A Novel Luce Danni Paradigma per l'uso in retina Rigenerazione Studi in Zebrafish adulti

L'obiettivo generale di questa procedura è combinare due protocolli precedentemente descritti di degenerazione retinica indotta dalla luce, al fine di danneggiare sia i fotorecettori a bastoncello che quelli a cono in tutta la retina. Questo risultato si ottiene esponendo prima dei pesci zebra adulti adattati al buio alla luce UV per 30 minuti. Il secondo passaggio consiste nel trasferire immediatamente i pesci trattati con UV in vasche circondate da quattro lampade alogene da 250 watt ed esporre i pesci a luce continua per un periodo fino a quattro giorni.

L'ultimo passaggio consiste nell'eutanasia del pesce e nella nucleazione degli occhi per ulteriori analisi. Infine, la microscopia a immunofluorescenza viene utilizzata per mostrare una perdita costante sia dei fotorecettori a bastoncello che a cono in tutta la retina. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il trattamento con luce UV o il trattamento simile a una lampada alogena, è che la combinazione di questi due metodi determina l'ablazione sia dei fotorecettori a bastoncello che a cono in tutta la retina.

Il danno ai fotorecettori induce una risposta proliferativa diffusa che alla fine porta alla rigenerazione dei fotorecettori perduti. A dimostrare questa tecnica sarà Jennifer Thomas, una studentessa laureanda del mio laboratorio. Per iniziare, utilizzare una piastra di Petri di vetro rovesciata con diametro di 15 centimetri come supporto e fissarla al banco di laboratorio per l'esposizione alla luce UV.

Rimuovere il filamento della luce UV dal microscopio stereoscopico a fluorescenza. Quindi fissare con del nastro il filamento della luce UV sopra la piastra di Petri capovolta, in modo che circa due millimetri dell'estremità del filamento sporgano oltre il bordo della piastra. Successivamente, ricoprire con carta d'alluminio metà delle facce inferiori e la parte posteriore di un becher di vetro da 250 millilitri, assicurandosi che il lato lucido della carta sia rivolto verso l'interno del becher.

Successivamente, riempire il becher con 100 millilitri di acqua proveniente dall'impianto per pesci. Posizionare questo becher all'interno di un becher da quattro litri. Quindi, riempire il becher da quattro litri con acqua fino a quando il livello dell'acqua è allineato con la linea dei 100 millilitri nel becher da 250 millilitri.

Al massimo 10 pesci trattati al buio nel becher da 250 millilitri, coprire il becher da 250 millilitri con un piccolo pezzo di carta stagnola. Successivamente, posizionare l'intero apparato di becher immediatamente adiacente al filamento UV. Il filamento deve toccare l'esterno del becher da quattro litri e deve essere rivolto verso la parte esposta del becher da 250 millilitri.

Assicurarsi che il becher da 250 millilitri sia posizionato al centro del fondo del becher da quattro litri. Successivamente, posizionare una grande schermatura opaca dietro il becher da quattro litri, in modo da esporre gli animali ma impedire al personale del laboratorio di vedere l'estremità del filamento UV. Quindi accendere l'alimentatore UV.

Impostare il timer su 30 minuti e posizionare le etichette di avvertenza necessarie per garantire che il personale del laboratorio non si esponga accidentalmente alla radiazione UV. Dopo 30 minuti, spegnere la fonte di alimentazione UV. Quindi rimuovere il becher da 250 millilitri contenente i pesci.

In questa procedura, trasferire il pesce dal becher da 250 millilitri a un acquario trasparente in acrilico da 1,8 litri. Successivamente, riempire l'acquario fino al segno di trabocco per impostare l'area di trattamento luminoso con lampada alogena. Posizionare due lampade alogene da 250 watt nella stessa direzione e a 29 centimetri di distanza dall'acquario.

Quindi posizionare gli altri due faretti in modo analogo sul lato opposto, lasciando circa 73 centimetri tra i due gruppi di faretti. Successivamente, posizionare il ventilatore a uguale distanza tra i due gruppi di faretti, appena al di fuori dell'area di trattamento luminoso. In seguito, posizionare due serbatoi da 1,8 litri riempiti d'acqua al centro dell'area di trattamento luminoso, equidistanti rispetto ai due gruppi di faretti.

Quindi posizionare un aeratore di ossigeno in ciascun serbatoio. Coprire ogni serbatoio con coperchi in acrilico trasparente, lasciando un'apertura di due centimetri all'estremità più vicina al ventilatore. Disporre il ventilatore in modo che soffi aria attraverso questa apertura e inserire un termometro in uno o in entrambi i serbatoi.

