Name: Microfluidic On-chip Capture-cicloaddizione Reazione di immobilizzare reversibilmente piccole molecole o strutture multi-componenti per applicazioni Biosensor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-23T18:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Scopri come immobilizzare reversibilmente piccole molecole e nanoparticelle funzionalizzate su chip sensori SPR utilizzando chimica cicloadditiva bioortogonale. Questo metodo rapido consente analisi di interazione molecolare con rigenerazione della superficie.

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1. Preparazione di GST e nanoparticelle (NP) coniugati <ol><li> GST-TCO preparazione: <ol><li> Aggiungere 8 ml di soluzione di TCO-NHS (50 mM in DMSO) a 100 ml di GST (1 mg / ml in PBS) e agitare la miscela a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Rimuovere il reagente in eccesso utilizzando una colonna di spin dissalazione Zeba. Il filtrato recuperato contenente il coniugato GST-TCO viene conservato a 4 ° C prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> GST-Tz preparazione: <ol><li> Aggiungere 6 ml di soluzione Tz-NHS (25 mM in DMF) a 75 ml di GST (1 mg / ml in PBS) e agitare la miscela a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Diluire la miscela di reazione con 25 ml di PBS e purificare utilizzando una colonna di spin dissalazione. Il filtrato contenente coniugato GST-Tz è conservato a 4 ° C prima dell&#39;uso. </li></ol> Nota: le analisi di massa (MALDI-TOF) ha mostrato che in media ~ 10 Tz o TCO molecole sono stati coniugati al GST. </li><li> NP-TCO preparazione: <ol><li> Aggiungere 100 ml di soluzione TCO-NHS (50 mm in DMSO) per150 ml di nanoparticelle amminato (NP-NH 2, 8,7 mg Fe / ml in PBS, nucleo di ferro 3 nm ~ 8.000 Fe / NP) e agitare la miscela a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso di reagente per filtrazione su gel usando una colonna NAP-10 eluita con tampone PBS. Raccogliere la banda colorata contenente il prodotto NP-TCO. </li><li> Concentrare il filtrato fino ad un volume finale di ~ 150 microlitri utilizzando un dispositivo di filtro centrifugo (100 k MWCO). </li><li> Aggiungere 50 ml di anidride succinica, (0,1 M in DMSO) alla soluzione NP-TCO ed agitare a temperatura ambiente per 1 ora (anidride reagisce con i rimanenti ammine per formare acidi carbossilici terminali. Ciò impedisce interazioni non specifiche con la superficie destrano). </li><li> Purificare il prodotto NP-TCO utilizzando una colonna NAP-10 eluendo con PBS. Conservare la soluzione di NP-TCO a 4 ° C prima dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione della superficie Tutti i saggi di risonanza plasmonica di superficie vengono eseguite su uno strumento Biacore T100 (GE Healthcare) a25 ° C utilizzando un chip sensore CM5 e PBS-P come tampone di corsa se non diversamente specificato. Biacore di controllo e di valutazione del software fornito con lo strumento sono impiegati per la creazione di esperimenti e analisi dei dati. Due modalità di funzionamento, maghi applicazione ed eseguire manuale saranno utilizzati per la preparazione delle superfici e monitoraggio on-chip di cattura-cicloaddizione. La modalità di metodo costruttore sarà utilizzato per la creazione di orientamento esperimenti di legame inverso e per misurare velocità di reazione di cicloaddizione. I dati sono il doppio di riferimento sottratto e analisi cinetiche vengono eseguite utilizzando un modello di Langmuir vincolante 1:1. <ol><li> Utilizzare il modello wizard ammina immobilizzazione e selezionare immobilizzazione su cellule di flusso 1 (di riferimento) e 2 (rivelazione). Modifica metodo ammina per attivare gruppi carbossilici superficiali mediante iniezione di una soluzione 0,4 M 1:1 EDC: 0,1 M NHS per 480 secondi ad una portata di 10 microlitri / min. Impostare l&#39;iniezione di etanolamina per placare rimanenti esteri attivati ​​a 420 sec il tempo di contatto auna portata di 10 microlitri / min. </li><li> Input nome ligando, anti-GST (18 ug / ml in tampone acetato, pH 5,0) e