Name: La produzione di apolipoproteina C-III Conigli Knockout utilizzando zinco nucleasi dito (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Scopri come generare conigli knockout per l'apolipoproteina C-III utilizzando nucleasi a dito di zinco. Questo metodo avanzato consente di creare modelli animali per lo studio delle malattie cardiovascolari umane.

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Questo lavoro è stato parzialmente finanziato da sovvenzioni dal National Institutes of Health (HL105114, HL088391, NS066652, e HL068878 a YEC), l&#39;American Heart Association (National Scientist Development 0835237N a JZ). YEC è sostenuto finanziariamente come dotato di Federico Huetwell Professore di Medicina Cardiovascolare presso l&#39;Università del Michigan Medical Center (UMMC). Questo lavoro utilizzato Core Services supportati dal Center for Advanced Models per le Scienze e traslazionale Therapeutics (CAMTraST) a UMMC.

Tutte le procedure di manutenzione degli animali, la cura e l&#39;uso sono stati esaminati e approvati dal Comitato Università sull&#39;uso e la cura degli animali della University of Michigan. 1. ZFN Progettazione e Selezione <ol><li> Fornire le informazioni di sequenza genomica del gene di interesse (ad es coniglio ApoCIII) al fabbricante. Selezionare set ZFN (s) per gli esperimenti sulla base dei punteggi ZFN. </li></ol> 2. Coniglio Embryo Collection <ol><li> Superovulate sessualmente maturata (6-18 mesi) New Zealand White (NZW) coniglie per via sottocutanea (sc) iniezione di FSH due volte / die con un dosaggio di 3 mg per i primi due conferimenti, 5 mg per i prossimi due iniezioni e 6 mg per gli ultimi due iniezioni. </li><li> Somministrare una singola (iv) l&#39;iniezione endovenosa di 200 IU hCG a 72 ore dopo la prima iniezione FSH per indurre l&#39;ovulazione. Mate le femmine superovulate con un coniglio maschio subito dopo l&#39;iniezione di hCG. </li><li> Euthanize conigli donatori superovulate con sodio pentobarbital (150 mg / kg, iv) a 16-18 hr posto inseminazione (psi). </li><li> Recuperare le ampolle oviduct raccogliendo attentamente l&#39;intero ovidotti e ovaie struttura. </li><li> Scarica ogni oviduct con la manipolazione 10 ml di mezzo di tamponata con HEPES TCM 199 supplementato con siero bovino fetale al 10%, iniettando il mezzo dall&#39;estremità utero dell&#39;ovidotto. Raccogliere il mezzo arrossato all&#39;apertura ovaio-end dell&#39;ovidotto ad una piastra di Petri. </li><li> Osservare e identificare gli embrioni recuperati nel mezzo arrossato, lavare gli embrioni tre volte nel mezzo di manipolazione, tenerli nel mezzo di manipolazione a 38,5 ° C in aria, e osservare allo stereomicroscopio per il verificarsi di fecondazione. Preparazione per la microiniezione su embrioni pronuclei palco 19-21 h psi </li></ol> 3. Preparazione di ZFN mRNA <ol><li> Purificare il mRNA risultante prima risospensione in RNasi-free 0,1 X. TE (1 mM Tris-Cl pH8,0, 0,1 mM EDTA). Misurare la concentrazione e memorizzare l&#39;mRNA a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Preparare gli mRNA codificanti ZFN coppia (4-10 ng / ml in 1 mMTris-Cl, 0,1 mM EDTA a pH 7.5), un&#39;aliquota in 10 fiale microlitri. Conservarli a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. Prima di microiniezione, scongelare il flaconcino RNA (s), e tenerlo in ghiaccio. </li></ol> 4. Embrione microiniezione <ol><li> Preparare la piattaforma microiniezione mettendo una goccia 5 ml di mezzo di manipolazione su un vetrino camera 1-bene che ha la camera di supporto rimossa. Coprire il calo medio con olio minerale e posto sul palco microscopio riscaldata. </li><li> Pipetta possesso (120 micron di diametro) nel braccio titolare del micromanipolatore e posizionarlo nella goccia di mezzo manipolazione. </li><li> Realizzare micropipette iniezione da riscaldamento e tirando tubi capillari in vetro borosilicato in un dispositivo micropipetta estrattore. Caricare il mRNA da iniettare nella pipetta di iniezione. </li><li>Accendere l&#39;aria compressa che è collegato ad un microinjector. </li><li> Pipetta iniezione nel supporto di iniezione, metterlo sul micromanipolatore e posizionarlo nella goccia di mezzo manipolazione. </li><li> Impostare il microinjector, con i seguenti parametri suggeriti: holdP = 2 psi, InjP = 20 psi, ClearP = 60 psi, Injtime = 1 sec, che si tradurrà in un volume di iniezione di 1-5 pl. </li><li> Aprire la punta della pipetta di iniezione picchiettando delicatamente contro la pipetta azienda. </li><li> Trasferire embrioni (30-50) al calo micromanipolazione sulla piattaforma. Utilizzare la pipetta azienda per catturare un embrione e allineare l&#39;ago per l&#39;iniezione, embrioni e la pipetta tenuta lungo l&#39;asse x. </li><li> Sotto 400X, avanzare la pipetta di iniezione attraverso l&#39;embrione. Fare attenzione a evitare il nucleo. Una volta che la membrana plasmatica è trafitto, premere il pedale del piede per iniettare. Dopo l&#39;iniezione, ritirare l&#39;ago, rilasciare l&#39;embrione. Ripetere la procedura per tutti em rimanentibryos. </li><li> Lavare embrioni iniettati tre volte in embrione terreno di coltura, che consiste in soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS) supplementato con amminoacidi non essenziali (NEAA), amminoacidi essenziali (EAA), 1 mM L-glutammina, piruvato di sodio 0,4 mM, e 10% FBS. </li><li> Incubare embrioni a 38,5 ° C in 5% CO 2 in aria per 1-2 ore prima di essere chirurgicamente trasferiti nei ovidotti di un destinatario sincronizzato femmina NZW coniglio (vedere la fase 5.1). In alternativa, la cultura gli embrioni fino a raggiungere stadio di blastocisti prima di essere utilizzati per la validazione in vitro o saggi. </li></ol> 5. Embryo Transfer <ol><li> Selezionare una femmina di coniglio NZW 5-12 mesi di età, in buona salute, del peso di ca. 4,0-5,0 kg come destinatario degli animali. Somministrare rilasciante le gonadotropine (GnRH) intramuscolare iniezione (im, 50 mcg / ml, 0,3 ml / animale) al destinatario nello stesso punto temporale con quella di hCG iniezione al donatore (s) (vedi passo 2.2). </li&gt; <li> Dopo il completamento della microiniezione, preparare il coniglio destinatario per il trasferimento dell&#39;embrione (normalmente 16-24 ore dopo l&#39;iniezione GnRH). Anestetizzare il coniglio con 10-40 mg / kg di ketamina (im), e / o vaporizzato isoflurano (2-4%) per inalazione. Proteggere gli occhi dei conigli da eccessivo essiccamento mediante l&#39;applicazione di una pomata oftalmica sterile. Osservare l&#39;animale fino a quando non è completamente inconscio, vale a dire. non risponde ai riflessi pedale, stringendo il rilievo del piede viene utilizzata per controllare per mancanza di pedale riflesso che è un&#39;indicazione di anestesia adeguata. </li><li> Shave addome del coniglio, lavare con scrub antisettico, seguita da soluzione antisettica, e pulire la zona rasata con spugne garza sterile. </li><li> Eseguire un intervento chirurgico in condizioni sterili, registrare i segni vitali del coniglio destinatario circa ogni 15 min durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Trasferire 10-25 embrioni a un destinatario animale, a seconda del numero disponibile di embrioni. </li><li> Alla fine delprocedure chirurgiche, chiudono lo strato muscolare con rivestito sutura riassorbibile. Suturare la pelle o con una sutura intradermica con sutura riassorbibile o con semplici suture cutanee interrotti mediante sutura nonabsorable (ad es monofilo di nylon o simile). </li><li> Tenere il caldo animale e monitorarlo fino alla sua decubito sternale è raggiunto. </li><li> Monitorare l&#39;animale al giorno. Seguire le istruzioni del veterinario per la cura per l&#39;animale. Somministrare meloxicam (sc 1,0 mg / kg) per alleviare il dolore e / o ridurre la febbre operazione di post al giorno, se ritenuto necessario dal veterinario. </li><li> Rimuovere suture cutanee nonabsorable a circa 10-14 giorni dopo l&#39;operazione. </li></ol> 6. Rilevamento di ZFN indotta Turbativa Gene <ol><li> Per validazione in vitro, eseguire la genotipizzazione sulle embrioni coltivati ​​in vitro. Lisare embrioni singoli che si sono sviluppati a tappe morula / blastocisti in 5 ml soluzione NP40 (1% NP40 più 1 ug / ml proteinasi K in Taq Buffer) Per 0,5-1 ore a 55 ° C e 10 min a 95 ° C. </li><li> Per la genotipizzazione della prole, raccogliere campioni di pelle dell&#39;orecchio da kit neonati, estrarre il DNA genomico, e li usa come modelli per PCR sequenziamento. Applicare Kwik-Stop per la zona di campionamento dopo la raccolta per fermare l&#39;emorragia e ridurre il disagio. </li><li> Utilizzare la lisi dal punto 6.2 o 6.3 come stampo per la PCR utilizzando LA-Taq PCR e coppia di primer, che si trovano a monte (5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 &#39;) ed a valle (5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3&#39;) del sito bersaglio ZFN . </li><li> Purificare prodotti di PCR e di sequenza con la sequenza di primer (5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 &#39;). </li><li> Identificare i campioni mutanti, cercando di doppia curva nel diagramma di sequenza attorno al targeting per sito. Etichettare quelli con curve doppie come &quot;positivo&quot;. </li><li> Clonare i prodotti di PCR &quot;positivi&quot; in TA vettore di clonazione, raccogliere 10-20 cloni, sequenza gli inserti, e confermare le mutazioni in tutto il tsito argeting. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nel presente lavoro, cinque conigli ApoCIII KO sono stati generati utilizzando la tecnologia ZFN. In precedenza l&#39;unico rapporto della produzione di conigli GTT utilizzato anche la tecnologia ZFN 18. Il presente lavoro ha confermato che ZFN è utile per raggiungere in modo efficace i geni nei conigli. Nel presente studio, il tasso di transgenico (kit positivo / totale nato) is23.8% (5/21), che è paragonabile a quello della precedente relazione ZFN nei conigli (30,8%, 16/52) 18, e quelli segnalati di utilizzare ZFN in altre specie animali, tra cui pesce zebra 19, 20 topi, ratti e maiali 21 17. Questo tasso è infatti superiore ai tassi di molti studi di produzione coniglio transgenico tradizionali, che normalmente rientrano nel range del 5-20%. Ad esempio, nel tentativo di prodotto ApoCIII conigli transgenici mediante microiniezione di DNA convenzionali, Ding et al. Ottenuto 3 fondatori positivi su 54 cuccioli nati (5,6%) 22. Coerentemente con i risultati precedenti, le mutazioni nei siti di targeting sono variabili, tra cui delezioni o inserzioni costituiti da un diverso numero di basi (che vanno 1-21 in cinque conigli KO). Sulla base delle informazioni di sequenza specifica degli animali fondatori, si prevede che almeno quattro (cioè. Quelli contenenti Δ1, +1, +1, o Δ20 mutazioni) avrebbe perdita di funzionalità della ApoCIII. R-16 animale con Δ21 non può visualizzare perdita funzionale, in quanto questa mutazione è previsto per solo causare la perdita di sette amminoacidi, ma non un cambiamento reading frame. In ultima analisi, saggi fenotipo sono necessari per determinare se questi animali fondatori veramente mostrano la perdita delle funzioni ApoCIII. Nessuno dei cinque conigli KO generati nel presente studio contiene modifiche biallelici. È interessante notare che questo è anche il caso nella precedente relazione coniglio ZFN. Al contrario, quando ZFNs rivolti α1 ,3-galattosiltransferasi stati applicati al maialecellule, la frequenza di mira un singolo allele variava 7-46%, con circa un terzo dei creando mutazioni passo singolo biallelica Fori a sfondare 23. Coerentemente, quando TALEN è stato applicato a cellule di fibroblasti maiale, le modifiche biallelici trovata in circa 15-40% del totale dei cloni positivi 14. E &#39;possibile che la mancata produzione conigli KO biallelici nel presente studio può indicare una differenza specie (cioè conigli vs suini) per tale capacità di nucleasi basato gene targeting. È tuttavia più probabile che questo è semplicemente perché il numero di conigli KO generati in questo progetto è relativamente piccola. Noi crediamo che ZFN è in grado di generare mutazioni bialleic nei conigli, che dovrebbero essere considerati come un altro potenziale vantaggio della produzione di coniglio GTT basata ZFN. Ulteriori esperimenti sono necessari per confermare tale capacità di ZFN nei conigli. In conclusione, il presente lavoro dimostra che ZGenica basata FN approccio mirato è efficace nel produrre conigli KO. In particolare, abbiamo generato cinque conigli ApoCIII KO con un tasso transgenico soddisfacente del 23,8%. Questi animali si ritiene di fornire informazioni più significative sul ruolo di questa proteina sul metabolismo dei lipidi nell&#39;uomo rispetto ai corrispondenti modelli del mouse. Prevediamo il targeting genica basata ZFN, così come altre tecnologie nucleasi based come TALEN e RGEN, negli animali nonmurine faciliterà notevolmente lo sviluppo di nuovi modelli animali per studiare varie malattie umane. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Diagramma di flusso della produzione di conigli eliminazione diretta utilizzando la tecnologia ZFN. Produzione di conigli KO con tecnologia ZFN inizia con la selezione del gene di interesse. Le informazioni di sequenza viene fornito, set ZFN sono progettati e Subjette a base di lievito di convalida in casa. Al punto di controllo (CP) 1 (CP-1), solo i set passati di convalida in casa (50% o superiore del controllo interno positivo) saranno forniti agli utenti per la selezione. Se nessun set passano CP-1, sequenza aggiuntiva può essere necessario per la progettazione di efficaci set ZFN. Una convalida embrione in vitro è seguito per assicurare il set ZFN selezionato può indurre mutazioni in siti selezionati (CP-2). Set ZFN (s) sarà usato solo se passa CP-2 (&gt; = 10% i tassi di mutazione in embrioni in vitro). Guasto al CP-2 richiederà una riprogettazione dei set ZFN. I donatori di embrioni saranno preparati ed embrioni pronuclei fase saranno microiniettati con i set ZFN convalidati. Questi embrioni microiniettati saranno trasferiti ai destinatari embrione sincronizzati. Dopo periodo di un mese di gestazione, neonati saranno genotipizzati (CP-3). Se nessuno dei neonati sono positivi, verrà eseguita microiniezione supplementare. Ci vogliono 2-3 mesi dall&#39;inizio del progetto alla CP-2, assumendo no guasto durante il processo. Ci vogliono altri 2-3 mesi dalla CP-2 per CP-3. Pertanto è possibile generare un coniglio ko in un arco di tempo di 4-6 mesi utilizzando la tecnologia ZFN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Disegno ZFN. Tre set ZFN (Set 1, 2, e 3) sono stati progettati mira diverse sequenze di Exon 1 o Exon 2 di coniglio ApoCIII (A). Tutti e tre i gruppi sono stati sottoposti al lievito MEL-1 giornalista test per determinare le attività ZFN. Secondo protocolli del produttore, ZFNs che mostrano attività&gt; 50% di quella del controllo positivo interno della fabbricazione sono considerati utili per in vitro e in vivo genoma esperimenti di editing.Le attività ZFN erano 224,2% per Set 1, 196,9% per Set 2 e 177,8% per Set 3 (B), quindi Set 1 è stato selezionato nel presente studio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3. In vitro convalida embrione di ZFN. L&#39;mRNA (5 pg / ml) di Set 1 è stato microiniettati al citoplasma di 35 embrioni pronuclei fase di coniglio (A). Embrioni cancellato senza trattamento microiniezione (n = 31) sono stati utilizzati come gruppo di controllo. Il tasso di sviluppo BL era 77,4% nel gruppo di controllo. Nel gruppo microiniezione, il tasso di BL è stata del 51,4%. 16 BL sottoposti a PCR sequenziamento, 8 (50%) sono stati identificati come positivi, indicando Set 1 è un set ZFN efficace per indurre mutazioni al targesito ting (B, apoc3wt.seq, black-boxed), del ApoCIII nei conigli. La BLS contenenti mutazioni sono BL # Ap-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, e 17 (B, rosso sottolineate). I restanti BL (# Ap-2, 6, 9, 10, 12, 14 e 16) non hanno mutazioni presso il targeting per sito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> Figura 4. La produzione di conigli ApoCIII KO. Cento e quarantacinque embrioni microiniettati con ZFN Set 1 mRNA sono stati trasferiti a 7 conigli destinatario pseudo-gravidanza (A). Embrioni appena lavata (n = 75) senza ZFN microiniezione sono state trasferite a destinatari (n = 6) come gruppo di controllo. Il tasso di termine calcolato come kit totale termine / embrioni totali nel gruppo dell&#39;esperimento è di 14.5% (21/145), mentre il tasso è del 29,3% (22/75) nel gruppo di controllo (A). Su 21 kit nati nel gruppo microiniezione, cinque (R1, R9, R11, R12 e R16), dopo PCR sequenziamento (B) sono stati identificati come i kit positive KO. I indels presso il targeting per sito comprendono due inserimenti (+1 per entrambi R9 e R11) e tre eliminazioni (Δ1, Δ 20, Δ 21 per R1, R12 e R16, rispettivamente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

