Microfluidic On-chip Capture-cicloaddizione Reazione di immobilizzare reversibilmente piccole molecole o strutture multi-componenti per applicazioni Biosensor

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di dimostrare una strategia rapida e generalizzabile per immobilizzare in modo reversibile piccole molecole e nanoparticelle funzionalizzate sulla superficie dei chip dei sensori. Ciò si ottiene immobilizzando prima gli anticorpi anti GST sulla superficie di un sensore. Come seconda fase, cattura dell'antigene GST.

Funzionalizzato con gruppi trans ciclo, ottino o tetra zine fornisce una superficie reattiva per le successive reazioni di cicloedizione con derivati sinusoidali tet a piccole molecole o coniugati ciclo ottano di tendenza nanoparticellare, che vengono successivamente funzionalizzati con derivati sinusoidali tet a piccole molecole. Successivamente, la superficie funzionalizzata può essere utilizzata per l'analisi dell'interazione con un bersaglio solubilizzato desiderato. Nell'ultima fase, la superficie viene rigenerata, consentendo successivi cicli di cicloedizione di cattura. I risultati del legame mostrano sulle navi le reazioni bio ortogonali preservano la capacità di piccole molecole immobilizzate o situano due nanoparticelle funzionalizzate di interagire con il bersaglio FK BP 12 e illustrano come questo approccio possa estendere la gamma di applicazioni per SPR.

Il vantaggio principale di questa tecnica di edizione del ciclo di cattura su chip è che consente una rapida reversibilità e mobilizzazione di piccole molecole con il controllo dell'orientamento e della densità di mobilizzazione I. In genere, il processo di edizione del ciclo di cattura può essere eseguito in pochi minuti, riducendo significativamente i tempi di preparazione della superficie, dimostrando che la procedura sarà Jason Sandler, uno studente del nostro laboratorio Per iniziare questa procedura a otto microlitri di una soluzione T-C-O-N-H-S da 50 millimolari in DMSO a 100 microlitri di una soluzione GST da un milligrammo per millilitro in PBS. Dopo aver agitato la miscela a temperatura ambiente per un'ora, rimuovere il reagente in eccesso utilizzando una colonna di desalinizzazione Zeba spin.

Successivamente, aggiungere sei microlitri di una soluzione di estere tetra NHS da 25 millimolari in DMF a 75 microlitri di una soluzione di un milligrammo per millilitro di GST in PBS e agitare la miscela a temperatura ambiente dopo un'ora. Diluire la miscela di reazione con 25 microlitri di PBS e purificare utilizzando una colonna di desalinizzazione a rotazione. Quindi aggiungere 100 microlitri della soluzione T-C-O-N-H-S da 50 millimolari a 150 microlitri di una soluzione di nanoparticelle emanata e agitare la miscela nello stesso modo di prima.

Dopo la miscelazione, rimuovere il reagente in eccesso mediante filtrazione su gel utilizzando una colonna NAP 10. Alluso con buffer PBS. Raccogli la fascetta colorata contenente il prodotto N-P-T-C-O.

Trasferire il campione purificato in una provetta da centrifuga contenente un dispositivo di filtro centrifugo con un cutoff di peso molecolare di 100.000. Quindi concentrare il campione fino a un volume finale di circa 150 microlitri dopo la centrifugazione. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di anidride cinica 0,1 molare in DMSO alla soluzione N-P-T-C-O.

Dopo aver agitato la miscela a temperatura ambiente per un'ora, purificare il prodotto N-P-T-C-O utilizzando una colonna NAP 10 eludente con PBS utilizzando uno strumento di risonanza al plasma di superficie, selezionare l'immobilizzazione sulle celle di flusso uno e due nel modello della procedura guidata di immobilizzazione AM. Modificare il metodo Amin per attivare i gruppi carbossilici di superficie mediante iniezione di una soluzione uno-a-uno di EDC 0,4 molari e NHS 0,1 molari per 480 secondi. A una velocità di flusso di 10 microlitri al minuto, impostare l'iniezione di etanolammina per estinguere gli esteri attivati rimanenti a un tempo di contatto di 422 a una velocità di flusso di 10 microlitri al minuto.

Inserire il nome del ligando anti GST e impostare l'iniezione per un tempo di contatto di 420 secondi a una velocità di flusso di 10 microlitri al minuto. Quindi posizionare le fiale di soluzione precedentemente preparate nel rack dei reagenti due. Assicurarsi di far corrispondere le posizioni con l'elenco dei contenuti dopo aver assegnato il nome del file e la destinazione in cui verranno salvati i dati.

