Name: A Novel Luce Danni Paradigma per luso in retina Rigenerazione Studi in Zebrafish adulti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-24T15:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Scopri un nuovo protocollo per indurre degenerazione retinica in zebrafish adulti danneggiando fotorecettori a bastoncello e cono. Questo metodo combina esposizione UV e luce continua per studiare rigenerazione retinica.

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Gli autori desiderano ringraziare Xixia Luo per un&#39;eccellente allevamento di pesci e di supporto tecnico. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health sovvenzioni R21EY019401 (RT) e P30EY04068 (RT), e fondi di start-up a RT, tra cui una sovvenzione illimitata di ricerca per prevenire la cecità alla Wayne State University, Dipartimento di Oftalmologia. JT è stato sostenuto da un Thomas C. Rumble Fellowship fornito dalla Wayne State University Graduate School.

Tutte le procedure descritte in questo protocollo è stato approvato dal comitato di utilizzo degli animali presso la Wayne State University School of Medicine. 1. Adattamento al buio <ol><li> Trasferimento ~ 10 pesci adulti albino o pigmentato dal sistema abitativo normale in un involucro scuro. Se disponibile, utilizzare un involucro scuro che è incorporata nel modulo alloggiamento zebrafish, che consente il flusso dell&#39;acqua normale attraverso il serbatoio. (Se un tale sistema non sia disponibile, posizionare il serbatoio di pesce in un involucro completamente buio, avendo cura di aerare il pesce con l&#39;ossigeno). </li><li> Conservare il pesce al buio per 10 giorni. Quando l&#39;alimentazione degli animali o l&#39;aggiunta di nuovi pesci alla casella buio, assicurarsi di muoversi il più rapidamente possibile per evitare di esporre il pesce ad un lungo periodo di luce. </li></ol> 2. L&#39;esposizione ai raggi UV della luce <ol><li> Assicurarsi che l&#39;alimentazione alla sorgente di raggi UV è OFF. Rimuovere il filamento della luce UV da stereomicroscopio a fluorescenza. <ol><li> Utilizzare un inverted15 cm di diametro in vetro Petri (o qualcosa di simile due centimetri altezza) come supporto per il filamento UV. Tape la capsula di Petri di banco di laboratorio. </li><li> Nastro il filamento luce UV alla parte superiore del piatto rovesciato Petri. Disporre modo che ~ 2 mm fine degli aggetti filamento capsula di Petri. </li></ol></li><li> Ottenere un bicchiere di vetro da 250 ml. Coprire ½ del fondo, laterale e posteriore del becher con foglio di alluminio, assicurandosi che il lato &quot;splendente&quot; della lamina affronta l&#39;interno del bicchiere. Se il bicchiere è graduato, coprire la metà formulazione del bicchiere con un foglio, lasciando la chiara metà del bicchiere esposto. </li><li> Riempire il becher da 250 ml con 100 ml di acqua dal sistema di impianto pesce. </li><li> Porre il bicchiere da 250 ml in un bicchiere 4 L. Riempire il bicchiere 4 L con acqua finché il livello dell&#39;acqua è anche con la linea 100 ml di acqua nel becher da 250 ml. </li><li> Aggiungere un massimo di 10 animali scuro trattati al bicchiere da 250 ml. Coprire il bicchiere da 250 ml, con un piccolo pezzo di alluminiosventare. </li><li> Posizionare l&#39;intero apparato becher immediatamente adiacente al filamento UV. Il filamento deve toccare la parte esterna del bicchiere 4 L e rivolta verso la porzione esposta del becher da 250 ml. Assicurarsi che il bicchiere da 250 ml è centrata nel fondo del becher 4 L. </li><li> Posizionare un grande schermo opaco dietro il becher 4L, consentendo gli animali siano esposti, ma impedendo qualsiasi personale di laboratorio di vedere la punta del filamento UV. ATTENZIONE: assicurarsi che questa barriera è a posto prima di accendere l&#39;alimentazione alla sorgente di raggi UV. </li><li> Accendere la fonte di energia UV. Imposta il timer per 30 min. Luogo con qualsiasi etichette di avvertimento necessarie per garantire che il personale di laboratorio ignari non si espongono accidentalmente a radiazioni UV. </li><li> Dopo 30 minuti, spegnere la fonte di energia UV. Rimuovere il becher da 250 ml con il pesce. NOTA: se sono necessari più cicli di esposizione ai raggi UV, lasciare che la fonte di alimentazione raffreddare (~ 20 min) prima di ripetere il protocollo di esposizione. Assicurarsi di sostituire tha 100 ml di acqua con acqua fresca sistema per ogni esposizione. L&#39;acqua nel becher 4 L non necessita di essere sostituito. </li></ol> 3. Lampada alogena Luce Esposizione <ol><li> Trasferire il pesce da 250 ml in un bicchiere L acrilico serbatoio di pesci 1.8. Riempire il serbatoio fino al segno di overflow. </li><li> Posizionare la lampada zona da trattare luce alogena. Ottenere quattro 250 W Lampade alogene utilità da un negozio di ferramenta locale. Di fronte a due lampade nella stessa direzione, organizzare 29 centimetri a parte sul centro. Disporre le altre due lampade in modo simile. <ol><li> Posizionare la seconda serie di lampade in modo che essi sono di fronte alla prima serie di lampade, lasciando ~ 73 cm tra gli insiemi di due lampade. Questo crea una zona di trattamento luce a forma di rettangolo di 29 x 73 cm. </li></ol></li><li> Ottenere un piccolo ventilatore da un negozio di ferramenta locale. Posizionare la ventola equidistante tra le due serie di lampade, appena al di fuori della zona di trattamento luce. </li><li> Posizionare due 1.8 L serbatoi pieni di acqua nel centro delzona di trattamento luce, equidistante tra le due serie di lampade. La distanza tra le lampade e la parete esterna del serbatoio dovrebbe essere ~ 29 cm. Nota: anche se solo trattamento 10 pesci in un serbatoio di 1,8 L, utilizzare questo accordo. Sono necessari entrambi i serbatoi per mantenere la temperatura dell&#39;acqua di ciascun serbatoio all&#39;interno della gamma appropriata. </li><li> Inserire un aeratore ossigeno in ogni serbatoio. </li><li> Coprire ogni serbatoio con chiare coperchi acrilici, lasciando un ~ 2 centimetri vuoto a fine vicina alla ventola. Disporre la ventola in modo che possa soffiare aria in questa lacuna. Posizionare un termometro in uno o entrambi i serbatoi. </li><li> Attivare l&#39;alimentazione per le luci, ventole e aeratori. Mantenere il trattamento della luce per un massimo di 4 giorni. Il pesce non deve essere alimentato durante il trattamento con la luce, per non compromettere la qualità dell&#39;acqua e provocare più stress agli animali. </li><li> Monitorare il livello di temperatura e di acqua su una base quotidiana. Mantenere la temperatura a 30-33 ° C. Se necessario, regolare la velocità della ventola e / o la distanza tra i serbatoi e il lights. <ol><li> Top fuori ogni serbatoio con acqua sistema, se necessario, di solito tutti i giorni. </li><li> Usare sempre sano zebrafish adulto (tipicamente 6-9 mesi di età) a mantenere un tasso di sopravvivenza di quasi il 100%. Tuttavia, se un pesce viene trovato morto nel serbatoio, rimuoverla immediatamente e sostituire l&#39;acqua nel serbatoio intero. </li></ol></li></ol> 4. Collezione tessuti <ol><li> 48 ore dopo l&#39;inizio del trattamento con luce alogena togliere il pesce dalla zona da trattare. <ol><li> Preparare fresco fissativo formaldeide etanolica (1 parte di formaldeide al 37%, 9 parti di 100% di etanolo). </li><li> Euthanize zebrafish con una dose eccessiva di anestetico 2-fenossietanolo (0,4 mg / L). </li><li> Trasferire il pesce zebra eutanasia di un tovagliolo di carta. Enucleare l&#39;occhio usando pinze curve. </li><li> Mettere gli occhi enucleati in fissativo e negozio O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Cryoprotect gli occhi. <ol><li> Lavare gli occhi in 5% di saccarosio 1x PBS per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi sostituire confresco 5% di saccarosio 1x PBS per 2 h. Successivamente, lavare gli occhi nel 30% saccarosio PBS 1x O / N a 4 ° C. Lavare gli occhi in un 01:01 (parti uguali) del tessuto congelamento medie e il 30% di saccarosio 1x PBS O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Incorpora gli occhi in 100% tessuto congelamento medio e conservare a -80 ° C. Orientare gli occhi in modo che criosezionamento del tessuto viene eseguita sul asse dorsale / ventrale. </li><li> Cryosection il tessuto e posto su vetrini. Diapositive caldi per 2 ore a 55 ° C. Conservare i vetrini a -80 ° C o eseguire immediatamente immunoistochimica standard. </li><li> Eseguire immunoistochimica standard su tessuto sezionato e immagine con la microscopia a fluorescenza 40,51. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui mostriamo che la combinazione di una breve esposizione ai raggi UV, con un continuo brillante luce i risultati di esposizione nella perdita dei fotorecettori capillare e una risposta rigenerazione robusto. Rispetto ai singoli metodi LIRD, questo metodo combinato è anche il protocollo più efficace per danneggiare entrambe le aste e coni in entrambe le metà della retina. È importante sottolineare che questo trattamento è efficace in animali pigmentati così come gli animali albini. ...

