La produzione di apolipoproteina C-III Conigli Knockout utilizzando zinco nucleasi dito

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare nuovi modelli di coniglio per lo studio delle malattie cardiovascolari umane. Questo risultato viene ottenuto innanzitutto progettando e sintetizzando nucleasi a dita di zinco che bersagliano il gene di interesse. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'iniettare microscopica­mente gli RNA delle ZFN nel citoplasma di embrioni allo stadio pronucleare.

Il terzo passaggio consiste nel trasferire chirurgicamente gli embrioni in una coniglia ricevente. L'ultimo passaggio prevede il genotipaggio dei nuovi nati per identificare gli animali transgenici. Nel complesso, il targeting genico mediante ZFN è altamente efficace e viene qui dimostrato attraverso la creazione di un coniglio knock-out per A OC tre.

Questa tecnica rappresenta un punto di riferimento nell'ingegneria genetica poiché è la prima ad aver reso possibile la produzione di conigli privi di codice. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di numerose malattie umane, come le malattie cardiovascolari. È sempre più evidente come siano necessari modelli animali di grandi dimensioni per riprodurre in modo più accurato la fisiologia e la patologia umana.

L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo letto l'articolo che riportava un efficace targeting genico mediante l'uso di nucleasi significative nel 2009. In generale, le persone a conoscenza di questo metodo potrebbero incontrare difficoltà, poiché richiede l'iniezione microscopica nel citoplasma di un costrutto. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni preziose sul targeting genico nei conigli, potrebbe essere applicato anche ad altri sistemi, come ad esempio i suini.

Iniziare con la superovulazione di conigli albini di Nuova Zelanda sessualmente maturi, utilizzando un'iniezione sottocutanea di FSH due volte al giorno per un periodo di tre giorni, aumentando la dose quotidianamente. 72 ore dopo l'ultima iniezione di FSH, iniettare 200 UI di HCG per via endovenosa per indurre l'ovulazione nei soggetti femminili superovulati immediatamente dopo. In questo momento, è necessario preparare anche un animale ricevente.

16-18 ore dopo l'inseminazione, eutanasia i conigli donatori superovulati con pentobarbital sodico. Recupera il tubo uterino (UCT) raccogliendo con attenzione l'intero utero. Lavare le strutture delle ovaie e dei tubi uterini (UCS) e dei tubi uterini (UCT) con 10 millilitri di mezzo di manipolazione, iniettando il mezzo dall'estremità uterina dell'UCT.

Raccogliere il mezzo lavato all'estremità ovarica del CTV in una piastra di Petri. Gli embrioni recuperati si trovano nel mezzo lavato. Successivamente, lavare gli embrioni tre volte con il mezzo di manipolazione.

Quindi incubare gli embrioni nel mezzo di manipolazione a 38,5 gradi Celsius in aria normale. Dopo 19-21 ore dall'inseminazione, selezionare gli embrioni utilizzando un microscopio stereoscopico.

Raccogliere circa 30 embrioni in fase di pronucleo per ogni condizione di iniezione, prevedendo da 30 a 40 embrioni per femmina superovulata. In anticipo, ottenere set di ZFN per il gene di interesse da un produttore.

Selezionare quelli con i punteggi migliori per ZFN. In questo esempio, il gene di interesse è A OC three. Per preparare l'mRNA di ZFN, trascrivere prima in vitro l'RNA messaggero di ZFN e poliadenilare i trascritti.

Successivamente, purificare l'mRNA ottenuto e risospendere. Sospendere in RNA spree 0,1 xte E. Quindi misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro e preparare aliquote degli mRNA che codificano per le coppie ZFN a quattro-dieci nanogrammi per microlitro in provette da 10 microlitri per la conservazione. Iniziare riscaldando la fase di microiniezione a 38 gradi Celsius.

Per preparare la piattaforma di microiniezione, rimuovere innanzitutto la camera per il mezzo da un'unità con pozzetto singolo, quindi aggiungere una goccia di cinque microlitri di mezzo di manipolazione sul vetrino e ricoprirla con olio minerale. Posizionare il vetrino preparato sul palchetto riscaldato del microscopio.

Successivamente, fissare una pipetta di ritenzione con diametro di 120 micron a un micromanipolatore e posizionare la pipetta nella goccia di mezzo sulla piattaforma. Scongelare ora gli mRNA da iniettare ponendoli sul ghiaccio. Caricarli in una pipetta di iniezione, formata da un capillare di vetro borosilicato utilizzando un tiratore di micropipette.

Accendere successivamente l'alimentazione dell'aria compressa collegata al microinjector. Poi, fissare la pipetta di iniezione al suo supporto e collegare quest'ultimo a un secondo micromanipolatore. Posizionare anche questa pipetta nella goccia di mezzo.

Ora configurare il microinjector per un volume di iniezione compreso tra uno e cinque picolitri. Per aprire la punta della pipetta di iniezione, battere delicatamente contro la pipetta di ritenzione.