Apolipoproteina (Apo) C-III (ApoCIII) è una piccola proteina secretoria O-glicosilata che viene sintetizzata principalmente nel fegato e nell&#39;intestino. Esso risiede sulla superficie del plasma chilomicroni (CM), lipoproteine ​​a bassissima densità (VLDL) e lipoproteine ​​ad alta densità (HDL). ApoCIII è stata riconosciuta come un fattore di rischio per la malattia cardiovascolare 1. I pazienti con deficit ereditario di ApoCIII hanno un basso trigliceridi (TG) i livelli e riduzione subclinica coronarica aterosclerosi 2,3. Veduta livello ApoCIII plasma, d&#39;altra parte, spesso correlata alla resistenza all&#39;insulina, obesità, e ipertrigliceridemia (HTG) 4,5. Gene knockout (KO) è un potente mezzo per studiare la funzione di un gene. Coerentemente con le osservazioni in popolazioni mutanti umani, knockout del gene ApoCIII nei topi ha portato ad una riduzione del plasma TG e protezione da HTG postprandiale 6. Tale ruolo positivo di ApoCIII apparveessere indipendente Apolipoproteina E (ApoE), come topi deficienti sia di ApoE e ApoCIII sono anche protetti da iperlipidemia postprandiale 7. Sebbene questi modelli murini ApoCIII KO hanno fornito informazioni preziose sulle possibili funzioni di ApoCIII nell&#39;uomo, si osserva che il metabolismo della lipoproteina di topi è diverso da quello degli umani in molti aspetti. Ad esempio, mouse manca plasma cholesteryl proteina di trasferimento degli esteri (CETP), un importante enzima coinvolto nel trasporto di VLDL, LDL, HDL e 8. Pertanto, è necessario sviluppare un modello animale appropriato per meglio comprendere il ruolo fisiologico di ApoCIII in vivo. Il coniglio è un classico modello di specie animali 9-11. Ha un breve periodo di gestazione (30-31 giorni), di grandi dimensioni cucciolata (4-12/litter) e può essere alloggiato comodamente in una struttura indoor. Rispetto ai topi, conigli sono più affine all&#39;uomo 10. È importante sottolineare che, come huuomo, ma a differenza di topi, conigli sono mammiferi ricchi di LDL e hanno livelli sostanziali di CETP 10,12. Inoltre, essi sono suscettibili di aterosclerosi indotta dalla dieta ricca di colesterolo con le lesioni simili a quelle osservate in aterosclerosi umana 13. Per queste ragioni, abbiamo ipotizzato che i conigli ApoCIII KO può servire come un modello migliore rispetto ai loro omologhi di topo per studiare i ruoli di ApoCIIIplay nel metabolismo dei lipidi e aterosclerosi nell&#39;uomo. Produzione di gene targeting transgenici (GTT) conigli è stata una sfida. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di linea germinale trasmissione cellule staminali embrionali (ESC), e la bassissima efficienza di trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) in conigli. ESC è lo strumento principale per generare topi GTT, che e SCNT è stato applicato con successo per generare animali KO in specie manca linea germinale CES trasmissione, compresi i suini, ovini e bovini, ma non conigli. Recentemente Zinc Finger nucleasi (ZFN), Transcrizione Activator-Like Effettuatore Nuclease (TALEN) 14, e RNA Endonuclease guidata (RGEN) 15 emersi come mezzi potenti per la modifica del genoma. Questi nucleasi, i cosiddetti &quot;forbici molecolari&quot;, sono efficaci nel generare rotture del doppio filamento (DSB) nel genoma che possono portare ad un KO funzionale del gene targeting o utilizzati per integrare una sequenza di DNA in un luogo specifico nel genoma in un certo numero di specie 16. Nel 2011, tra i primi adattare la tecnologia ZFN, abbiamo generato proliferazione dei perossisomi-activated receptor gamma (PPAR) KO le cellule suine tramite questo approccio e generati con successo maiali PPAR KO dopo l&#39;utilizzo di queste cellule per SCNT 17. Nello stesso anno, efficiente perturbazione gene immunoglobuline e sostituzione mirata nei conigli utilizzando anche ZFN è stato segnalato 18. Nel presente studio, cinque conigli ApoCIII KO sono stati generati come confermato mediante PCR sequenziamento, utilizzando Set ZFN 1 (vedere la Figura 1 </strong&gt;. per il diagramma di flusso illustrazione). Questi animali sono nuove risorse per studiare i ruoli di ApoCIII nel metabolismo dei lipidi.

