Name: Co-coltura di sistema con un Organotipica cervello Slice e 3D Spheroid delle cellule di carcinoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-09T22:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Scopri la co-coltura di fette cerebrali organotipiche con cellule di carcinoma per visualizzare le interazioni gliali durante la metastasi cerebrale. Questo metodo offre una piattaforma per studiare l'invasione tumorale in tempo reale.

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Gli autori ringraziano Chalid Ghadban per la sua eccellente assistenza tecnica, Andreas Wodarz e Stephan Heermann per la loro consulenza tecnica in materia confocale e microscopia time-lapse. Non c&#39;è conflitto di interessi per qualsiasi degli autori. Questo lavoro è finanziato dal Consiglio di ricerca tedesco (DFG) in Project 2 Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), dai Dres. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Germania) e dal Programma di Ricerca della Facoltà di Medicina, Georg-August-Universität Göttingen, Germania.

Questo nuovo modello è un adattamento di un approccio fetta cerebrale dell&#39;ippocampo organotipica pubblicato in precedenza 9-12. Modifiche e aggiunte sono state introdotte per ottimizzare le interazioni cellula-tessuti tumorali cerebrali e garantire la riproducibilità. Lo studio è stato esaminato e approvato dal comitato etico locale. Gli animali sono stati trattati con cura secondo le linee guida per la cura degli animali presso l&#39;Medicina dell&#39;Università di Göttingen. Il organotipica fetta cervello co-coltura può essere suddivisa in due fasi. Primo passo è la preparazione della fetta cervello organotipica. Fase due comprende la preparazione delle cellule tumorali e deposizione nel modello di co-coltura. 1. Organotipica Cervello Slice <ol><li> Preparare il mezzo dissezione costituito mezzo minimo essenziale (MEM), supplementato con 0,2 mM glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 4,5 mg / ml di glucosio. </li><li> Decapitare i topi da qualsiasi ceppo di topi tra giorno postnatalesei e otto (P6-8). </li><li> Rimuovere il cervello rapidamente dal cranio in condizioni asettiche e trasferirlo medio dissezione ghiacciata. </li><li> Rimuovere il polo frontale e cervelletto da tutta la sezione cervello. </li><li> Fissare e stabilizzare il cervello su un palco con colla crio e il 5% agarosio. </li><li> Tagliare sezioni cerebrali orizzontalmente per uno spessore di 350 micron utilizzando un vibratome. </li><li> Raccogliere 4-6 intere sezioni di cervello da un unico cervello di topo, a seconda della specie e dell&#39;età. </li><li> Preparare il terreno di coltura costituito da 50% MEM, soluzione salina bilanciata di Hanks 25% &#39;(HBSS), 25% siero di cavallo normale (NHS), glutammina 0,2 mM, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina (Sigma, Monaco, Germania), e 4,5 mg / ml glucosio. </li><li> Mettere ogni fetta cerebrale organotipica su un micron policarbonato transwell inserto membrana 0.4 in una piastra sei pozzetti con 1 ml di mezzo di coltura nel pozzo inferiore. </li><li> Cultura organotipica fettine di cervello durante la notte in un humidified un&#39;atmosfera con 5% di CO 2 a 37 ° C incubatore. </li></ol> 2. Il modello Slice coculture <ol><li> Incorporare 10 5 di tumore GFP-trasfettate o di altre cellule (ad esempio cellule MCF-7-GFP) in 20 microlitri matrice del gel, composto del 15% RPMI medie e l&#39;85% gel ECM. </li><li> Posizionare il mix matrice MCF-7-gel in un distanziatore metallico sterile (diametro 3,8 millimetri) direttamente adiacente alla regione corticale del cervello fetta organotipica e incubare per 2 ore. </li><li> Rimuovere il distanziale e consentire al sferoide tumore 3D per co-coltura con la fetta organotipica per 24-96 ore. </li><li> Cambiare il terreno di coltura ogni altro giorno. </li></ol> 3. Immunofluorescenza degli astrociti e microglia nel cervello Organotipica Slice coculture <ol><li> Fissare il organotipica fetta cervello co-coltura con paraformaldeide 4% per 8 ore a 4 ° C. </li><li> Lavare la co-coltura fetta con PBST (PBS con 0,5% Triton X-100) per 5 min. </li><li> Bloccare le samples con siero normale di capra in PBST (1,20) a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Macchiare gli astrociti incubando la co-coltura fetta cervello con fibrillare gliale anti-acido proteina monoclonale (GFAP, 1:200 in PBST) per 36 ore a 4 ° C, seguita da capra anti-topo-TRITC (1:100 in PBST) colorazione per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i campioni con PBST tre volte per 5 min. </li><li> Colorare le cellule microgliali con ILB 4 Alexa Fluor 647 (1:100 in PBST) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Controcolorare la fetta coculture cervello con DAPI (1:1.000) per 3 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Montare e coprioggetto la fetta coculture cervello con mezzo di montaggio DAKO fluorescente. </li><li> Valutare il grado di invasione tumorale sulla base della seguente sistema di punteggio: 0 = nessuna delle celle; + &lt;1/3; + + = 1/3 - 2/3; + + + ≥ 2/3 delle cellule invase (prima misurare la lunghezza della sezione di contatto tra la spina tumore e fetta, quindi misurare il frazionamenton di contatto rilevabile dalle cellule invasori). </li></ol> 4. Immagini dal vivo di interazione tra gliali e cellule tumorali <ol><li> Eseguire l&#39;esperimento sotto un microscopio invertito Leica DMI 6000B a 10 volte più lente di ingrandimento e una camera CCD 350 FX Leica DFC. </li></ol>