impostare per iniettare per un tempo di contatto di 420 sec con una portata di 10 microlitri / min. </li><li> Posizionare flaconcini soluzione necessaria in reagente rack 2 assicurandosi abbinare le posizioni con l&#39;elenco dei contenuti. Salva e avvia l&#39;immobilizzazione. Nota: Esecuzione della procedura guidata immobilizzazione in questo modo si traduce in livelli di immobilizzazione anti-GST nell&#39;intervallo ~ 14.000 a 17.000 RU. </li><li> Modificare la procedura guidata immobilizzazione di iniettare solo GST legante soluzione (20 mg / ml) per 420 secondi a 5 ml / min sopra cella di flusso di riferimento 1. </li></ol> 3. Monitoraggio on-chip cattura-cicloaddizione di molecole funzionalizzate <ol><li> Monitoraggio on-chip cattura-cicloaddizione in tempo reale (Figura 2). <ol><li> Posizionare GST-TCO (20 mg / ml), Tz-BnNH 2 (10 micron) e rigenerazione (glicina 10 mM, pH = 2.0) flaconi di soluzioni in reagente rack 2. Selezionare l&#39;uomometodo run manuale, impostare la portata a 5 ml / min e la portata percorso di flusso cella 2. </li><li> Iniettare la soluzione di GST-TCO per 420 sec. </li><li> Iniettare la soluzione di Tz-BnNH 2 per 600 sec. </li><li> Rigenerare la superficie con due iniezioni di 30 secondi di soluzione di rigenerazione. </li></ol></li><li> Monitoraggio montaggio su chip di strutture multi-componente in tempo reale (Figura 3): <ol><li> Posizionare GST-Tz (20 mg / ml), NP-TCO (100 mg Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 micron) e rigenerazione (glicina 10 mM, pH = 2.0) flaconi di soluzioni in reagente rack 2. Selezionare il metodo di esecuzione manuale dello strumento, impostare la velocità di flusso di 5 ml / min e il percorso del flusso di flusso cella 2. </li><li> Iniettare una soluzione di GST-Tz per 60 sec. </li><li> Iniettare una soluzione di NP-TCO per 60 sec. </li><li> Iniettare una soluzione di Tz-BnNH 2 per 60 sec. </li><li> Rigenerare la superficie con due iniezioni di 30 secondi di soluzione di rigenerazione. </li></ol></li></ol> 4. MONITORAGGIO immobilizzazione densità e la determinazione di cicloaddizione Tariffe <ol><li> Caratterizzazione delle piccole velocità di reazione di cicloaddizione molecola (Figura 4). <ol><li> Selezionare i nuovi parametri generali di metodo e di input. Nel pannello passaggi del test creare un nuovo passo e il nome del campione. Impostare l&#39;Scopo e Collegare le impostazioni di base per campione. </li><li> Nel pannello tipi di ciclo Creare un nuovo passo ciclo ed inserire i seguenti comandi: Capture, Campione, Rigenerazione 1 e Rigenerazione 2. </li><li> Selezionare il comando Capture, nome dell&#39;ingresso ligando (GST-TCO, 20 mg / ml), tempo di contatto 120 sec a 5 ml / min e il percorso del flusso impostato su: Second. Selezionare il comando di esempio; ingresso 180 sec Tempo di contatto, 60 sec tempo dissociazione, portata 30 ml / min e il percorso del flusso impostato: Entrambi. Selezionare il comando Rigenerazione 1; rigenerazione di input nome della soluzione (10 mM glicina-HCl pH 2.0), tempo di contatto di 30 secondi a 30 ml / min e il percorso del flusso impostato su: Second. Ripetere la stessa per la rigenerazione 2 comando. &lt;/ Li&gt; <li> Selezionare Esegui il programma di installazione e il percorso del flusso impostato: 2-1. Selezionare il prossimo e riempire la lista campione con una soluzione di analita (Tz-BnNH 2) e serie di concentrazioni (0,3-10 micron, 1:2). Seleziona accanto a rack pannello di posizione. Fiale di soluzione Luogo in reagente rack 2 e serie di diluizioni in piastra a 96 pozzetti assicurandosi abbinare le posizioni con l&#39;elenco dei contenuti. Salvare metodo template e iniziare saggio di legame. Associazione dati e analisi cinetica sono mostrati in Figura 4. </li></ol></li><li> Caratterizzazione di NP velocità di reazione di cicloaddizione (Figura 4). <ol><li> Aprire il modello metodo salvato da sopra e modificare i seguenti parametri. Selezionare il pannello Acquisizione, cambio di nome ligando di GST-Tz, 20 mg / ml. Selezionare il pannello di esempio, il