Inizia l'immobilizzazione. Modificare la procedura guidata di immobilizzazione per iniettare solo 20 microgrammi per millilitro della soluzione di ligando GST per 420 secondi a cinque microlitri al minuto rispetto alla cella di flusso di riferimento. Posizionare i flaconcini contenenti G-S-T-T-C-O-A la soluzione di TERAZ olaine da 10 micromolari precedentemente preparata e la soluzione di rigenerazione nel rack dei reagenti due.

Selezionare il metodo di esecuzione manuale, impostare la portata su cinque microlitri al minuto e il percorso del flusso verso la cella di flusso due. Iniettare la soluzione G-S-T-T-C-O per 420 secondi, seguita dalla soluzione Teraz Benz Lamine per 600 secondi. Successivamente, rigenerare la superficie con due iniezioni a 32a di soluzione rigenerante.

Dopo aver posizionato la zine GST TAZ, N-P-T-C-O, teraz Belamine e le fiale di soluzione di rigenerazione nel rack due dei reagenti, selezionare il metodo di esecuzione manuale dello strumento, quindi impostare la portata su cinque microlitri al minuto e il percorso del flusso verso la cella di flusso due. Iniettare una soluzione di GST Tetra zine per 60 secondi, seguita da una soluzione di N-P-T-C-O per 60 secondi. Infine, iniettare una soluzione di tetras zine belamina per 60 secondi.

Al termine, rigenerate la superficie nello stesso modo in cui lo avete fatto prima. Quindi, selezionare un nuovo metodo e inserire i parametri generali, che includono la raccolta dei dati, il rilevamento della velocità, il vano campioni, la temperatura, le unità di concentrazione e le impostazioni del tampone. Nel pannello delle fasi del saggio, creare una nuova fase e denominarla campione.

Quindi impostare lo scopo e le impostazioni basate sulla connessione per campionare nel pannello dei tipi di ciclo, creare un nuovo passaggio del ciclo e inserire i seguenti comandi. Acquisite la rigenerazione del campione uno e la rigenerazione due. Selezionare il comando di cattura e inserire G-S-T-T-C-O come ligando.

Nomina 120 secondi come tempo di contatto, cinque microlitri al minuto come portata. E imposta il percorso del flusso su secondo. Quindi selezionare il comando del campione e inserire un tempo di contatto di 182°, un tempo di dissociazione di 62°, una portata di 30 microlitri al minuto e impostare il percorso del flusso su entrambi.

Successivamente, selezionare il comando di rigenerazione e immettere la soluzione di rigenerazione. Assegna un 32° tempo di contatto a 30 microlitri al minuto e imposta il percorso del flusso al secondo. Ripetete la stessa procedura per la rigenerazione.

Due comandi selezionano imposta, esegui e imposta il percorso del flusso su due trattini uno. Selezionare Avanti e riempire l'elenco dei campioni con la soluzione di analita tetra Belamine e una serie di concentrazioni da 1,5 a 20 micromolari a una diluizione da uno a due. Quindi selezionare accanto al pannello di posizione del rack.

Dopo aver posizionato le fiale di soluzione nel rack due dei reagenti, posizionare la serie di diluizione. In una piastra da 96 pozzetti. Assicurati di abbinare le posizioni con l'elenco dei contenuti.

Salvare il modello del metodo e avviare il test di legame. Ad esempio, una volta selezionato un nuovo metodo e i parametri generali, creare e denominare il campione di acquisizione e le fasi di rigenerazione nel pannello delle fasi del saggio. Successivamente, selezionare lo scopo corrispondente e collegare le impostazioni di base.

Quindi seleziona il pannello dei tipi di ciclo e crea tre fasi del ciclo. Cattura, campionamento e rigenerazione. Inserire il comando di acquisizione due volte nel ciclo di acquisizione.

Entra nel pannello di acquisizione uno. Selezionare la soluzione di acquisizione come variabile. Quindi impostare il tempo di contatto su 300 secondi a una velocità di flusso di cinque microlitri al minuto e impostare il percorso del flusso su secondi nel pannello di acquisizione due.

Selezionare la soluzione di acquisizione come variabile. Impostare il tempo di contatto su 250 secondi a una velocità di flusso di cinque microlitri al minuto e impostare il percorso del flusso su secondi. Quindi, inserire il comando di esempio nel passaggio del ciclo di esempio.

