La produzione di apolipoproteina C-III Conigli Knockout utilizzando zinco nucleasi dito

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sviluppare nuovi modelli di coniglio per lo studio delle malattie cardiovascolari umane. Ciò si ottiene progettando e sintetizzando prima nucleasi a dita di zinco che hanno come bersaglio il gene di interesse. La seconda fase della procedura consiste nel microiniettare gli RNA ZFN nel citoplasma degli embrioni in stadio pronucleare.

Il terzo passo consiste nel trasferire chirurgicamente gli embrioni a un coniglio ricevente. Il passo finale è quello di genotipizzare i neonati per identificare gli animali transgenici. Nel complesso, il targeting genico attraverso ZFN è altamente efficace ed è dimostrato qui creando un coniglio knockout A OC three.

Questa tecnica, è il punto di riferimento dell'ingegneria genetica in quanto è la prima a consentire la produzione di coniglio senza codice. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di molte malattie umane come le malattie cardiovascolari. Ci si rende sempre più conto che sono necessari modelli animali di grandi dimensioni per imitare meglio la fisiologia e la patologia dell'uomo.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo letto l'articolo che riportava il successo del targeting genico utilizzando una nucleasi significativa in rosso nel 2009. In generale, le persone che conoscono questo metodo avranno difficoltà perché comporta la microiniezione di plasma cito di costrutto. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui conigli che hanno come bersaglio genetico, potrebbe essere applicato anche ad altri sistemi come i maiali.

Inizia con conigli bianchi neozelandesi super ovulanti e sessualmente maturi utilizzando un'iniezione sottocutanea di FSH due volte al giorno per un periodo di tre giorni, aumenta il dosaggio ogni giorno. 72 ore dopo l'ultima iniezione di FSH, iniettare 200 UI di HCG per via endovenosa per indurre l'ovulazione fatte individualmente le femmine super ovulate subito dopo. In questo momento, deve essere preparato anche un animale ricevente.

Da 16 a 18 ore dopo l'inseminazione, sopprimere i conigli donatori super ovulati con pentobarbital di sodio. Recuperare la pula UCT raccogliendo con cura l'intero utero. Le UCS e la struttura delle ovaie risciacquano ogni UCT con 10 millilitri di terreno di manipolazione iniettando il terreno dall'estremità uterina dell'UCT.

Raccogliere il terreno lavato all'estremità ovarica dell'UCT in una capsula di Petri. Gli embrioni recuperati si trovano nel mezzo di lavaggio. Quindi, lavare gli embrioni tre volte con un mezzo di manipolazione.

Quindi incubare gli embrioni nel mezzo di manipolazione a 38,5 gradi Celsius in aria normale. Dalle 19 alle 21 ore. Dopo l'inseminazione, selezionare gli embrioni utilizzando uno stereomicroscopio.

Raccogli circa 30 embrioni che sono allo stadio pronucleare per ogni condizione di iniezione, aspettati da 30 a 40 di tali embrioni per femmina super ovulata. In anticipo. Ottenere set ZFN per il gene di interesse da un produttore.

Selezionando quelli con i migliori punteggi ZFN. In questo esempio, il gene di interesse è A OC tre. Per preparare l'mRNA ZFN, trascrivere prima il messaggero ZFN, l'RNA in vitro e poliadenilare i trascritti.

Successivamente, purificare l'mRNA risultante e resus. Sospendere in RNA spree 0.1 xte E.Quindi misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro e preparare aliquote degli mRNA che codificano coppie ZFN da quattro a 10 nanogrammi per microlitro in fiale da 10 microlitri per la conservazione. Iniziare con il riscaldamento della fase di microiniezione a 38 gradi Celsius.

Per preparare la piattaforma di microiniezione, rimuovere prima la camera del terreno da un vetrino della camera a un pozzetto, quindi a una goccia di cinque microlitri di manipolazione. Medie al vetrino e coprirlo con olio minerale. Posizionare il vetrino preparato sul tavolino riscaldato del microscopio.

Quindi, fissare una pipetta di tenuta di 120 micron di diametro a un manipolatore microm e posizionare la pipetta nella goccia di terreno sulla piattaforma. Ora scongelare gli mRNA da iniettare sul ghiaccio. Caricarli in una pipetta per iniezione, forgiata da un tubo capillare in vetro silicato bo utilizzando un micro estrattore per pipette.

Successivamente attivare l'alimentazione dell'aria compressa collegata al micro iniettore. Quindi, fissare la pipetta per iniezione al suo supporto e collegarla a un secondo manipolatore microm. Posizionare anche questa pipetta nella goccia di terreno.

Ora configura il micro iniettore per un volume di iniezione da uno a cinque picolitri. Per aprire la punta della pipetta per iniezione. Picchiettarlo delicatamente contro la pipetta di contenimento.

Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire da 30 a 50 embrioni alla micro manipolazione. Scendi sulla piattaforma. Quindi con ingrandimento 100x.

Utilizzare la pipetta di tenuta per catturare un embrione. Allineare la pipetta di supporto e l'embrione all'ago per iniezione ora a meno di 400 x. Far avanzare la pipetta per iniezione attraverso l'embrione.

Fai attenzione a evitare il nucleo. Una volta perforata la membrana plasmatica, premere il pedale per iniettare l'mRNA dopo l'iniezione, ritirare l'ago e rilasciare l'embrione. Ripeti il processo per tutti gli embrioni rimanenti.

Una volta iniettati tutti, lavare gli embrioni tre volte in coltura embrionale. Medio per 30 secondi per lavaggio. Quindi incubare gli embrioni a 38,5 gradi Celsius con aria al 5% di anidride carbonica per una o due ore prima di trasferire gli embrioni al ricevente sincronizzato.

Coniglio femmina. Per coltivare gli embrioni fino alla fase di blast assist, l'incubatrice deve disporre di aria umidificata. Seleziona una femmina di coniglio NZW di età compresa tra cinque e 12 mesi che sia in buona salute e che pesi da quattro a cinque chili.

Prepararla come animale ricevente somministrandole prima gonadotropina, rilasciando l'ormone per via intramuscolare. Da 16 a 24 ore dopo l'iniezione di ormone, anestetizzare il coniglio con ketamina e/o fluoro vaporizzato. Quando il coniglio è completamente incosciente, non produrrà riflessi a pedale.

Quando il cuscinetto viene schiacciato prima dell'intervento, proteggere gli occhi con un unguento oftalmico e preparare l'addome. Durante l'intervento, registrare i segni vitali del coniglio. Ogni 15 minuti inizia praticando un'incisione di circa 2,5 centimetri attraverso la pelle e poi lungo lo strato muscolare.

Esteriorizzare ogni ovaia insieme al corno uterino attaccato, tenendo un'ovaia tra il pollice e l'indice. Trasferire gli embrioni nell'ovidotto attraverso una pipetta sterile accuratamente inserita. Di solito sono vitali da 10 a 25 embrioni ogni 30 embrioni iniettati e possono essere trasferiti a un ricevente.

Completare l'intervento chiudendo lo strato muscolare con una sutura riassorbibile rivestita. Sutura la pelle con una sutura sottocuticolare riassorbibile o con semplici suture cutanee interrotte non assorbibili. Quindi tieni l'animale al caldo e monitoralo fino alla poppa.

Inizialmente sono state progettate 16 coppie ZFN. La sequenza di interruzione mirata del primo set si trova nell'esone due di un OC tre set.

Uno, due e tre sono stati selezionati e sottoposti al lievito. MEL un test reporter per determinare il set di attività ZFN, uno aveva un punteggio ZFN del 224,2% superiore a quelli dei set due e tre e molto più alto della soglia di selezione, che è il 50% del controllo positivo interno. Pertanto, il primo set è stato selezionato per esperimenti di validazione in vitro, il set uno è stato microiniettato in 35 embrioni di coniglio.

Il tasso di BL del gruppo microiniettato è apparso più basso rispetto a quelli che non sono stati microiniettati, indicando una competenza evolutiva leggermente compromessa. 18 embrioni del gruppo microiniettato si sono sviluppati allo stadio BL il quinto giorno, di cui 16 sono stati sequenziati. La frequenza di quattro mutazioni nel sito bersaglio era molto più alta della soglia di selezione, rivelando che la coppia ZFN impostata uno era efficace in totale 145 embrioni.

I micro iniettati con l'mRNA ZFN del set uno sono stati trasferiti a sette conigli riceventi pseudo gravidi. Gli embrioni appena lavati senza microiniezione di ZFN sono stati trasferiti ai riceventi come gruppo di controllo dopo 30 giorni di gestazione. Nel gruppo dei micro iniettati sono nati 21 kit.

Il sequenziamento PCR ha identificato cinque come knockout positivi. Gli indel nel sito di targeting includevano due inserzioni e tre delezioni. L'analisi bioinformatica è stata utilizzata per identificare potenziali ZFN fuori bersaglio con sette o meno discrepanze con la sequenza impostata uno, è stato identificato un solo possibile sito fuori bersaglio e la PCR non ha rilevato eventi in quel sito in nessuno degli animali fondatori.

A guarda questo video. Dovresti avere una buona comprensione di come produrre conigli knockout attraverso lo zinco. Microiniezione del nucleo del dito.

Una volta padroneggiata la raccolta degli embrioni, la microiniezione e il trasferimento possono essere eseguiti in quattro ore se eseguiti correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il materiale di iniezione è l'RNA, il che richiede particolare cautela. Seguendo questa procedura, verrà eseguita la fenotipizzazione per comprendere le regole biologiche dei geni bersaglio.