cambiamento tempo di contatto di 120 sec tempo di contatto e il tempo di dissociazione di 120 sec. </li><li> Selezionare l&#39;elenco di esempio, cambiare analita serie di concentrazioni (7-224 nM, 1:2) NP-TCO e. Fiale di soluzione Luogo in cremagliera del reagente2 e serie di diluizioni in piastra a 96 pozzetti assicurandosi abbinare le posizioni con l&#39;elenco dei contenuti. Salvare metodo template e iniziare saggio di legame. Associazione dati e analisi cinetica sono mostrati in Figura 4. </li></ol></li></ol> 5. Misurare il legame di FKBP12 per AP1497 Immobilizzato Reverse orientamento studi di legame impiegano FKBP12 come l&#39;analita e AP1497 composto come ligando immobilizzato (Figura 5). Il metodo generale per questo dosaggio è impostato come segue utilizzando lo strumento metodo costruttore: <ol><li> Selezionare i nuovi parametri generali di metodo e di input. Nel pannello passaggi del test creare e nome Capture, esempio e rigenerazione passi. Selezionare corrispondente Finalità e Collegare le impostazioni di base. </li><li> Selezionare pannello Tipi di ciclo e di creare 3 fasi del ciclo: Capture, esempio e rigenerazione. </li><li> Inserire il comando Capture due volte sotto passo ciclo Capture. Selezionare Capture 1 pannello e selezionare soluzione di acquisizione come variable, impostare il tempo di contatto di 300 sec ad una portata di 5 ml / min e il percorso di flusso impostato: Second. Selezionare il pannello Acquisizione 2 e selezionare la soluzione di acquisizione come variabile, impostare il tempo di contatto a 250 secondi a una velocità di flusso di 5 ml / min e il percorso del flusso impostato su: Second. </li><li> Inserire il comando del campione sotto il passo ciclo di campionamento. Selezionare il pannello Campione; set tempo di contatto di 60 secondi, tempo dissociazione di 200 sec ad una portata di 30 microlitri / min e percorso di flusso impostato: Entrambi. </li><li> Inserire il comando Rigenerazione due volte sotto il gradino ciclo di rigenerazione. Selezionare il pannello Rigenerazione 1; rigenerazione di input nome della soluzione (10 mM glicina-HCl pH 2.0), tempo di contatto di 30 secondi a 30 ml / min e il percorso del flusso impostato su: Second. Ripetere la stessa per il pannello Rigenerazione 2. </li><li> Selezionare Esegui il programma di installazione e il percorso del flusso impostato: 2-1. Selezionare i nomi soluzione di acquisizione entro e ingresso (GST-TCO e AP1497-TZ), nome del campione (FKBP12), serie di concentrazioni (0,020-5 mcg / ml, 1:2) e MW (13.000). Fiale di soluzione posto in reagent rack 2 e serie di diluizioni in piastra a 96 pozzetti assicurandosi abbinare le posizioni con l&#39;elenco dei contenuti. Salvare metodo template e iniziare saggio di legame. Dati di analisi cinetica sono mostrati in Figura 5. </li></ol> 6. Misurare il legame di FKBP12 per AP1497 Allegata alla immobilizzato NP Il metodo generale per nanoparticelle immobilizzazione, piccola molecola derivatizzazione e FKBP12 saggio di legame è di set-up come segue utilizzando lo strumento metodo costruttore: <ol><li> Aprire il modello metodo salvato da sopra e modificare. Inserire un comando supplementare Capture dalla fase del ciclo di acquisizione. Selezionare il Capture 1 pannello; deselezionate soluzione di acquisizione come variabile e il nome soluzione di acquisizione 1 (GST-Tz). Set tempo di contatto di 60 secondi a una velocità di flusso di 5 ml / min e il percorso di flusso impostato secondo. Selezionare il pannello Acquisizione 2; deselezionare soluzione di acquisizione come soluzione di acquisizione variabile e il nome 2 (NP-TCO). Tempo impostato contatto per 90 secondi a una velocità di flusso di 5 ml / min epercorso di flusso impostato secondo. Selezionare il pannello Capture 3; deselezionate soluzione di acquisizione come soluzione di acquisizione variabile e 3 Nome (AP1497-Tz). Tempo impostato contatto per 180 sec ad una velocità di flusso di 5 ml / min e il percorso del flusso impostato su Second. </li><li> Selezionare Esegui il programma di installazione e il percorso del flusso impostato: 2-1. Selezionare Avanti due volte. Fiale di soluzione Luogo in reagente rack 2 e serie di diluizioni in piastra a 96 pozzetti assicurandosi abbinare le posizioni con l&#39;elenco dei contenuti. Salvare metodo template e iniziare saggio di legame. Dati di analisi cinetica sono mostrati in Figura 5. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il metodo di cattura-cicloaddizione qui descritta consente una rapida, immobilizzazione reversibile di nanoparticelle modificate e piccole molecole di interazione basato su chip privo di etichetta e studi cinetici. Il protocollo immobilizzazione può essere eseguita in pochi minuti richiedono &lt;10 pM concentrazioni di ligandi piccole molecole. Modulando la concentrazione del ligando e densità di immobilizzazione tempo di contatto può essere strettamente controllata. I nostri dati mostrano che le reazioni bioorthogonal ...

Le reazioni di coniugazione efficienti sono strumenti preziosi per il fissaggio molecole bioattive alle superfici per una varietà di applicazioni biotecnologiche. Recentemente, il bioorthogonal molto veloce [4 +2] reazione di cicloaddizione tra trans-cicloottene (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) è stato utilizzato per etichettare superfici cellulari, strutture subcellulari, anticorpi e nanoparticelle 1. - 7 Qui, usiamo la [4 +2] cicloaddizione reazione in combinazione con la cattura antigene / anticorpo (GST / anti-GST) per le reversibili sintesi on-chip di strutture multi-componente per Surface Plasmon Resonance (SPR) analisi dell&#39;interazione e monitoriamo l&#39; processo in tempo reale (Figura 1). 8,9 In particolare, la strategia cattura-cicloaddizione ha la rigenerazione superficie utilizzando un protocollo prestabilito. 8 Di conseguenza, il montaggio di superficie dei sensori stabili controllanti orientamento ligando e densità per varietà di nuovo saggio Formati è ora possibile. Utilizzoquesta strategia si dimostra l&#39;immobilizzazione di piccole molecole TCO / Tz-derivatizzati e caratterizzare i tassi di cicloaddizione in una varietà di condizioni di buffer. Abbiamo scelto l&#39;interazione noto tra FKBP12 e un AP1497 molecola che si lega FKBP12 10-12 come esempio per verificare che la strategia cattura-cicloaddizione conserva la capacità della piccola molecola di interagire con il proprio obiettivo quando sia direttamente collegato agli antigeni immobilizzati GST o alle nanoparticelle immobilizzati (NPS). Questo metodo offre diversi vantaggi. In primo luogo, l&#39;immobilizzazione reversibile di piccole molecole su chip del sensore è ora possibile. In secondo luogo, TCO / Tz immobilizzazione di piccole molecole consente anche studi di interazione label-free che invertire l&#39;orientamento di studi SPR canoniche, e può fornire una visione complementare di un&#39;interazione vincolante. In terzo luogo, questo metodo consente la sintesi microfluidica di nanoparticelle mirati e valutazione immediata della loro bindinag proprietà. Questo promette di migliorare l&#39;efficienza di valutazione o di screening nanoparticelle mirati, e anche diminuire la quantità di nanoparticelle richiesti. 13-15 Quarto, questo approccio può misurare la cinetica di reazione delle reazioni di cicloaddizione bioorthogonal in tempo reale in flusso continuo. Infine, l&#39;immobilizzazione chimica TCO / Tz è robusta in presenza di siero. Presi insieme, prevediamo che questo approccio versatile sarà ampiamente facilitare la costruzione di superfici sensori stabili per un&#39;ampia varietà di studi microfluidici rilevante per in vitro e in vivo applicazioni cellulari.