<ol><li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+seed+and+soil+hypothesis+revisited--the+role+of+tumor-stroma+interactions+in+metastasis+to+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The seed and soil hypothesis revisited--the role of tumor-stroma interactions in metastasis to different organs.</a> Int. J. Cancer. 128, 2527-2535 (2011).</li>
<li>Joyce, J. A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 239-252 (2009).</li>
<li>Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-related+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer-related inflammation.</a> Nature. 454, 436-444 (2008).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+organ+microenvironment+in+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of the organ microenvironment in brain metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 21, 107-112 (2011).</li>
<li>Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+enhance+the+invasion+potential+of+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells.</a> PloS one. 8, e54752(2013).</li>
<li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+mechanistic+insights+and+clinical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12, 895-904 (2006).</li>
<li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 344-356 (2011).</li>
<li>Winkler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+glioma+cell+invasion+in+vivo+reveals+mechanisms+of+dissemination+and+peritumoral+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis.</a> Glia. 57, 1306-1315 (2009).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Kreutz, S., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+and+neuronal+damage%3A+differential+effects+of+THC%2C+AEA+and+2-AG+on+activated+microglial+cells+and+degenerating+neurons+in+excitotoxically+lesioned+rat+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids and neuronal damage: differential effects of THC, AEA and 2-AG on activated microglial cells and degenerating neurons in excitotoxically lesioned rat organotypic hippocampal slice cultures.</a> Exp. Neurol. 203, 246-257 (2007).</li>
<li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%3A+interface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li>
<li>Fuller, L., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rodent+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of rodent hippocampal slice cultures.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4848(2007).</li>
<li>Lorger, M., Felding-Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+changes+in+the+brain+microenvironment+during+initial+steps+of+breast+cancer+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Capturing changes in the brain microenvironment during initial steps of breast cancer brain metastasis.</a> Am. J. Pathol. 176, 2958-2971 (2010).</li>
<li>Brana, C., Biggs, T. E., Mann, D. A., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macrophage+hippocampal+slice+co-culture+system%3A+application+to+the+study+of+HIV-induced+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage.</a> J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).</li>
<li>Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mossy+fiber+pathfinding+in+multilayer+organotypic+cultures+of+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).</li>
<li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).</li>
<li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. , (2011).</li>
<li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J. Immunol. 188, 29-36 (2012).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology of microglia.</a> Physiol. Rev. 91, 461-553 (2011).</li>
<li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).</li>
<li>Baumert, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathology-based+substrate+for+target+definition+in+radiosurgery+of+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Oncol.+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).</li>
<li>Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+metastasis+to+a+sanctuary+site%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The biology of metastasis to a sanctuary site.</a> Clin. Cancer Res. 13, 1656-1662 (2007).</li>
<li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+colonization+of+brain+tissue+by+breast+cancer+cells+in+a+Wnt-dependent+way%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way.</a> Glia. 58, 1477-1489 (2010).</li>
<li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459, 1005-1009 (2009).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Precedenti indagini istologiche di metastasi cerebrali hanno dimostrato rapidi e drastici cambiamenti delle cellule gliali residenti, in particolare di astrociti e microglia 13. Per studiare questi cambiamenti e le interazioni con le cellule di carcinoma, questo sistema di co-coltura romanzo è adatto. Altri campi di ricerca già hanno esperienza di lunga data con organotipica fettine di cervello di ippocampo. Un vantaggio è che i organotipica culture fetta dell&#39;ippocampo del cervello sono vitali ed effettivamente conservato per giorni o settimane, che lo rende adatto per esperimenti a lungo termine. Dall&#39;introduzione di Stoppini del sistema fetta dell&#39;ippocampo organotipica nel 1991, è stato ampiamente utilizzato, per esempio nella ricerca di malattie degenerative. Così, questo sistema