Trasferire da 30 a 50 embrioni alla piattaforma di micro manipolazione utilizzando una pipetta di vetro. Quindi osservare a un ingrandimento di 100x.

Utilizzare la pipetta di ritenzione per catturare un embrione. Allineare la pipetta di ritenzione e l'embrione con l'ago di iniezione ora a 400 x. Avanzare la pipetta di iniezione attraverso l'embrione.

Attenzione a evitare il nucleo. Una volta perforata la membrana plasmatica, premere il pedale per iniettare l'mRNA; dopo l'iniezione, ritirare l'ago e rilasciare l'embrione. Ripetere il processo per tutti gli embrioni rimanenti.

Dopo averli iniettati tutti, lavare gli embrioni tre volte nel mezzo di coltura per embrioni, per 30 secondi per ogni lavaggio. Successivamente, incubare gli embrioni a 38,5 gradi Celsius in atmosfera con 5% di anidride carbonica per uno o due ore prima di trasferirli nel ricevente sincronizzato.

Coniglio femmina. Per coltivare gli embrioni fino allo stadio di blastocisti, l'incubatrice deve avere aria umidificata. Selezionare un coniglio femmina NZW di cinque-dodici mesi di età, in buona salute e dal peso di quattro-cinque chili.

Preparare l'animale ricevente somministrando prima gonadotropina per via intramuscolare. Da 16 a 24 ore dopo l'iniezione ormonale, anestetizzare il coniglio con chetamina e/o isoflurano in forma vaporizzata. Quando il coniglio è completamente incosciente, non presenterà riflessi plantari.

Quando si comprime la pianta del piede prima dell'intervento chirurgico, proteggere gli occhi con un unguento oftalmico e preparare l'addome. Durante l'intervento, registrare i parametri vitali del coniglio. Ogni 15 minuti, iniziare praticando un'incisione di circa 2,5 centimetri attraverso la cute e successivamente lungo lo strato muscolare.

Esternare ogni ovaio insieme al corno uterino a esso collegato, tenendo un ovaio tra pollice e indice. Trasferire gli embrioni nell'ovidotto attraverso una pipetta sterile inserita con attenzione. Solitamente da 10 a 25 embrioni su ogni 30 embrioni iniettati sono vitali e possono tutti essere trasferiti a un unico ricevente.

Completare l'intervento chirurgico chiudendo il tessuto muscolare con un punto riassorbibile rivestito. Suturare la cute con un punto sottocuticolare riassorbibile oppure con punti semplici interrotti non riassorbibili. Successivamente mantenere l'animale al caldo e monitorarlo fino al completo risveglio.

Viene raggiunta la posizione supina. Inizialmente sono state progettate 16 coppie di ZFN. La sequenza di interruzione mirata del primo insieme si trova nell'esone due di un OC tre insiemi.

Uno, due e tre sono stati selezionati e sottoposti al saggio reporter MEL nel lievito per determinare le attività delle ZFN. Il set uno ha ottenuto un punteggio ZFN del 224,2%, superiore a quelli dei set due e tre e molto più elevato rispetto alla soglia di selezione, pari al 50% del controllo positivo interno. Pertanto, il set uno è stato selezionato per gli esperimenti di validazione in vitro; l'mRNA del set uno è stato microiniettato in 35 embrioni di coniglio.

Il tasso di BL del gruppo microiniettato è risultato inferiore rispetto a quelli non microiniettati, indicando una competenza di sviluppo leggermente compromessa. 18 embrioni del gruppo microiniettato hanno raggiunto lo stadio di BL al quinto giorno, dei quali 16 sono stati sottoposti a sequenziamento. La frequenza di quattro mutazioni nel sito bersaglio è risultata molto più elevata rispetto alla soglia di selezione, dimostrando che la coppia di ZFN impostata era efficace su un totale di 145 embrioni.

Coniglietti microiniettati con mRNA di ZFN del set uno sono stati trasferiti a sette conigli riceventi pseudo gravidi. Embryoni appena lavati, privi di microiniezione con ZFN, sono stati trasferiti ai riceventi come gruppo di controllo dopo 30 giorni di gestazione. Sono nati 21 coniglietti nel gruppo microiniettato.

Il sequenziamento mediante PCR ha identificato cinque clonaggi positivi. Le indel nel sito bersaglio includevano due inserzioni e tre delezioni. L'analisi bioinformatica è stata utilizzata per identificare potenziali siti fuori bersaglio dei ZFN con sette o meno disallineamenti rispetto alla sequenza di riferimento; è stato identificato un solo sito potenzialmente fuori bersaglio, e la PCR non ha rilevato eventi in questo sito in nessuno degli animali fondatori.

Guardi questo video. Dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre conigli knock-out mediante microiniezione nucleare di dita di zinco.

Dopo aver acquisito padronanza nella raccolta degli embrioni, la microiniezione e il trasferimento possono essere eseguiti in quattro ore se effettuati correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il materiale da iniettare è RNA, il quale richiede particolare attenzione. Dopo questa procedura, verrà effettuato il fenotipaggio per comprendere le regole biologiche dei geni bersaglio.