<table><tbody><tr><td>APOC3-ZFN</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CSTZFNY-1KT</td><td>Gene bersaglio: APOC3, Numero di lotto: 12201118MN</td></tr><tr><td>Kit mMESSAGE</td><td>Invitrogen</td><td>AM1344M</td><td>sintesi di mRNA</td></tr><tr><td>Kit MEGAclear.</td><td>Invitrogen</td><td>AM1908M</td><td>purificazione dell'mRNA</td></tr><tr><td>Ormone follicolo-stimolante</td><td>Bioniche Life Sciences</td><td>Folltropin-V</td><td>Trattamento di conigli donatori di embrioni</td></tr><tr><td>Gonadotropina corionica umana</td><td>Intervet</td><td>Chorulon</td><td>Trattamento di conigli donatori di embrioni</td></tr><tr><td>Ormone di rilascio delle gonadotropine</td><td>Prospecbio</td><td>HOR-255</td><td>Trattamento di conigli riceventi di</td></tr> <tr><td>embrioniSoluzione salina bilanciata di Earle (EBSS)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30029.02</td><td>Coltura embrionale, terreno base</td></tr><tr><td>MEM (aminoacido non essenziale)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7145</td><td>Coltura embrionale, integratori</td></tr><tr><td>BME AMINOACIDI soluzione</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6766</td><td>Coltura embrionale, integratori</td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td>Coltura embrionale, integratori</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Coltura embrionale, integratori</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td>Coltura embrionale, integratori</td></tr><tr><td>HEPES buffered TCM 199&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12350039</td><td>Terreno di manipolazione embrionale</td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170</td><td>Attrezzatura per la coltura di embrioni</td></tr><tr><td>Micromanipolatore&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>TransferMan NK 2</td><td>Attrezzatura per la manipolazione degli embrioni</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instruments Inc.</td><td>P-1000</td><td>Attrezzatura per la manipolazione degli embrioni</td></tr><tr><td>Microiniettore&nbsp;</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-D</td><td>Attrezzature per la manipolazione degli embrioni</td></tr><tr><td>Tubi capillari in vetro borosilicato&nbsp;</td><td>Strumenti di precisione del mondo, Inc.</td><td>TW100F-6</td><td>Fornitura per la manipolazione degli embrioni</td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbitolo sodico)</td><td>Virbac AH, Inc.</td><td>ANADA#200-071</td><td>Eutanasia di conigli donatori di embrioni</td></tr></tbody></table>