di co-coltura innovare rappresenta una modifica di un approccio consolidata con una gamma di applicazioni in biologia tumorale 9,11. La modifica ci ha offerto un modello riproducibile per valutare il grado di invasione tumorale afterwards e colture cresciute dal metodo di interfaccia sono ideali per esperimenti che richiedono una struttura tridimensionale. Diverse tecniche sono state usate per coculture fettine ippocampali organotipiche con altre cellule. Questi includono un sistema indiretto tra macrofagi e la fetta cervello organotipica 14, e un co-coltura diretta di due sezioni diverse dalla regione dell&#39;ippocampo 15. Aggregati di glioma sono stati co-coltivate con fettine di cervello di 16. Questi modelli possono essere utilizzati per analizzare gli eventi cellulari e molecolari delle fettine di cervello, ma non consentono, il contatto fisiologico diretto tra le cellule tumorali, microglia e il parenchima cerebrale. Inoltre, questo metodo consente l&#39;osservazione di microglia, senza contaminazione di midollo osseo periferico monociti / macrofagi. L&#39;uso di CCR2 e CX3CR1 modello di topo transgenico è un miglioramento critico dovuto al fatto che è difficile distinguere la microglia residente di invadere monocitiin base alle loro proprietà simili 17,18,19. Anche se l&#39;iniezione intracerebrale di cellule di carcinoma permette di indagare la progressione del tumore, non si può dire molto sul fatto che le cellule macrofago-come circondate provengono dalla popolazione microglia cerebrale residenti o dal midollo osseo periferico monociti / macrofagi 17. Il team di Kettenmann introdotto un cervello modello fetta organotipica che ha coinvolto inoculando cellule di glioma in fettine di cervello con un micromanipolatore 20. Tuttavia, gliomi maligni primari differiscono per molti aspetti da carcinomi metastatici. In primo luogo, gliomi maligni sono di origine mesenchimale, non metastasi al di fuori del sistema nervoso, e migrano / invadere le cellule come singole senza confine tra tumore e tessuto cerebrale. Per contro, la crescita infiltrante è una caratteristica tipica patologico, e che tali carcinomi solito migrare / invadere come coorti. In secondo luogo, carcinomi spesso cercano di ricostruire le strutture epiteliali del cervello, mentre le cellule glialicercare di separare il tumore dal tessuto cerebrale da una (pseudo) capsula. Considerando le caratteristiche biologiche e morfologiche, glioma maligno e metastasi dei carcinomi non sono realmente comparabili. Per queste ragioni, abbiamo modificato e sviluppato un sistema di co-coltura dove non ci iniettiamo, ma co-coltura di una spina di cellule di carcinoma adiacente la fetta cervello. Inoltre, abbiamo osservato microglia e l&#39;accumulo di astrociti al confine della spina tumore, il che significa che la microglia entrare la spina tumore e potrebbe essere facilmente individuata mediante microscopia in campo chiaro e confermato successivamente mediante microscopia confocale. Le cellule tumorali invadono nella fetta cervello, che è paragonabile alla reale situazione in vivo e ad un&#39;osservazione di Baumert e colleghi, che hanno trovato una zona infiltrazione nel 63% dei casi autoptici con metastasi cerebrali 21. A causa della mancanza di perfusione di sangue, ci sono solo residenti macrofagi / microglia in questa cultura. Inoltre, a causa della mcellule Issing T e, di conseguenza, assente allo-reattività, cellule di carcinoma umane potrebbero essere utilizzati per co-coltura anche con fettine di cervello di topi immunocompetenti o ratti (NMRI, B6, o Wistar). Questo potrebbe servire come alternativa al modello di topo nudo. Da 4-5 fette possono essere ottenuti da ciascun topo, sono richiesti significativamente ridotto numero di animali, in confronto ai modelli iniezione esistenti. Inoltre, gli animali non soffrono per un lungo periodo di malattia metastatica e non sottoposti a procedure operative ripetutamente 22. Con questo sistema di co-coltura, abbiamo dimostrato l&#39;attivazione della microglia dalle cellule tumorali e la capacità di promuovere l&#39;invasione delle cellule del cancro. Inoltre, questa è la prima volta, a nostra conoscenza, sono stati trovati per trasportare attivamente cellule di carcinoma 23 microglia. Nonostante tutti questi vantaggi, il sistema di co-coltura ha, infatti, anche limitazioni. E &#39;ancora in vitromodellare mancano le fasi di metastasi prima della colonizzazione. A causa della mancanza di perfusione, non è possibile studiare la stravaso. Così, il modo alternativo di studiare la stravaso è di utilizzare il modello in vivo iniezione o il sistema di camera di Boyden modificata con matrice extracellulare, HUVEC e astrociti per imitare la barriera emato-encefalica 22,24. Il metodo coculture fetta cervello è ancora un modello affidabile e riproducibile con molti vantaggi e un potenziale per un&#39;ampia varietà di applicazioni, come l&#39;analisi di colonizzazione, in particolare con un focus sul ruolo delle cellule residenti. La combinazione con altre tecniche consolidate (come l&#39;immunoistochimica, microscopia confocale e microscopia time-lapse) sostiene la ricerca di interazioni dirette cellula-cellula. Si tratta di una alternativa semplice e complementazione di altre tecniche e offre l&#39;accesso alla ricerca di spunti e gli effetti come imposte dal microambiente metastatico.

