizzando la seguente equazione per determinare un nodo, l'ampiezza del burst e VSS la pendenza della fase lineare allo stato stazionario Traccia l'intercetta Y rispetto alla concentrazione totale di proteine. Fornire una misura della frazione attiva dell'enzima. Utilizzare un adattamento lineare con un'intercetta zero per fornire il fattore di correzione per determinare la frazione di enzima attivo.

Quindi tracciare lo stato stazionario rispetto alla concentrazione dell'enzima attivo, fornendo la costante del tasso di associazione del prodotto in due provette micro fuge separate da cinque millilitri. Preparare 400 substrati di DNA nanomolare e 80 soluzioni ogg one attive nanomolari in tampone di reazione come descritto in precedenza. Collegare un bagnomaria circolante allo strumento a flusso di estinzione rapida e impostare la temperatura a 37 gradi Celsius.

Successivamente, regolare i parametri dello strumento e selezionare il circuito di reazione appropriato per i punti temporali desiderati. Secondo le istruzioni del produttore, preparare il tampone di reazione e 142 soluzioni di estinzione di idrossido di sodio. In siringhe monouso lure lock da 10 millilitri.

Collegare una siringa con idrossido di sodio alle porte di azionamento e impostare le valvole in posizione di carico. Caricare i serbatoi di azionamento con idrossido di sodio nella siringa Q per rimuovere le bolle d'aria dalla siringa. Lavora la soluzione avanti e indietro più volte.

Quindi, collegare le siringhe con il tampone di reazione alle porte dell'unità e caricare il tampone nelle siringhe. B, allo stesso modo con tutte le valvole in posizione di fuoco, abbassare il motore passo-passo fino a toccare la parte superiore delle siringhe. Con le valvole di carico del campione in posizione di lavaggio, lavare i circuiti del campione, il circuito di reazione e la linea di uscita con acqua e metanolo.

Successivamente, asciugare completamente gli anelli e la linea di uscita sciacquandoli con aria. Fai un buco nella parte superiore di un tubo da 1,5 millilitri con tappo. Utilizzando un ago calibro 16, collegare il tubo alla linea di uscita tramite un tubo per raccogliere la reazione temprata.

Quindi, imposta la reazione desiderata. Tempo in secondi utilizzando la tastiera. Dopo che il motore passo-passo si è riattivato, posizionare gli stantuffi della siringa B contro la piattaforma del motore passo-passo aggiungendo il tampone con le siringhe monouso attaccate alle porte di azionamento.

Riempire le siringhe monouso lure lock da un millilitro rispettivamente con il substrato di DNA e le soluzioni ogg one. Con le valvole del campione in posizione di carico, collegare le siringhe con il substrato di DNA e applicare una soluzione a ciascuna delle porte di carico del campione, quindi riempire i loop del campione con le soluzioni impostate. Tutte le valvole di carico della siringa e le valvole di carico del campione in posizione di fuoco avviano la reazione premendo il tasto G.

Una volta premuto il tasto G, il motore passo-passo spinge la parte superiore delle siringhe per avviare e spegnere la reazione. Dopo 36 microlitri della reazione, la miscela è stata automaticamente spenta con 86 microlitri di 142 millimolari. Idrossido di sodio: raccogliere il campione dalla linea di uscita.

Una volta completata la reazione, impostare le valvole di carico della siringa in posizione di carico e le valvole di carico del campione in posizione di lavaggio. Lavare i circuiti dei campioni, il circuito di reazione e la linea di uscita con acqua e metanolo e asciugare completamente le aree lavate. Ripetere i passaggi precedenti per ogni punto temporale.

Per determinare una correzione dello sfondo. Eseguire un esperimento di controllo senza enzima utilizzando lo strumento di estinzione rapida. Riempire il circuito del campione di DNA con il substrato del DNA, ma mantenere vuoto il ciclo del campione ogg one.

Imposta il tempo di reazione. Eseguire la miscelazione e la tempra utilizzando le stesse condizioni di prima. Lavare i loop del campione con due molari di idrossido di sodio, due molari di acido cloridrico e metanolo, quindi asciugare le linee lavate.

Dopo aver impostato il motore passo-passo in posizione iniziale, portare le valvole di carico della siringa in posizione di carico e lavare i serbatoi di azionamento con acqua. Dopo aver riscaldato i campioni di reazione temprati, separare il substrato e il DNA del prodotto mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante al 15%. Quindi visualizza e quantifica le bande sul gel come descritto.

In precedenza si adattavano i corsi temporali della formazione del prodotto mediante analisi di regressione non lineare alla seguente equazione con un aumento esponenziale e termini lineari che forniscono la costante di velocità del primo ordine K osservata l'ampiezza del burst, un nodo e una VSS di velocità lineare. Per l'esperimento del singolo corso temporale del turnover. Preparare 100 substrati di DNA nanomolare e 500 nanomolari attivi ogg one soluzioni in provette separate da 1,5 millilitri.

Utilizzando le condizioni precedentemente descritte, preparare lo strumento a flusso di estinzione rapida e condurre la reazione nello stesso modo e nell'esperimento di andamento temporale pre-stazionario. Una volta che i campioni temprati sono stati riscaldati e separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide, visualizzare e quantificare le bande sul gel come descritto in precedenza. Infine, adattare l'andamento temporale della formazione del prodotto a un singolo esponenziale per determinare la costante di velocità del primo ordine come indicato nell'equazione seguente.

L'analisi cinetica allo stato stazionario è stata eseguita utilizzando 200 nanomolari di un substrato di DNA e quattro diverse concentrazioni di ogg. Uno come determinato da un saggio proteico di Bradford. Il prodotto scisso e il substrato scisso sono stati separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide.

I corsi temporali della formazione del prodotto sono stati adattati a un'equazione lineare per determinare l'intercetta Y, che erano rispettivamente 2,2 1115 e 26 nanomolari rispetto a ciascuna concentrazione proteica, le intercette Y sono state ulteriormente tracciate rispetto a ciascuna concentrazione proteica effettiva. La frazione dell'enzima attivo è stata determinata al 38% dalla pendenza della linea per determinare il tasso di stato stazionario. I valori VSS determinati in precedenza sono stati tracciati rispetto alle intercette Y.

La pendenza della linea era di 0,0028 al secondo, che equivale alla costante di velocità di dissociazione per il prodotto formato dalle attività di collegamento del DNA glicosillato. È stato seguito un andamento temporale pre-stazionario utilizzando 200 nano molari, substrato di DNA e 40 nanomolari OG attivi. L'andamento temporale della formazione del prodotto può essere adattato a un'equazione con termini esponenziali e lineari crescenti.

Kay ha osservato e koff sono stati determinati rispettivamente a 0,75 e 0,0055 al secondo. In condizioni di singolo turnover, la reazione di escissione di otto Oxo g è stata completata entro sei secondi. L'andamento temporale della formazione del prodotto potrebbe essere adattato a una singola equazione esponenziale e produrre un K osservato di 0,74 al secondo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i passaggi chiave durante il ciclo catalitico e misurare i tassi di chimica e di turnover enzimatico.