Co-coltura di sistema con un Organotipica cervello Slice e 3D Spheroid delle cellule di carcinoma

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare le interazioni gliali direttamente durante la formazione di metastasi cerebrali. Ciò si ottiene preparando prima fette di cervello organotipiche dai topi. Successivamente, le fette di cervello organotipiche vengono co-coltivate con cellule di carcinoma.

Quindi le cellule stromali vengono colorate in fluorescenza con marcatori specifici. Infine, il livello di invasione tumorale viene valutato con un microscopio a fluorescenza. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'interazione e la colocalizzazione delle cellule tumorali della glia attraverso la marcatura in immunofluorescenza e la microscopia time-lapse o confocale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'iniezione intracerebrale di cellule di carcinoma, è che questo metodo è un'alternativa semplice e offre una buona piattaforma per osservare le interazioni cellulari durante la progressione del tumore. Le implicazioni di questa tecnica sono 10 verso la scoperta di un nuovo e delle terapie selettive per il trattamento del cancro. Poiché le cellule traumatizzate svolgono un ruolo importante nelle metastasi e anche potenziali bersagli per la terapia del cancro, a dimostrare la tecnica sarà Eugenia che consegna un postdoc del mio laboratorio Prima della procedura chirurgica, preparare il terreno di dissezione costituito da un mezzo essenziale minimo, integrato con 0,2 millimolari di glutammina, 100 milligrammi per millilitro di streptomicina e 4,5 milligrammi per millilitro di glucosio dopo aver decapitato i topi da qualsiasi ceppo di topo tra il sesto giorno postnatale e Otto.

Utilizzando rapidamente le condizioni asettiche, rimuovere il cervello dal cranio e trasferirlo nel mezzo di dissezione. Rimuovere il polo frontale e il cervelletto dal cervello. Quindi utilizzare la colla criogenica e il 5% di agros per fissare e stabilizzare il tessuto cerebrale rimanente composto dal cervello.

Su un palco che utilizza una fetta orizzontale di Vibram, sezioni spesse 350 micron, a seconda della specie e dell'età del topo, raccolgono da quattro a sei fette di cervello intere da un singolo cervello. Dopo aver preparato il terreno di coltura secondo il protocollo di testo, aggiungere un millilitro a ciascun pozzetto inferiore di una piastra a sei pozzetti trans. Quindi posizionare ogni fetta di cervello organotipico su una membrana transwell in policarbonato da 0,4 micron e inserirli nei pozzetti della piastra.

Incubare le fette per una notte in un'atmosfera umidificata con il 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, incorporare 10 al quinto tumore trasfettato GFP o altre cellule in 20 microlitri di matrice gel composta da 15% di terreno RPMI e 85% di gel ECM. Posizionare la miscela di sette matrici di gel MCF in distanziatori metallici sterili direttamente adiacenti alle regioni corticali delle fette di cervello organotipiche e incubare per due ore dopo l'incubazione, rimuovere i distanziatori e lasciare che il PHE tumorale 3D incubi con le fette di cervello per 24-96 ore.

Se lo si desidera, sostituire il terreno di coltura a giorni alterni. Eseguire l'imaging dal vivo utilizzando la microscopia time-lapse con oggetto con ingrandimento 10x per colorare le colture di co-fette di cervello. Fissarli con aldeide paraforme al 4% per otto ore a quattro gradi Celsius prima di lavare i campioni in PBST per cinque minuti.

Quindi, per bloccare i campioni, utilizzare un normale siero di capra in PBST a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, colorare gli astrociti incubando le colture di co con proteina acida fibrillare antigliale, o anticorpo monoclonale GFAP per 36 ore a quattro gradi Celsius, seguita da colorazione anti-topo di capra per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver lavato i campioni con PBST tre volte per cinque minuti ciascuno, colorare le cellule microgliali con I LB quattro, LOR 647 per un'ora a temperatura ambiente prima di controcolorare con DPI per tre minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver utilizzato un mezzo di montaggio fluorescente per montare i campioni di co-coltura, eseguire l'imaging dei campioni utilizzando un microscopio fluorescente con ingrandimento 25x. Infine, valutare il grado di invasione tumorale in base al seguente sistema di punteggio. Questo misura prima la lunghezza della sezione di contatto tra il tappo tumorale e la fetta, e poi la frazione di contatto rilevabile dalle cellule invasori.

Come mostrato qui, tutte le linee cellulari di carcinoma testate hanno invaso fette di cervello di topo organotipiche, suggerendo che il processo di invasione era indipendente dalla specie. Questo filmato mostra una registrazione time-lapse delle interazioni dirette tra le cellule tumorali gliali. Le cellule stromali sono state osservate invadere il tumore contenente il tappo cellulare e interagire con le cellule tumorali.

L'imaging time-lapse per un lungo periodo di tempo ha confermato la vitalità delle fette di cervello e ha permesso la visualizzazione delle cellule microgliali che entrano nella sfera tridimensionale, così come delle cellule tumorali che invadono le fette di cervello. Inoltre, come abbiamo precedentemente dimostrato, le microglia trasportano le cellule del carcinoma con un meccanismo ancora enigmatico e assistono nell'invasione del carcinoma utilizzando la marcatura in immunofluorescenza. Abbiamo dimostrato la colocalizzazione di cellule tumorali e stromali sia nel tessuto cerebrale che nei tappi delle cellule tumorali, suggerendo una stretta interazione tra queste cellule durante il processo di invasione.

Come si può vedere qui, risultati comparabili sono stati ottenuti quando fette di cervello di topo sono state co-coltivate con cellule di carcinoma umano o urinario, supportando l'ampia gamma di applicazioni per lo studio di cellule di diverse specie, genotipi e ceppi. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle metastasi tumorali per esplorare l'impatto del microambiente durante la colonizzazione del tumore in siti distanti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare le reazioni delle cellule tumorali GL durante la formazione di metastasi cerebrali cellulari in un sistema di contatto fisiologico diretto.