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Sensor Chip CM5</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1005-30</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di accoppiamento amminico</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1000-50</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di acquisizione GST</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1002-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NAP-10 Colonne</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0854-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GST, liofilizzato in 1X PBS</td><td>Genscript</td><td>Z02039</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>rhFKBP12</td><td>R& D Sistemi</td><td>3777-FK</td><td></td></tr><tr><td>Tensioattivo P-20</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1000-54</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicina 2.0</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1003-55</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Colonna di desalinizzazione Zeba spin</td><td>Thermo</td><td>89882</td><td>7 K MWCO</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4</td><td>Fisher</td><td>UFC810096</td><td>100 K filtro centrifugo</td></tr><tr><td>TCO-OH</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Sintetizzato internamente</td></tr><tr><td>TCO-NHS</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Sintetizzato internamente, *Disponibile in commercio da Click Chemistry Tools # 1016-25</td></tr><tr><td>Tz-BnNH2</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Sintetizzato internamente</td></tr><tr><td>Tz-NHS</td><td>Ref. 8</td><td>764701</td><td>Sintetizzato internamente, *Disponibile in commercio da Sigma Aldrich # 764701</td></tr><tr><td>NP-NH2 = CLIO-NH2</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Sintetizzato internamente</td></tr><tr><td>AP1497, AP1497-Tz</td><td>Rif. 8</td><td></td><td>Sintetizzato internamente</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>SPR Biosensor</td><td>GE Sanità</td><td>Biacore T100</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

microfluidic on-chip capture-cicloaddizione reazione di immobilizzare reversibilmente piccole molecole o strutture multi-componenti per applicazioni biosensor

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Metodi per l&#39;immobilizzazione rapida superficie di piccole molecole bioattive controllanti orientamento e la densità di immobilizzazione sono altamente desiderabile per applicazioni di biosensore e microarray. In questo studio, usiamo un bioorthogonal altamente efficiente covalente [4 +2] reazione di cicloaddizione tra trans-cicloottene (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) per consentire l&#39;immobilizzazione microfluidica di molecole TCO / Tz-derivatizzate . Controlliamo il processo in tempo reale, in condizioni di flusso continuo con risonanza plasmonica di superficie (SPR). Per attivare immobilizzazione reversibile ed estendere la gamma sperimentale della superficie del sensore, si combinano un componente della cattura non covalente antigene-anticorpo con la reazione di cicloaddizione. Alternativamente presentando TCO o Tz porzioni di superficie del sensore, più processi cattura-cicloaddizione sono ora possibile su una superficie del sensore per gli studi di assemblaggio e di interazione on-chip di una varietà di strutture multi-componente. Abbiamo illustrate questo metodo con due diversi esperimenti immobilizzazione su un chip biosensore, una piccola molecola che si lega, AP1497-FK506 binding protein 12 (FKBP12), e la stessa piccola molecola come parte di una nanoparticella situ-funzionalizzati immobilizzato e in.

Dati e cifre sono stati adattati da riferimento 8. Efficiente immobilizzazione reversibile di piccole molecole bioattive con controllo su orientamento e la densità gioca un ruolo chiave nello sviluppo di nuove applicazioni biosensori. Utilizzando la reazione veloce bioorthogonal tra TCO e Tz, si descrive un metodo per l&#39;assemblaggio graduale e rigenerazione di superfici ligando con mantenimento dell&#39;attività biologica. Figura 2 mostra il monitoraggio in tempo reale d...

Vi presentiamo un metodo rapido, immobilizzazione reversibile di piccole molecole e gruppi di nanoparticelle funzionalizzate per Surface Plasmon Resonance (SPR) studi, utilizzando sequenziale acquisizione on-chip bioorthogonal chimica di cicloaddizione e antigene-anticorpo.