<table><tbody><tr><td>Hank&#039; s soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>Gibco, Darmstadt,Germania</td><td>24020</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo essenziale minimo (MEM)</td><td>Gibco, Darmstadt, Germania</td><td>32360</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>PAA Laboratories Inc., C&ouml; lbe, Germania</td><td>E15-840</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Pan Biotech, Aidenbach, Germania</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo normale (NHS)</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germania</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello (FCS)</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germania</td><td>10091148</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>B. Braum, Melsungen, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di L-glutammina-penicillina-streptomicina</td><td>Sigma, Steinheim, Germania</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica, Wetzlar, Germania</td><td>Leica VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica, Wetzlar, Germania</td><td>Leica SM 2000R</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in policarbonato</td><td>BD Falcon, Heidelberg, Germania</td><td>353090</td><td>inserto membrana transwell (0,4 &mu; m dimensione dei pori)</td></tr><tr><td>ECM gel</td><td>Trevigen, R& D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germania</td><td>3432-005-01</td><td>Estratto di membrana basale</td></tr><tr><td>Distanziatore metallico</td><td>Kig GmbG, Kirkel, Germania</td><td>DIN 433</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss, G&ouml; ttingen, Germania</td><td>Microscopio e fotocamera time-lapse LSM 510</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica, Wetzlar, Germania</td><td>Microscopio DMI 6000B e una fotocamera CCD DFC 350 FX</td> Microscopio anatomico Zeiss, G&ouml;<td></td></tr><tr><td></td><td> ttingen, Germania</td><td>Stemi SV11</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di topo anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP)</td><td>Sigma, Steinheim, Germania</td><td>G3893</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-topo di capra, F(ab&#039;)2- TRITC</td><td>Santa Cruz, Heidelberg, Germania</td><td>SC3796</td><td></td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4 da Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 coniugato</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germania</td><td>132450</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6&#039;-diamidino-2-fenilindolo diifrocloruro)</td><td>Sigma, Steinheim, Germania</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio fluorescente</td><td>DAKO, Glostrup, Danimarca</td><td>S3023</td><td></td></tr></tbody></table>