Indotto dalla luce degenerazione retinica (LIRD) è comunemente usato in entrambi i roditori e zebrafish per asta danni e fotorecettori cono. In zebrafish adulto, la degenerazione dei fotorecettori innesca Müller cellule gliali di rientrare nel ciclo cellulare e produrre progenitori transitoria-amplificazione. Questi progenitori continuano a proliferare quando migrano alla zona danneggiata, dove in ultima analisi, danno luogo a nuovi fotorecettori. Attualmente esistono due paradigmi LIRD ampiamente usate, ognuna delle quali provoca vari gradi di perdita dei fotorecettori e corrispondenti differenze nella risposta rigenerazione. Come strumenti più genetici e farmacologici sono disponibili per testare il ruolo dei singoli geni di interesse durante la rigenerazione, vi è la necessità di sviluppare un paradigma LIRD robusto. Qui si descrive un protocollo LIRD che si traduce in perdita diffusa e costante di entrambe bastoncelli e coni in cui abbiamo combinato l&#39;uso di due tecniche LIRD stabiliti in precedenza. Inoltre, Questo protocollo può essere esteso ad animali pigmentati, che elimina la necessità di mantenere le linee transgeniche di interesse sullo sfondo albino per gli studi LIRD.

<table><tbody><tr><td>Sorgente di luce UV</td><td>Leica</td><td>EL600</td><td></td></tr><tr><td>Piastra Petri in vetro (150 x 20 mm)</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS3160152BO</td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere in vetro da 250 ml</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS1000250</td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere in vetro da 4 L</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS10004L</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Fisher</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>250 W alogeno lampade</td><td>Workforce</td><td>265-669</td><td></td></tr><tr><td>1,8 L serbatoi in acrilico trasparente</td><td>Aquaneering</td><td>ZT180T</td><td></td></tr><tr><td>1,8 L coperchi per serbatoi in acrilico trasparente</td><td>Aquaneering</td><td>ZT180LCL</td><td></td></tr><tr><td>Fan</td><td>Honeywell</td><td>HT-900</td><td></td></tr><tr><td>Aeratore</td><td>Tetra</td><td>77853-900</td><td></td></tr><tr><td>Termometro</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-08008-58</td><td></td></tr><tr><td>Piegato pinze (5/45)</td><td>World Precision Instruments</td><td>504155</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel luce danni paradigma per l&#39;uso in retina rigenerazione studi in zebrafish adulti