Microfluidic On-chip Capture-cicloaddizione Reazione di immobilizzare reversibilmente piccole molecole o strutture multi-componenti per applicazioni Biosensor

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare una strategia rapida e generalizzabile per immobilizzare in modo reversibile piccole molecole e nanoparticelle funzionalizzate sulla superficie di chip sensori. Questo viene ottenuto innanzitutto immobilizzando anticorpi anti-GST su una superficie sensoriale. Come secondo passaggio, l'acquisizione dell'antigene GST.Funzionalizzato con gruppi trans-ciclo, ottina o tetrazina, fornisce una superficie reattiva per successive reazioni di cicloadizione con derivati di piccole molecole della tetsina o coniugati di nanoparticelle di trend-cicloottano, che successivamente vengono funzionalizzati con derivati di piccole molecole della tetsina. Successivamente, la superficie funzionalizzata può essere utilizzata per l'analisi dell'interazione con un bersaglio solubilizzato desiderato. Nell'ultimo passaggio, la superficie viene rigenerata, consentendo cicli successivi di cattura tramite cicloadizione. I risultati ottenuti dimostrano che le reazioni bioortogonali in chip preservano la capacità di piccole molecole immobilizzate o di nanoparticelle funzionalizzate di interagire con il bersaglio FK BP 12, illustrando come questo approccio possa ampliare l'ambito di applicazione della risonanza plasmonica di superficie (SPR).Il vantaggio principale di questa tecnica di edizione del ciclo di cattura su chip è che consente un rapido rilascio reversibile e la mobilizzazione di piccole molecole con controllo dell'orientamento e della densità di mobilizzazione. Tipicamente, il processo di edizione del ciclo di cattura può essere eseguito in pochi minuti, riducendo in modo significativo i tempi di preparazione della superficie. A dimostrazione del procedimento, interverrà Jason Sandler, uno studente del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, aggiungere otto microlitri di una soluzione di T-C-O-N-H-S 50 millimolari in DMSO a 100 microlitri di una soluzione di GST uno milligrammo per millilitro in PBS. Dopo aver agitato la miscela a temperatura ambiente per un'ora, rimuovere il reagente in eccesso utilizzando una colonna di desalting Zeba a rotazione.Successivamente, aggiungere sei microlitri di una soluzione di tetra NHS estere 25 millimolare in DMF a 75 microlitri di una soluzione di GST a un milligrammo per millilitro in PBS e agitare la miscela a temperatura ambiente dopo un'ora. Diluire la miscela di reazione con 25 microlitri di PBS e purificare utilizzando una colonna di desalting a centrifuga. Quindi, aggiungere 100 microlitri della soluzione di T-C-O-N-H-S 50 millimolare a 150 microlitri di una soluzione di nanoparticelle emanate e agitare la miscela nello stesso modo di prima.Dopo aver mescolato, rimuovere il reagente in eccesso mediante filtrazione su colonna con una colonna NAP 10. Eluire con tampone PBS. Raccogliere la banda colorata contenente il prodotto N-P-T-C-O.Trasferire il campione purificato in un tubo da centrifuga contenente un dispositivo di filtrazione centrifuga con cutoff di peso molecolare di 100.000. Successivamente, concentrare il campione a un volume finale di circa 150 microlitri mediante centrifugazione. Aggiungere 50 microlitri di una soluzione 0,1 molare di anidride cianica in DMSO alla soluzione N-P-T-C-O.Dopo aver agitato la miscela a temperatura ambiente per un'ora, purificare il prodotto N-P-T-C-O utilizzando una colonna NAP 10 eluendo con PBS mediante uno strumento a plasma superficiale in risonanza; selezionare l'immobilizzazione sulle celle di flusso uno e due nel modello della procedura guidata di immobilizzazione AM. Modificare il metodo Amin per attivare i gruppi carbossilici superficiali mediante iniezione di una soluzione uno a uno di EDC 0,4 molare e NHS 0,1 molare per 480 secondi. Con un flusso di 10 microlitri al minuto, impostare l'iniezione di etanolammina per quenchare gli esteri attivati residui a un tempo di contatto di 422 secondi a un flusso di 10 microlitri al minuto.Inserire il nome del ligando anti GST e impostare l'iniezione per un tempo di contatto di 420 secondi a una portata di 10 microlitri al minuto. Successivamente, posizionare le provette con la soluzione preparata in precedenza nel supporto reagenti numero due, assicurandosi di far corrispondere le posizioni all'elenco del contenuto, dopo aver assegnato il nome del file e la destinazione in cui