Successivamente, accendere l'alimentazione della ventola delle luci e degli aeratori. Mantenere il trattamento luminoso per un massimo di quattro giorni. I pesci non devono essere alimentati durante il trattamento luminoso, poiché ciò influirebbe sulla qualità dell'acqua e causerebbe un maggiore stress agli animali.

Monitorare quotidianamente la temperatura e il livello dell'acqua, mantenendo la temperatura tra 30 e 33 gradi Celsius. Se necessario, regolare la velocità della ventola e la distanza tra i serbatoi e le luci. Inoltre, riempire ogni serbatoio con acqua del sistema ogni giorno.

48 ore dopo l'inizio del trattamento con luce alogena, rimuovere i pesci dall'area di trattamento. Successivamente, preparare dell'etanolo formale fresco per fissare e praticare l'eutanasia ai pesci zebra mediante un sovradosaggio anestetico di etossietanolo. Dopodiché, trasferire i pesci zebra eutanizzati su un tovagliolo di carta, quindi enucleare l'occhio utilizzando una pinza curva.

Mantenere gli occhi nucleati e il fissativo tutta la notte a quattro gradi Celsius per la crioconservazione. Proteggere gli occhi. Lavarli in saccarosio al 5% in una volta PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.

Quindi sostituirlo con una soluzione fresca di saccarosio al 5% in PBS 1X e mantenere gli occhi per due ore. Dopo due ore, lavare gli occhi in saccarosio al 30% in PBS 1X durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare gli occhi in una soluzione 1:1 di mezzo crioprotettivo e saccarosio al 30% in PBS 1X durante la notte a quattro gradi Celsius.

In seguito, incorporare gli occhi in un mezzo di congelamento per tessuti al 100%, orientandoli lungo l'asse dorso-ventrale. Quindi, conservarli a meno 80 gradi Celsius per almeno due ore prima di effettuare la criosezione del tessuto. A questo punto, effettuare la criosezione del tessuto e posizionarlo su vetrini in vetro.

Quindi riscaldare i vetrini per due ore a 55 gradi Celsius. Successivamente, conservare i vetrini a meno 80 gradi Celsius o eseguire immediatamente un'immunohistochimica standard e acquisire le immagini mediante microscopia a fluorescenza. Questa figura mostra i cambiamenti nella risposta proliferativa in seguito a diversi paradigmi di danno luminoso.

Di seguito sono mostrate sezioni retiniche di un pesce zebra albino adulto, marcate mediante immunomarcatura con PCNA per evidenziare la proliferazione cellulare, indicata in rosso nelle metà dorsale e ventrale della retina, a seguito di diversi paradigmi di danno luminoso allo zero ore. La proliferazione era assente nello strato interclear a 48 HLT. Singole cellule progenitrici erano presenti nello strato nucleare interno (INL) lungo la retina dorsale e in una piccola porzione della retina ventrale.

A 48 HPUV. Colonne di cellule progenitrici erano presenti nella retina dorsale, mentre solo singole cellule progenitrici erano presenti in una piccola porzione della retina ventrale. A UV più 48, ampie colonne di cellule progenitrici erano presenti in tutta la retina dorsale e ventrale.

Questa figura mostra la perdita di fotoricettori a bastoncello e a cono nei pesci zebra pigmentati in seguito a diversi paradigmi di danno luminoso. Qui vengono mostrate sezioni retiniche colorate con Pro Tre per evidenziare i nuclei in blu e marcate con immunomarcatura zpr R tre per mostrare i segmenti esterni dei bastoncelli in magenta o zpr R uno per mostrare i coni doppi in oro, a seguito di ciascun paradigma di danno luminoso. Si osservano diminuzioni significative dei nuclei dei fotoricettori a bastoncello nella retina dorsale a 48 HLT e nella retina dorsale e ventrale a UV più 48 HLT.

Sebbene i nuclei fossero ipertrofici nella retina dorsale a 48 HPUV, nessuna diminuzione significativa dei nuclei dei doppi coni era presente a 48 HLT o a 48 HPUV. Diminuzioni significative dei nuclei erano presenti nella retina dorsale e ventrale a UB più otto H lt. Combinando questa procedura con altri metodi come inibitori farmacologici specifici per geni o l'abbattimento in vivo delle proteine, è possibile rivelare il ruolo di singoli geni nella degenerazione dei fotoricettori e nella successiva risposta rigenerativa.