co-coltura di sistema con un organotipica cervello slice e 3d spheroid delle cellule di carcinoma

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

I pazienti con metastasi cerebrali di carcinomi hanno una prognosi sfavorevole. Tuttavia, il processo nel sito metastatico è appena stata studiata, in particolare, il ruolo del (stromali) cellule residente. Studi in carcinomi primari dimostrano l&#39;influenza del microambiente sulla metastasi, anche sulla prognosi 1,2. Soprattutto i macrofagi associati al tumore (TAM) migrazione di sostegno, l&#39;invasione e la proliferazione 3. È interessante notare che i maggiori siti bersaglio di metastasi possiedono macrofagi tessuto-specifici, come le cellule di Kupffer nel fegato o microglia nel SNC. Inoltre, i siti metastatici possiedono anche altre cellule tessuto-specifici, come astrociti. Recentemente, gli astrociti sono state dimostrate per favorire la proliferazione e la persistenza di cellule tumorali 4,5. Pertanto, le funzioni di questi tipi di cellule tessuto-specifiche sembrano essere molto importante nel processo di metastasi cerebrali 6,7. Nonostante queste osservazioni,Tuttavia, fino ad ora non c&#39;è idoneo modello in vivo / in vitro disposizione di visualizzare direttamente reazioni gliali durante la formazione di metastasi cerebrale, in particolare mediante microscopia in campo chiaro. Recente in vivo imaging dal vivo delle cellule di carcinoma dimostrato il loro comportamento colonizzazione cerebrale 8. Tuttavia, questo metodo è molto laboriosa, costosa e tecnicamente complessa. Inoltre, questi tipi di esperimenti sugli animali sono limitate a piccole serie e sono dotati di una notevole sollecitazione per gli animali (per impiantazione della lastra di vetro, iniezione di cellule tumorali, anestesia ripetitivo e fissazione a lungo termine). Inoltre, l&#39;imaging in vivo è finora limitata alla visualizzazione delle cellule di carcinoma, mentre non sono ancora stati illustrati interazioni con cellule residenti. Infine, ricerche di cellule di carcinoma umani all&#39;interno animali immunocompetenti sono impossibili 8. Per queste ragioni, abbiamo stabilito un sistema di co-coltura consipungiglione di una fetta cervello organotipica mouse e cellule epiteliali incorporato in matrigel (sfera di cellule 3D). Le sfere di cellule di carcinoma in 3D sono stati collocati direttamente accanto al bordo fetta cervello al fine di indagare l&#39;invasione del tessuto cerebrale adiacente. Questo ci permette di visualizzare i cambiamenti morfologici e le interazioni tra le cellule gliali e cellule di carcinoma di fluorescenza e anche mediante microscopia in campo chiaro. Dopo l&#39;esperimento di co-coltura, il tessuto cerebrale o sferoidi cellulari 3D possono essere raccolti e utilizzati per ulteriori analisi molecolari (ad es qRT-PCR, IHC, o immunoblot) nonché per indagini mediante microscopia confocale. Questo metodo può essere applicato per monitorare gli eventi all&#39;interno di un tessuto cerebrale vivente per giorni senza effetti deleteri verso le sezioni di cervello. Il modello permette anche la soppressione selettiva e sostituzione di cellule residenti da cellule da un tessuto donatore per determinare l&#39;impatto distinto di un dato genotipo. Infine, il modello di co-coltura è un&#39;alternativa praticabilein vivo approcci durante il test manipolazioni farmacologiche mirate.