la produzione di apolipoproteina c-iii conigli knockout utilizzando zinco nucleasi dito

Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Apolipoproteina (Apo) C-III (ApoCIII) risiede sulla superficie del plasma chilomicroni (CM), lipoproteine ​​a bassissima densità (VLDL) e lipoproteine ​​ad alta densità (HDL). E &#39;stato riconosciuto che alti livelli di plasma ApoCIII fattore di rischio COSTITUIRE per malattie cardiovascolari (CVD). Elevati livelli plasmatici ApoCIII spesso correla con l&#39;insulino-resistenza, obesità, e ipertrigliceridemia. Conoscenze per il ruolo di ApoCIIIin metabolismi lipidici e CVD è stato ottenuto da modelli di topi transgenici compresi ApoCIII knockout (KO) topi, tuttavia, si osserva che il metabolismo di lipoproteine ​​nel topo è diverso da quello degli umani in molti aspetti. Non è noto fino ad ora se elevato plasma ApoCIII direttamente aterogenica. Abbiamo lavorato per sviluppare conigli ApoCIII KO nel presente studio basata sull&#39;ipotesi che i conigli possono servire come reasonablemodelfor studio del metabolismo lipidico umano e aterosclerosi. Zinc finger nucleasi (ZFN) insiemi di targeting coniglio ApoCIIIgene sono stati sottoposti a validazione in vitro prima embrione microiniezione. L&#39;mRNA è stato iniettato nel citoplasma di 35 embrioni di coniglio pronuclei stadio, e valutato i tassi di mutazione allo stato di blastocisti. Di sedici blastocisti che sono stati dosati, un ritmo soddisfacente 50% mutazione (8/16) presso il targeting per sito è stato raggiunto, sostenere l&#39;uso di Set 1 per esperimenti in vivo. Successivamente, abbiamo microiniettato 145 embrioni con Set 1 mRNA, e trasferito questi embrioni a 7 conigli destinatario. Dopo 30 giorni di gestazione, 21 kit sono nati, di cui cinque sono stati confermati come conigli ApoCIII KO dopo PCR test di sequenziamento. Il tasso di animali KO (# kit KO / totale nati) è stata del 23,8%. L&#39;efficienza produttiva complessiva è del 3,4% (5 kits/145 embrioni trasferiti). Il presente lavoro ha dimostrato che ZFN è un metodo molto efficiente per produrre conigli KO. Questi conigli ApoCIII KO sono nuove risorse per studiare ruoli di ApoCIII nel metabolismo dei lipidi.