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Indotto dalla luce degenerazione retinica (LIRD) è comunemente usato in entrambi i roditori e zebrafish per asta danni e fotorecettori cono. In zebrafish adulto, la degenerazione dei fotorecettori innesca Müller cellule gliali di rientrare nel ciclo cellulare e produrre progenitori transitoria-amplificazione. Questi progenitori continuano a proliferare quando migrano alla zona danneggiata, dove in ultima analisi, danno luogo a nuovi fotorecettori. Attualmente esistono due paradigmi LIRD ampiamente usate, ognuna delle quali provoca vari gradi di perdita dei fotorecettori e corrispondenti differenze nella risposta rigenerazione. Come strumenti più genetici e farmacologici sono disponibili per testare il ruolo dei singoli geni di interesse durante la rigenerazione, vi è la necessità di sviluppare un paradigma LIRD robusto. Qui si descrive un protocollo LIRD che si traduce in perdita diffusa e costante di entrambe bastoncelli e coni in cui abbiamo combinato l&#39;uso di due tecniche LIRD stabiliti in precedenza. Inoltre, Questo protocollo può essere esteso ad animali pigmentati, che elimina la necessità di mantenere le linee transgeniche di interesse sullo sfondo albino per gli studi LIRD.

Il protocollo di trattamento finora descritto luce è stata confrontata con ogni singolo metodo di LIRD. Nel buio trattati con animali adulti albini (Figure 3-5), i singoli trattamenti di luce determinato una notevole perdita di canna (figura 3) e il cono (Figura 4) fotorecettori. Tuttavia, entrambi i trattamenti individuali principalmente danneggiati fotorecettori nella metà dorsale della retina, lasciando la retina ventrale relativamente protetto dai trattamen...

Protocolli multipli danni leggeri sono stati descritti da fotorecettori danni e di conseguenza indurre una risposta rigenerazione della retina in zebrafish adulto. Questo protocollo descrive un metodo migliorato che può essere utilizzato in animali pigmentate e che danneggia la stragrande maggioranza di canna e cono fotorecettori attraverso l&#39;intera retina.

A Novel Luce Danni Paradigma per l&#39;uso in retina Rigenerazione Studi in Zebrafish adulti

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è combinare due protocolli precedentemente descritti di degenerazione retinica indotta dalla luce, al fine di danneggiare sia i fotorecettori a bastoncello che quelli a cono in tutta la retina. Questo risultato si ottiene esponendo prima dei pesci zebra adulti adattati al buio alla luce UV per 30 minuti. Il secondo passaggio consiste nel trasferire immediatamente i pesci trattati con UV in vasche circondate da quattro lampade alogene da 250 watt ed esporre i pesci a luce continua per un periodo fino a quattro giorni.L'ultimo passaggio consiste nell'eutanasia del pesce e nella nucleazione degli occhi per ulteriori analisi. Infine, la microscopia a immunofluorescenza viene utilizzata per mostrare una perdita costante sia dei fotorecettori a bastoncello che a cono in tutta la retina. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il trattamento con luce UV o il trattamento simile a una lampada alogena, è che la combinazione di questi due metodi determina l'ablazione sia dei fotorecettori a bastoncello che a cono in tutta la retina.Il danno ai fotorecettori induce una risposta proliferativa diffusa che alla fine por

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Neuroscienze

Un metodo per atterramento in modo condizionale espressione di una proteina bersaglio nella retina zebrafish adulto è descritto, che prevede l'iniezione di intravitreally Morpholinos antisenso e electroporating loro nella retina. La proteina risultante è abbattuto per diversi giorni, che consente di testare il ruolo della proteina nella rigenerante o retina intatta.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Questo video mostra una procedura per indurre la degenerazione retinica in zebrafish adulti utilizzando lesioni laser. Il laser prende di mira le cellule fotorecettrici della retina, innescando la morte cellulare e un processo degenerativo. Questo danno attiva le cellule della glia di Müller (MG), portando alla loro dedifferenziazione in progenitori di cellule staminali che aiutano nella rigenerazione retinica.

Modellazione della degenerazione e della rigenerazione retinica nel pesce zebra utilizzando una lesione laser focale

Introduciamo un metodo efficiente per marcare retrogrademente le cellule gangliari retiniche (RGC) nel pesce zebra adulto.