In primo luogo, tutte le cellule di carcinoma utilizzate (umane: MCF-7 e murine: 410,4) invasero la fetta cervello di topo organotipica. L&#39;invasione era quindi specie-indipendenti (Figura 1A), che indica una vasta gamma di applicazioni in modo specie-indipendente. Inoltre, microglia e astrociti accumulati all&#39;interfaccia come precedentemente descritto in vivo e in 13 campioni di pazienti. Time-lapse imaging per un periodo prolungato di tempo ha rivelato non solo la vitalità della fetta, ma anche offerto una buona piattaforma per osservare le interazioni cellulari. Con esperimenti di time-lapse, cellule microgliali sono stati registrati per entrare nella sfera cellulare, mentre in 3D, a sua volta, le cellule tumorali hanno invaso anche la fetta cervello (Figure 1B1-B2). Inoltre, abbiamo precedentemente dimostrato la capacità di microglia trasportare cellule di carcinoma da un meccanismo ancora enigmatico perciò aiutare nell&#39;invasione carcinoma. Utilizzando tecniche di etichettatura immunofluorescenza, abbiamodescritto co-localizzazione delle cellule tumorali e cellule stromali (es microglia e astrociti), sia nel tessuto cerebrale e nella spina delle cellule tumorali (Figure 1C-D), suggerendo una stretta interazione tra queste cellule durante il processo di invasione. Risultati analoghi sono stati ottenuti quando fettine di cervello di topo sono state co-coltivate sia con umano (figure 1C1-C3) o murina (Figure 1D1-D3) cellule di carcinoma - mostra la vasta gamma di applicazioni per lo studio delle cellule provenienti da specie diverse, genotipi e ceppi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1.jpg" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" /> Figura 1. Cervello fetta modello di co-coltura con uno sferoide 3D ​​di topo e cellule di carcinoma umano. A) Quantificazione del cancro invasione delle cellule in organotipica intere co-colture fetta cervello con il cancro al seno del mouse410.4 linea cellulare o una linea cellulare di carcinoma mammario umano MCF-7. I dati rappresentano la percentuale del grado di invasione cellulare in fetta cervello in ciascun gruppo con n ≥ 38. Non vi era alcuna differenza significativa tra i due gruppi (test di Kruskal-Wallis). B) time-lapse immagini di organotipica intere co-colture fetta cervello con le cellule MCF-7-GFP e immagini rappresentative di day2 (B1) e il giorno 5 (B2) sono stati mostrato. immagini di microscopia CD) confocale hanno mostrato coorti di carcinomi, astrociti e microglia. Doppia colorazione di astrociti (anti-GFAP-TRITC, rosso) e microglia (ILB4-Alexa Fluor 647, violetto) dell&#39;intera co-coltura con la fetta cervello 350 micron di spessore organotipico e la spina cellula tumorale GFP-transfettate (verde): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) e 3D-410.4-GFP (D1-D3). Trattini bianchi che il bordo della fetta cervello e la parte anteriore invasione tumorale. Barre di scala rappresentano 50 micron. Microglia, astrociti unnd tumori colocalizations (C1 e D1), astrociti-tumori colocalizations (C2 e D2) e colocalizations microglia-tumorali (C3 e D3) nella co-coltura fetta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a>

Il organotipico coculture fetta cervello con cellule di carcinoma consente la visualizzazione cambiamenti morfologici mediante fluorescenza e campo chiaro (video) microscopia durante il processo di carcinoma invasione delle cellule del tessuto cerebrale. Questo modello di sistema permette anche approcci di scambio cellulare e di rifornimento e offre una vasta gamma di manipolazioni e analisi.

Co-coltura di sistema con un Organotipica cervello Slice e 3D Spheroid delle cellule di carcinoma