In validazione in vitro di coppie ZFN Sedici coppie ZFN sono state inizialmente concepite. La sequenza distruzione mirata Set 1 è situato in esone 2 di coniglio ApoCIII (Figura 2A). Tre coppie (Set 1, 2, e 3, Figura 2A) sono stati selezionati e sottoposti al lievito MEL-1 test giornalista per determinare le attività ZFN (Figura 2b). Set 1 ha un punteggio ZFN del 224,2%, superiori a quelli di Set 2 (196,9%) e Set 3 (177,8%) e molto superiore alla soglia di selezione (ossia il 50% del controllo interno positivo). Pertanto Set 1 è stato selezionato per esperimenti di validazione in vitro. Un insieme particolare deve comportare un tassi positivi in embrioni di 10% o superiore per passare la validazione in vitro dell&#39;embrione, sulla base dei criteri di validazione interna. L&#39;mRNA (5 pg / ml) di Set 1 è stato microiniettati al citoplasma di 35 pronuclei embrioni fase di coniglio (Figura 3A &lt;/ Strong&gt;). Embrioni cancellato senza trattamento microiniezione (n = 31) sono stati utilizzati come gruppo di controllo. Diciotto embrioni del gruppo microiniezione sviluppati per fase BL su D5, di cui sedici sono stati sequenziati, e otto (BL # Ap-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, Figura 3B, rosso sottolineate) visualizzati mutati sequenze del targeting per sito (nero-scatola, figura 2B, fila in alto, apoC3wt.seq). Il tasso BL del gruppo microiniezione (51,4%) è inferiore a quella del gruppo di controllo (77,4%), indicando competenza allo sviluppo leggermente alterata di embrioni microiniettati. Il tasso di mutazione positiva degli embrioni microiniettati è 50,0% (8/16), molto superiore alla soglia di selezione (10%). Questi risultati hanno rivelato che 1 Set è un set ZFN efficace per indurre mutazioni nel sito di mira ApoCIII coniglio. Pertanto Set 1 è stato scelto per la produzione in vivo di conigli ApoCIII KO. La produzione di conigli ApoCIII KO L&#39;mRNA of Set ZFN 1 è stato microiniettato al citoplasma di coniglio embrioni pronuclei stadio, e trasferiti 145 embrioni microiniettati a 7 conigli destinatario pseudo-gravidanza (Figura 4A). Embrioni appena lavata (n = 75) senza ZFN microiniezione sono state trasferite a destinatari (n = 6) come gruppo di controllo. Dopo 30 giorni di gestazione, 21 kit sono nati nel gruppo microiniezione. PCR sequenziamento ha identificato cinque (APOC3-R1, R9, R11, R12 e R16) in kit KO positivi (Figura 4B). Il tasso di termine calcolato come kit totale termine / embrioni totale è del 14,5% (21/145), mentre il tasso è del 29,3% (22/75) nel gruppo di controllo. Il tasso KO calcolato come kit in totale KO / totale termine è del 23,8% (5/21). Un kit KO (Ap-R16) è morto cinque giorni dopo il parto (20,0%, 1/5). Il indelsat il targeting per sito comprendono due inserzioni e delezioni tre, ma areΔ1, +1, +1, Δ20 e Δ21, per Conigli # R1, R9, R11, R12, e R16, rispettivamente (Figura 4B). Bianalisi oinformatics è stato utilizzato per identificare il potenziale ZFN off-target con 7 o meno mismatch a Set 1 sequenza, come descritto in precedenza 17. Solo uno predetto possibile sito off-target, localizzato sul cromosoma 14, è stato identificato con 7 bps corrispondenti. PCR rilevato nessun evento fuori bersaglio in nessuno degli animali fondatori.

Recenti sviluppi nel gene strumenti di targeting rende la produzione di knockout (KO) conigli possibile. Nel presente lavoro, abbiamo generato cinque conigli apolipoproteina (Apo) C-III KO con zinco nucleasi dito (ZFN). Questo lavoro ha dimostrato che ZFN è un metodo molto efficiente per produrre conigli KO.

La produzione di apolipoproteina C-III Conigli Knockout utilizzando zinco nucleasi dito