verranno salvati i dati.Avviare l'immobilizzazione. Modificare la procedura guidata di immobilizzazione in modo da iniettare soltanto 20 microgrammi per millilitro della soluzione di ligando GST per 420 secondi a cinque microlitri al minuto sulla cella di flusso di riferimento uno. Posizionare i vial contenenti la soluzione di TERAZ olaina 10 micromolare precedentemente preparata di G-S-T-T-C-O-A e la soluzione di rigenerazione nel supporto reagenti due.Selezionare il metodo di esecuzione manuale, impostare la portata a cinque microlitri al minuto e il percorso di flusso sulla cella di flusso due. Iniettare la soluzione G-S-T-T-C-O per 420 secondi, seguita dalla soluzione Teraz Benz Lamine per 600 secondi. Successivamente, rigenerare la superficie con due iniezioni di 32° della soluzione di rigenerazione.Dopo aver posizionato il flaconcino di GST TERAZ zina, N-P-T-C-O, teraz Belamina e soluzione di rigenerazione nel rack dei reagenti numero due, selezionare il metodo di esecuzione manuale dello strumento, quindi impostare la portata a cinque microlitri al minuto e il percorso del flusso sulla cella di flusso due. Iniettare una soluzione di GST Tetra zina per 60 secondi, seguita da una soluzione di N-P-T-C-O per 60 secondi. Infine, iniettare una soluzione di tetras zina belamina per 60 secondi.Al termine, rigenerare la superficie nello stesso modo di prima. Successivamente, selezionare un nuovo metodo e inserire i parametri generali, che includono raccolta dati, rilevamento della velocità, compartimento del campione, temperatura, unità di concentrazione e impostazioni del tampone. Nel pannello dei passaggi del saggio, creare un nuovo passaggio e denominarlo campione.Quindi impostare lo scopo e collegare le impostazioni al campione nel pannello dei tipi di ciclo, creare un nuovo passaggio di ciclo e inserire i seguenti comandi. Catturare la rigenerazione del campione uno e la rigenerazione due. Selezionare il comando di cattura e inserire G-S-T-T-C-O come ligando.Impostare 120 secondi come tempo di contatto, cinque microlitri al minuto come velocità di flusso e selezionare il percorso di flusso secondario. Quindi selezionare il comando campione e inserire un tempo di contatto di 182 secondi, un tempo di dissociazione di 62 secondi, una velocità di flusso di 30 microlitri al minuto e impostare il percorso di flusso su entrambi.Successivamente, selezionare il comando di rigenerazione e inserire la soluzione di rigenerazione. Impostare un tempo di contatto di 32° a 30 microlitri al minuto e impostare il percorso del flusso sul secondo. Ripetere la stessa procedura per la rigenerazione.Selezionare due comandi per impostare ed eseguire, quindi impostare il percorso di flusso su due trattino uno. Selezionare successivo e compilare l'elenco dei campioni con la soluzione analitica di tetra Belamina e una serie di concentrazioni da 1,5 a 20 micromolari con un'effettuazione da uno a due. Quindi selezionare successivo per accedere al pannello della posizione del rack.Dopo aver posizionato le fiale della soluzione nel secondo rack dei reagenti, preparare la serie di diluizioni in una piastra a 96 pozzetti, assicurandosi di far corrispondere le posizioni all'elenco dei contenuti.Salvare il modello di metodo e avviare il saggio di legame. Dopo aver selezionato un nuovo metodo e i parametri generali, creare e denominare i passaggi del campione di cattura e di rigenerazione nel pannello dei passaggi del saggio. Successivamente, selezionare lo scopo corrispondente e collegare le impostazioni di base.Quindi selezionare il pannello dei tipi di ciclo e creare tre fasi di ciclo: acquisizione, campionamento e rigenerazione. Inserire il comando di acquisizione due volte sotto il ciclo di acquisizione.Passare al pannello di cattura uno. Selezionare la soluzione di cattura come variabile. Impostare quindi il tempo di contatto a 300 secondi a una portata di cinque microlitri al minuto e impostare il percorso di flusso al secondo nel pannello di cattura due.Selezionare la soluzione di cattura come variabile. Impostare il tempo di contatto a 250 secondi con un flusso di cinque microlitri al minuto e impostare il percorso del flusso su seconda. Successivamente, inserire il comando del campione nel passaggio del ciclo di campionamento.Selezionare il pannello del campione e impostare il tempo di contatto a 60 secondi. Impostare il tempo di dissociazione a 200 secondi con un flusso di 30 microlitri al minuto e selezionare il percorso di flusso su