Etichettatura retrograda di cellule gangliari della retina in Zebrafish adulti con coloranti fluorescenti

Poiché molti modelli di zebrafish di malattie neurologiche e non neurologiche sono studiate nei pesci adulti piuttosto che l'embrione / larve, abbiamo sviluppato una linea laterale rigenerativo dosaggio quantitativo che può essere applicato a modelli di malattia di zebrafish adulto. Il saggio coinvolto risoluzione al neuromast 1) e 2) livelli di cellule singolo capello.

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

Qui dimostriamo quantificazione dei de- retina e la rigenerazione e il suo impatto sulla funzione visiva con N -methyl- N -nitrosourea in zebrafish adulto. Perdita di acuità visiva e diminuito il numero dei fotorecettori sono state seguite dalla proliferazione nello strato nucleare interno. Completa rigenerazione morfologica e funzionale si è verificato 30 giorni dopo il trattamento iniziale.

Methylnitrosourea (MNU) indotta retinica degenerazione e rigenerazione in Zebrafish: istologica e Caratteristiche Funzionali

la rigenerazione della retina zebrafish è stato per lo più studiata utilizzando retine fissi. Tuttavia, i processi dinamici come la migrazione nucleare interkinetic si verificano durante la risposta rigenerativa e richiedono live-cell imaging per studiare i meccanismi alla base. Qui, descriviamo condizioni di coltura e di imaging per monitorare Interkinetic migrazione nucleare (INM) in tempo reale utilizzando la microscopia multiphoton.

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

Zebrafish è un popolare modello animale per lo studio dei meccanismi di degenerazione/rigenerazione della retina nei vertebrati. Questo protocollo descrive un metodo per indurre lesioni localizzate interrompendo la retina esterna con danno minimo per la retina interna. Successivamente, monitoriamo in vivo la morfologia retinica e la risposta di glia di Müller durante rigenerazione retinica.

Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish

Viene descritto un modello di lesione cerebrale meccanica nel pesce zebra adulto per studiare i meccanismi molecolari che regolano la loro elevata capacità rigenerativa. Il metodo spiega di creare una ferita da taglio nel tectum ottico di più specie di piccoli pesci per valutare le risposte rigenerative utilizzando l'immunocolorazione fluorescente.

Modello di lesione da coltellata del tectum ottico adulto utilizzando zebrafish e medaka per l'analisi comparativa della capacità rigenerativa

Il presente protocollo descrive un metodo per indurre lesioni tessuto-specifiche e altamente riproducibili nelle larve di zebrafish utilizzando un sistema di lesione laser combinato con una piattaforma microfluidica automatizzata per la manipolazione delle larve.

Lesioni indotte da laser semi-automatizzate controllate per lo studio della rigenerazione del midollo spinale nelle larve di zebrafish

L'articolo spiega come rimuovere chirurgicamente gli occhi dalle larve viventi di zebrafish come primo passo verso lo studio di come l'input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del tectum ottico. Inoltre, l'articolo fornisce informazioni sull'anestesia larvale, la fissazione e la dissezione cerebrale, seguite da immunoistochimica e imaging confocale.

Rimozione dell'occhio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dall'innervazione e lo sviluppo del sistema visivo

Questo protocollo descrive la metodologia per ablare geneticamente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando un modello transgenico di zebrafish. L'adattamento del protocollo per incorporare la modulazione della via di segnalazione utilizzando composti farmacologici è ampiamente dettagliato. È stata sviluppata una piattaforma MATLAB per quantificare la rigenerazione RPE basata sulla pigmentazione, che viene presentata e discussa.

Ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma MATLAB (RpEGEN) per lo studio della rigenerazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish

Scopri un nuovo protocollo per indurre degenerazione retinica in zebrafish adulti danneggiando fotorecettori a bastoncello e cono. Questo metodo combina esposizione UV e luce continua per studiare rigenerazione retinica.

A Novel Luce Danni Paradigma per l'uso in retina Rigenerazione Studi in Zebrafish adulti

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