Selezionare il pannello campione e impostare il tempo di contatto su 60 secondi. Il tempo di dissociazione a 200 secondi a una velocità di flusso di 30 microlitri al minuto e impostare il percorso del flusso su entrambi. Inserire due volte il comando di rigenerazione sotto il passo del ciclo di rigenerazione, selezionare il pannello di rigenerazione, inserire la soluzione di rigenerazione.

Indicare un tempo di contatto di 30 secondi a 30 microlitri al minuto e impostare il percorso del flusso su secondo. Ripetete la stessa procedura per la rigenerazione. Due pannelli selezionano l'impostazione, l'esecuzione e l'impostazione del percorso del flusso su due trattini, uno seleziona il successivo e inserisci G-S-T-T-C-O e teraz AP 1, 497 coniugato come la soluzione di cattura, nomi FKBP 12 come nome del campione e da 1,5 a 96 nano molari a una diluizione da uno a due come serie di concentrazioni.

Dopo aver posizionato le fiale di soluzione nel rack due dei reagenti e la serie di diluizione in una piastra a 96 pozzetti, salvare il modello del metodo e avviare il saggio di legame. L'efficiente immobilizzazione reversibile di piccole molecole bioattive con controllo dell'orientamento e della densità svolge un ruolo chiave nello sviluppo di nuove applicazioni di biosensori. Qui è mostrato il monitoraggio in tempo reale dell'immobilizzazione del benzoino della zine teraz.

Una soluzione di G-S-T-T-C-O viene iniettata su una superficie anti GST pre-immobilizzata con conseguente aumento di circa 400 R RU. In risposta, una seconda iniezione con la zine Teraz Benzo Lamine mostra un rapido aumento di 15 RU in risposta. Non è stata osservata alcuna dissociazione dell'antigene dert dopo il passaggio al tampone in esecuzione, fornendo prove di stabilità della struttura.

La superficie è stata rigenerata nell'ultima fase del ciclo per consentire più cicli di cicloedizione di cattura. Utilizzando questa procedura e sostituendo la tetra zine, la porzione benzil-lamminica con la teraz zine AP 1, 497 coniugato genera una superficie bioattiva, che viene utilizzata per studi di interazione con il suo bersaglio. L'interruzione dell'interazione antigene-anticorpo FK BP 12 rigenera la superficie anti GST, consentendo la costruzione di un nuovo assemblaggio molecolare.

In questo caso, un'iniezione di zine GST TERAZ è seguita da un'iniezione di N-P-T-C-O, immobilizzando efficacemente la nanoparticella sulla superficie del sensore. I gruppi TCO non reagiti sulle nanoparticelle sono disponibili per l'edizione cyclo con teraz zine benzo lamine iniettato. In alternativa, il coniugato TET INE AP 1, 497 viene utilizzato per monitorare le interazioni con le nanoparticelle funzionalizzate FK BP 12.

Non è stata osservata alcuna dissociazione delle strutture multicomponente, fornendo prove di stabilità e bioattività della struttura con capacità di immobilizzazione, monitoraggio della reazione e rigenerazione superficiale in tempo reale. La caratterizzazione diretta del tasso di associazione KA si ottiene come mostrato qui. La conoscenza della cinetica di reazione fornisce linee guida per il controllo della densità di immobilizzazione e parametri importanti per i saggi dei biosensori.

L'iniezione di concentrazioni crescenti di teraz BELAMINE o N-P-T-C-O in duplicato su superfici di G-S-T-T-C-O o GST teraz zine genera rispettivamente i dati di legame. I dati di legame per due campioni sequenziali di analita della stessa concentrazione sulla stessa superficie sono quasi sovrapponibili, riflettendo una perdita minima della capacità di legame degli anticorpi. A causa di molteplici cicli di cicloedizione e rigenerazione della cattura, il software di valutazione fornisce l'analisi cinetica più adatta per le velocità di reazione della cicloedizione.

Abbiamo sviluppato un approccio che utilizza la cattura dell'antigene anticorpale, accoppiato a reazioni di cicloedizione rapide e altamente specifiche tra teraz zine e transciclina che consente una rapida immobilizzazione reversibile di piccole molecole. Per gli studi basati su chip SPR, il metodo di edizione del ciclo di cattura richiede tempi di contatto brevi con concentrazioni inferiori a 10 micromolari di ligandi di piccole molecole. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come immobilizzare piccole molecole o strutture multicomponente sulla superficie di un sensore utilizzando il metodo di acquisizione ciclo-edizione.

Per raggiungere questo obiettivo, è importante utilizzare reagenti di buona qualità per le reazioni di coniugazione e impostare correttamente i parametri del test sullo strumento SPR.