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare nuovi modelli di coniglio per lo studio delle malattie cardiovascolari umane. Questo risultato viene ottenuto innanzitutto progettando e sintetizzando nucleasi a dita di zinco che bersagliano il gene di interesse. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'iniettare microscopica­mente gli RNA delle ZFN nel citoplasma di embrioni allo stadio pronucleare.Il terzo passaggio consiste nel trasferire chirurgicamente gli embrioni in una coniglia ricevente. L'ultimo passaggio prevede il genotipaggio dei nuovi nati per identificare gli animali transgenici. Nel complesso, il targeting genico mediante ZFN è altamente efficace e viene qui dimostrato attraverso la creazione di un coniglio knock-out per A OC tre.Questa tecnica rappresenta un punto di riferimento nell'ingegneria genetica poiché è la prima ad aver reso possibile la produzione di conigli privi di codice. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di numerose malattie umane, come le malattie cardiovascolari. È sempre più evidente come siano necessari modelli animali di grandi dimensioni per riprodurre in modo più accurato la fisiologia e la patologia umana.L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo letto l'articolo che riportava un efficace targeting genico mediante l'uso di nucleasi significative nel 2009. In generale, le persone a conoscenza di questo metodo potrebbero incontrare difficoltà, poiché richiede l'iniezione microscopica nel citoplasma di un costrutto. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni preziose sul targeting genico nei conigli, potrebbe essere applicato anche ad altri sistemi, come ad esempio i suini.Iniziare con la superovulazione di conigli albini di Nuova Zelanda sessualmente maturi, utilizzando un'iniezione sottocutanea di FSH due volte al giorno per un periodo di tre giorni, aumentando la dose quotidianamente. 72 ore dopo l'ultima iniezione di FSH, iniettare 200 UI di HCG per via endovenosa per indurre l'ovulazione nei soggetti femminili superovulati immediatamente dopo. In questo momento, è necessario preparare anche un animale ricevente.16-18 ore dopo l'inseminazione, eutanasia i conigli donatori superovulati con pentobarbital sodico. Recupera il tubo uterino (UCT) raccogliendo con attenzione l'intero utero. Lavare le strutture delle ovaie e dei tubi uterini (UCS) e dei tubi uterini (UCT) con 10 millilitri di mezzo di manipolazione, iniettando il mezzo dall'estremit&agrave; uterina dell'UCT.Raccogliere il mezzo lavato all'estremità ovarica del CTV in una piastra di Petri. Gli embrioni recuperati si trovano nel mezzo lavato. Successivamente, lavare gli embrioni tre volte con il mezzo di manipolazione.Quindi incubare gli embrioni nel mezzo di manipolazione a 38,5 gradi Celsius in aria normale. Dopo 19-21 ore dall'inseminazione, selezionare gli embrioni utilizzando un microscopio stereoscopico.Raccogliere circa 30 embrioni in fase di pronucleo per ogni condizione di iniezione, prevedendo da 30 a 40 embrioni per femmina superovulata. In anticipo, ottenere set di ZFN per il gene di interesse da un produttore.Selezionare quelli con i punteggi migliori per ZFN. In questo esempio, il gene di interesse è A OC three. Per preparare l'mRNA di ZFN, trascrivere prima in vitro l'RNA messaggero di ZFN e poliadenilare i trascritti.Successivamente, purificare l'mRNA ottenuto e risospendere. Sospendere in RNA spree 0,1 xte E. Quindi misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro e preparare aliquote degli mRNA che codificano per le coppie ZFN a quattro-dieci nanogrammi per microlitro in provette da 10 microlitri per la conservazione. Iniziare riscaldando la fase di microiniezione a 38 gradi Celsius.Per preparare la piattaforma di microiniezione, rimuovere innanzitutto la camera per il mezzo da un'unità con pozzetto singolo, quindi aggiungere una goccia di cinque microlitri di mezzo di manipolazione sul vetrino e ricoprirla con olio minerale. Posizionare il vetrino preparato sul palchetto riscaldato del microscopio.Successivamente, fissare una pipetta di ritenzione con diametro di 120 micron a un micromanipolatore e posizionare la pipetta nella goccia di mezzo sulla piattaforma. Scongelare ora gli mRNA da iniettare ponendoli sul ghiaccio. Caricarli in una pipetta di iniezione, formata da un capillare di vetro borosilicato utilizzando un tiratore di micropipette.Accendere successivamente l'alimentazione dell'aria compressa collegata al microinjector. Poi, fissare la pipetta di iniezione al suo supporto e collegare quest'ultimo a un secondo micromanipolatore. Posizionare anche questa pipetta nella goccia di mezzo.Ora configurare il microinjector per un volume di iniezione compreso tra uno e cinque picolitri. Per aprire la punta della pipetta di iniezione, battere delicatamente contro la pipetta di ritenzione.Trasferire da 30 a 50 embrioni alla piattaforma di micro manipolazione utilizzando una pipetta di vetro. Quindi osservare a un ingrandimento di 100x.Utilizzare la pipetta di ritenzione per catturare un embrione. Allineare la pipetta di ritenzione e l'embrione con l'ago di iniezione ora a 400 x. Avanzare la pipetta di iniezione attraverso l'embrione.Attenzione a evitare il nucleo. Una volta perforata la membrana plasmatica, premere il pedale per iniettare l'mRNA; dopo l'iniezione, ritirare l'ago e rilasciare l'embrione. Ripetere il processo per tutti gli embrioni rimanenti.Dopo averli iniettati tutti, lavare gli embrioni tre volte nel mezzo di coltura per embrioni, per 30 secondi per ogni lavaggio. Successivamente, incubare gli embrioni a 38,5 gradi Celsius in atmosfera con 5% di anidride carbonica per uno o due ore prima di trasferirli nel ricevente sincronizzato.Coniglio femmina. Per coltivare gli embrioni fino allo stadio di blastocisti, l'incubatrice deve avere aria umidificata. Selezionare un coniglio femmina NZW di cinque-dodici mesi di età, in buona salute e dal peso di quattro-cinque chili.Preparare l'animale ricevente somministrando prima gonadotropina per via intramuscolare. Da 16 a 24 ore dopo l'iniezione ormonale, anestetizzare il coniglio con chetamina e/o isoflurano in forma vaporizzata. Quando il coniglio è completamente incosciente, non presenterà riflessi plantari.Quando si comprime la pianta del piede prima dell'intervento chirurgico, proteggere gli occhi con un unguento oftalmico e preparare l'addome. Durante l'intervento, registrare i parametri vitali del coniglio. Ogni 15 minuti, iniziare praticando un'incisione di circa 2,5 centimetri attraverso la cute e successivamente lungo lo strato muscolare.Esternare ogni ovaio insieme al corno uterino a esso collegato, tenendo un ovaio tra pollice e indice. Trasferire gli embrioni nell'ovidotto attraverso una pipetta sterile inserita con attenzione. Solitamente da 10 a 25 embrioni su ogni 30 embrioni iniettati sono vitali e possono tutti essere trasferiti a un unico ricevente.Completare l'intervento chirurgico chiudendo il tessuto muscolare con un punto riassorbibile rivestito. Suturare la cute con un punto sottocuticolare riassorbibile oppure con punti semplici interrotti non riassorbibili. Successivamente mantenere l'animale al caldo e monitorarlo fino al completo risveglio.Viene raggiunta la posizione supina. Inizialmente sono state progettate 16 coppie di ZFN. La sequenza di interruzione mirata del primo insieme si trova nell'esone due di un OC tre insiemi.Uno, due e tre sono stati selezionati e sottoposti al saggio reporter MEL nel lievito per determinare le attività delle ZFN. Il set uno ha ottenuto un punteggio ZFN del 224,2%, superiore a quelli dei set due e tre e molto più elevato rispetto alla soglia di selezione, pari al 50% del controllo positivo interno. Pertanto, il set uno è stato selezionato per gli esperimenti di validazione in vitro; l'mRNA del set uno è stato microiniettato in 35 embrioni di coniglio.Il tasso di BL del gruppo microiniettato è risultato inferiore rispetto a quelli non microiniettati, indicando una competenza di sviluppo leggermente compromessa. 18 embrioni del gruppo microiniettato hanno raggiunto lo stadio di BL al quinto giorno, dei quali 16 sono stati sottoposti a sequenziamento. La frequenza di quattro mutazioni nel sito bersaglio è risultata molto più elevata rispetto alla soglia di selezione, dimostrando che la coppia di ZFN impostata era efficace su un totale di 145 embrioni.Coniglietti microiniettati con mRNA di ZFN del set uno sono stati trasferiti a sette conigli riceventi pseudo gravidi. Embryoni appena lavati, privi di microiniezione con ZFN, sono stati trasferiti ai riceventi come gruppo di controllo dopo 30 giorni di gestazione. Sono nati 21 coniglietti nel gruppo microiniettato.Il sequenziamento mediante PCR ha identificato cinque clonaggi positivi. Le indel nel sito bersaglio includevano due inserzioni e tre delezioni. L'analisi bioinformatica è stata utilizzata per identificare potenziali siti fuori bersaglio dei ZFN con sette o meno disallineamenti rispetto alla sequenza di riferimento; è stato identificato un solo sito potenzialmente fuori bersaglio, e la PCR non ha rilevato eventi in questo sito in nessuno degli animali fondatori.Guardi questo video. Dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre conigli knock-out mediante microiniezione nucleare di dita di zinco.Dopo aver acquisito padronanza nella raccolta degli embrioni, la microiniezione e il trasferimento possono essere eseguiti in quattro ore se effettuati correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il materiale da iniettare è RNA, il quale richiede particolare attenzione. Dopo questa procedura, verrà effettuato il fenotipaggio per comprendere le regole biologiche dei geni bersaglio.