entrambi. Inserire il comando di rigenerazione due volte nel passaggio del ciclo di rigenerazione, selezionare il pannello di rigenerazione uno, inserire la soluzione di rigenerazione.Indicare un tempo di contatto di 30 secondi a 30 microlitri al minuto e impostare il percorso di flusso su seconda. Ripetere la stessa procedura per la rigenerazione. Selezionare due pannelli, eseguire e impostare il percorso di flusso su due trattino uno, selezionare successivo e inserire G-S-T-T-C-O e teraz AP 1, 497 coniugato come nomi della soluzione di cattura, FKBP 12 come nome del campione e da 1,5 a 96 nanomolari con una diluizione uno a due come serie di concentrazioni.Dopo aver posizionato le fiale della soluzione nel supporto reagenti numero due e la serie di diluizioni in una piastra a 96 pozzetti, salvare il modello del metodo e avviare il saggio di legame. L'immobilizzazione reversibile efficiente di molecole organiche bioattive, con controllo dell'orientamento e della densità, svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di nuove applicazioni per biosensori. Qui viene mostrato il monitoraggio in tempo reale dell'immobilizzazione di teraz zine Benzoin.Viene iniettata una soluzione di G-S-T-T-C-O su una superficie con anticorpo anti-GST pre-immobilizzato, determinando un aumento di circa 400 RU. In risposta, una seconda iniezione con Teraz zine Benzo Lamine mostra un rapido incremento di 15 RU. Non è stata osservata dissociazione dell'antigene dopo il passaggio al running buffer, evidenza a sostegno della stabilità strutturale.La superficie è stata rigenerata nell'ultima fase del ciclo per consentire cicli ripetuti di cattura. Utilizzando questo procedimento e sostituendo il residuo di tetrazina benzilammina con il coniugato terazina AP 1,497, si genera una superficie bioattiva, che viene utilizzata per studi di interazione con il suo bersaglio. L'interruzione dell'interazione tra anticorpo e antigene da parte di FK BP 12 rigenera la superficie anti-GST, permettendo l'assemblaggio di una nuova molecola.In questo caso, un'iniezione di teraz-zina GST TERAZ è seguita da un'iniezione di N-P-T-C-O, immobilizzando efficacemente la nanoparticella sulla superficie del sensore. Gruppi TCO non reagiti sulle nanoparticelle sono disponibili per la cicloaddizione con teraz-zina benzoilammina iniettata. In alternativa, il coniugato TET INE AP 1,497 viene utilizzato per monitorare le interazioni della nanoparticella funzionalizzata FK BP 12.Nessuna dissociazione delle strutture multicomponente è stata osservata, fornendo evidenza della stabilità strutturale e della bioattività, con capacità di monitoraggio in tempo reale della reazione di immobilizzazione e di rigenerazione della superficie. La caratterizzazione diretta della costante di associazione KA è realizzata come mostrato in questo caso. La conoscenza della cinetica della reazione fornisce linee guida per il controllo della densità di immobilizzazione e rappresenta un parametro importante per i saggi biosensoristici.L'iniezione di concentrazioni crescenti di teraz BELAMINE o N-P-T-C-O in duplicato su superfici rispettivamente di G-S-T-T-C-O o GST teraz zine genera i dati di legame. I dati di legame per due campioni analitici sequenziali della stessa concentrazione sulla stessa superficie sono quasi sovrapponibili, il che riflette una perdita minima della capacità di legame dell'anticorpo. A causa dei multipli cicli di cattura ciclica e di rigenerazione, il software di valutazione fornisce l'analisi cinetica con il miglior adattamento per le velocità della reazione di ciclazione.È stato sviluppato un approccio che sfrutta il legame tra anticorpo e antigene, abbinato a reazioni di cicloadizione rapide e altamente specifiche tra terazina e trans-cicloottene, che permette l'immobilizzazione rapida e reversibile di molecole di piccole dimensioni. Per studi basati su chip SPR, il metodo di cattura mediante cicloadizione richiede tempi di contatto brevi e concentrazioni inferiori a 10 micromolari di ligandi di piccole molecole. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come immobilizzare molecole di piccole dimensioni o strutture multicomponente su una superficie sensoriale utilizzando il metodo di cattura mediante cicloadizione.Per raggiungere questo obiettivo, è fondamentale utilizzare reagenti di buona qualità per le reazioni di coniugazione e impostare correttamente i parametri del saggio sullo strumento SPR.

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