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare le interazioni gliali direttamente durante la formazione di metastasi cerebrali. Ciò si ottiene preparando prima fette di cervello organotipiche dai topi. Successivamente, le fette di cervello organotipiche vengono co-coltivate con cellule di carcinoma.Quindi le cellule stromali vengono colorate in fluorescenza con marcatori specifici. Infine, il livello di invasione tumorale viene valutato con un microscopio a fluorescenza. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'interazione e la colocalizzazione delle cellule tumorali della glia attraverso la marcatura in immunofluorescenza e la microscopia time-lapse o confocale.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'iniezione intracerebrale di cellule di carcinoma, è che questo metodo è un'alternativa semplice e offre una buona piattaforma per osservare le interazioni cellulari durante la progressione del tumore. Le implicazioni di questa tecnica sono 10 verso la scoperta di un nuovo e delle terapie selettive per il trattamento del cancro. Poiché le cellule traumatizzate svolgono un ruolo importante nelle metastasi e anche potenziali bersagli per la terapia del cancro, a dimostrare la tecnica sarà Eugenia che consegna un postdoc del mio laboratorio Prima della procedura chirurgica, preparare il terreno di dissezione costituito da un mezzo essenziale minimo, integrato con 0,2 millimolari di glutammina, 100 milligrammi per millilitro di streptomicina e 4,5 milligrammi per millilitro di glucosio dopo aver decapitato i topi da qualsiasi ceppo di topo tra il sesto giorno postnatale e Otto.Utilizzando rapidamente le condizioni asettiche, rimuovere il cervello dal cranio e trasferirlo nel mezzo di dissezione. Rimuovere il polo frontale e il cervelletto dal cervello. Quindi utilizzare la colla criogenica e il 5% di agros per fissare e stabilizzare il tessuto cerebrale rimanente composto dal cervello.Su un palco che utilizza una fetta orizzontale di Vibram, sezioni spesse 350 micron, a seconda della specie e dell'età del topo, raccolgono da quattro a sei fette di cervello intere da un singolo cervello. Dopo aver preparato il terreno di coltura secondo il protocollo di testo, aggiungere un millilitro a ciascun pozzetto inferiore di una piastra a sei pozzetti trans. Quindi posizionare ogni fetta di cervello organotipico su una membrana transwell in policarbonato da 0,4 micron e inserirli nei pozzetti della piastra.Incubare le fette per una notte in un'atmosfera umidificata con il 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, incorporare 10 al quinto tumore trasfettato GFP o altre cellule in 20 microlitri di matrice gel composta da 15% di terreno RPMI e 85% di gel ECM. Posizionare la miscela di sette matrici di gel MCF in distanziatori metallici sterili direttamente adiacenti alle regioni corticali delle fette di cervello organotipiche e incubare per due ore dopo l'incubazione, rimuovere i distanziatori e lasciare che il PHE tumorale 3D incubi con le fette di cervello per 24-96 ore.Se lo si desidera, sostituire il terreno di coltura a giorni alterni. Eseguire l'imaging dal vivo utilizzando la microscopia time-lapse con oggetto con ingrandimento 10x per colorare le colture di co-fette di cervello. Fissarli con aldeide paraforme al 4% per otto ore a quattro gradi Celsius prima di lavare i campioni in PBST per cinque minuti.Quindi, per bloccare i campioni, utilizzare un normale siero di capra in PBST a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, colorare gli astrociti incubando le colture di co con proteina acida fibrillare antigliale, o anticorpo monoclonale GFAP per 36 ore a quattro gradi Celsius, seguita da colorazione anti-topo di capra per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver lavato i campioni con PBST tre volte per cinque minuti ciascuno, colorare le cellule microgliali con I LB quattro, LOR 647 per un'ora a temperatura ambiente prima di controcolorare con DPI per tre minuti a temperatura ambiente.Dopo aver utilizzato un mezzo di montaggio fluorescente per montare i campioni di co-coltura, eseguire l'imaging dei campioni utilizzando un microscopio fluorescente con ingrandimento 25x. Infine, valutare il grado di invasione tumorale in base al seguente sistema di punteggio. Questo misura prima la lunghezza della sezione di contatto tra il tappo tumorale e la fetta, e poi la frazione di contatto rilevabile dalle cellule invasori.Come mostrato qui, tutte le linee cellulari di carcinoma testate hanno invaso fette di cervello di topo organotipiche, suggerendo che il processo di invasione era indipendente dalla specie. Questo filmato mostra una registrazione time-lapse delle interazioni dirette tra le cellule tumorali gliali. Le cellule stromali sono state osservate invadere il tumore contenente il tappo cellulare e interagire con le cellule tumorali.L'imaging time-lapse per un lungo periodo di tempo ha confermato la vitalità delle fette di cervello e ha permesso la visualizzazione delle cellule microgliali che entrano nella sfera tridimensionale, così come delle cellule tumorali che invadono le fette di cervello. Inoltre, come abbiamo precedentemente dimostrato, le microglia trasportano le cellule del carcinoma con un meccanismo ancora enigmatico e assistono nell'invasione del carcinoma utilizzando la marcatura in immunofluorescenza. Abbiamo dimostrato la colocalizzazione di cellule tumorali e stromali sia nel tessuto cerebrale che nei tappi delle cellule tumorali, suggerendo una stretta interazione tra queste cellule durante il processo di invasione.Come si può vedere qui, risultati comparabili sono stati ottenuti quando fette di cervello di topo sono state co-coltivate con cellule di carcinoma umano o urinario, supportando l'ampia gamma di applicazioni per lo studio di cellule di diverse specie, genotipi e ceppi. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle metastasi tumorali per esplorare l'impatto del microambiente durante la colonizzazione del tumore in siti distanti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare le reazioni delle cellule tumorali GL durante la formazione di metastasi cerebrali cellulari in un sistema di contatto fisiologico diretto.

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Questo video dimostra lo sviluppo di un sistema di co-cultura 3D. Fette di cervello di topo vengono posizionate su una membrana e le cellule tumorali cerebrali umane marcate in fluorescenza possono crescere su di essa. Una volta che il sistema è pronto, viene colorato per l'imaging.

Stabilire un tumore cerebrale in un modello di co-coltura a fette organotipiche

Il video dimostra la generazione e il mantenimento di colture organotipiche di fette da tessuto di glioblastoma. Il tessuto isolato è incorporato in una matrice di agarosio e sezioni sottili sono ottenute utilizzando un vibratomo. Queste sezioni vengono quindi posizionate su inserti di membrana permeabili all'interno di una micropiastra e coltivate in un terreno di mantenimento della coltura a fette per un mantenimento a lungo termine.