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Qui, descriviamo una semplice tecnica destinata alla generazione efficiente di topi geneticamente modificati chiamata CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Questo metodo fornisce reagenti di editing mediante elettroporazione negli embrioni con un'efficienza vicina al 100%. Questo protocollo è efficace per mutazioni puntiformi, piccole inserzioni genomiche e delezioni in embrioni di mammifero.

Editing efficiente del genoma dei topi mediante elettroporazione CRISPR degli zigoti

In questo protocollo, descriviamo le procedure tecniche per generare topi knockout specifici per il tessuto adiposo bruno (BAT) sfruttando un sistema combinato di Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e RNA a guida singola (sgRNA) del virus adeno-associato (AAV). I passaggi descritti includono la progettazione degli sgRNA, la preparazione delle particelle AAV-sgRNA e la microiniezione di AAV nei lobi BAT.

Generazione di topi knockout specifici per il grasso bruno utilizzando un sistema combinato di RNA a guida singola Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e virus adeno-associato

Qui, descriviamo un protocollo per la generazione di mutanti materni che accoppia una linea di knock-in stabile zpc:cas9 con la consegna mediata da Tol2 di cassette di espressione di sgRNA.

Generazione di mutanti materni utilizzando zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

L'efficienza del metodo I-GONAD (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) è paragonabile alla microiniezione tradizionale, che richiede la raccolta di zigoti da femmine donatrici e il trasferimento a femmine pseudo-gravide. Questo protocollo dimostra la sua efficacia introducendo mutazioni indotte da CRISPR/Cas9 nel locus ROSA26 sul cromosoma 6.

Miglioramento dell'editing del genoma tramite la somministrazione di acidi nucleici oviduttali Tecnica di elettroporazione in vivo basata sulla somministrazione per la generazione di topi knockout

Scopri come generare conigli knockout per l'apolipoproteina C-III utilizzando nucleasi a dito di zinco. Questo metodo avanzato consente di creare modelli animali per lo studio delle malattie cardiovascolari umane.

La produzione di apolipoproteina C-III Conigli Knockout utilizzando zinco nucleasi dito

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