Generazione e mantenimento di colture di fette da tessuto di glioblastoma umano

Questo video descrive la preparazione e la coltivazione di organoidi tumorali cerebrali da sospensioni unicellulari. Utilizzando una matrice extracellulare ricca di laminina come impalcatura e terreno di coltura per i nutrienti, le cellule sono facilitate a moltiplicarsi e auto-organizzarsi all'interno dell'organoide. Di conseguenza, vengono generati organoidi ex vivo, che imitano la diversità cellulare e il microambiente dei tumori cerebrali.

Generazione di una coltura di organoidi da una sospensione di cellule tumorali cerebrali

L'invasione dei tessuti normali circostanti è una caratteristica distintiva dei tumori maligni. Forniamo qui un semplice saggio semi-automatico su micropiastra dell'invasione in una biomatrice 3D naturale che è stata esemplificata con una serie di modelli di tumori umani avanzati.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Molti tipi di tumori cerebrali umani sono localizzati in regioni specifiche all'interno del cervello e sono difficili da coltivare in coltura. Questo protocollo affronta il ruolo del microambiente tumorale e studia nuovi trattamenti farmacologici analizzando le cellule tumorali cerebrali primarie fluorescenti che crescono in una fetta di cervello di topo organotipico.

Un tumore cerebrale / organotipica fetta sistema di co-coltura per lo Studio microambiente tumorale e mirata terapie farmacologiche

I modelli attuali ex vivo di glioblastoma (GBM) non sono ottimizzati per studi fisiologicamente rilevanti di invasione tumorale umana. Qui presentiamo un protocollo per la generazione e la manutenzione di culture organiche di fetta da tessuti freschi umani GBM. Viene fornita una descrizione della microscopia a tempo trascorso e tecniche quantitative di analisi delle migrazioni di cellule.

Un modello di cultura organica fetta di Glioblastoma umano per lo studio della migrazione delle cellule tumorali e degli effetti specifici del paziente di farmaci antiinvasivi

Colture organotipiche fettine di ippocampo (OHSC) rappresentano un modello in vitro che simula molto bene la situazione in vivo . Qui descriviamo un basato su vibratome migliorato affettare protocollo per ottenere fette di alta qualità per uso nel valutare il potenziale di neuroprotective del romanzo sostanze o il comportamento biologico delle cellule del tumore.

Colture Hippocampal Fetta organotipiche come modello di studio Neuroprotection e l'invasività delle cellule del tumore

Qui, descriviamo un assaggio di invasione facile da usare per il glioblastoma. Questo test è adatto per cellule staminali del glioblastoma. Viene descritta anche una macro Fiji per una facile quantificazione dell'invasione, della migrazione e della proliferazione.

Un modello spheroid 3D per Glioblastoma

Mancano modelli completi in vitro che ricapitolino fedelmente la malattia umana pertinente. Il presente studio presenta la creazione e la coltura tridimensionale (3D) di sferoidi tumorali, uno strumento affidabile in vitro per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare umano.

Un modello sferoide tridimensionale per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare

Gli embrioni di pulcino sono utilizzati per studiare i tumori cerebrali del glioblastoma umano (GBM) in ovo e in co-colture di fette cerebrali ex vivo. Il comportamento delle cellule GBM può essere registrato mediante microscopia time-lapse in co-colture ex vivo, ed entrambi i preparati possono essere analizzati all'endpoint sperimentale mediante analisi confocale 3D dettagliata.

Utilizzo del cervello dell'embrione di pulcino come modello per analisi in vivo ed ex vivo del comportamento delle cellule di glioblastoma umano

C'è un bisogno critico di modelli di cancro 3D che catturino il crosstalk eterocellulare per studiare le metastasi del cancro. Il nostro studio presenta la generazione di epiteliali stromali eteromulticellulari in un ambiente privo di scaffold e scaffold che può essere utilizzato per studiare l'invasione e le distribuzioni spaziali cellulari.

Cellule stromali eteromulticellulari in colture 3D prive di scaffold di cellule tumorali epiteliali per guidare l'invasione

Scopri la co-coltura di fette cerebrali organotipiche con cellule di carcinoma per visualizzare le interazioni gliali durante la metastasi cerebrale. Questo metodo offre una piattaforma per studiare l'invasione tumorale in tempo reale.

Co-coltura di sistema con un Organotipica cervello Slice e 3D Spheroid delle cellule di carcinoma

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