Espressione dei funzionali ricombinante emoagglutinina e neuraminidasi proteine ​​del virus Novel H7N9 Influenza utilizzando l'espressione sistema Baculovirus

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare glicoproteina di superficie purificata correttamente ripiegata per l'influenza, l'emoagglutinina e la neuraminidasi per saggi immunologici ed esperimenti di vaccinazione. Ciò si ottiene clonando prima il BMid ricombinante che trasporta i geni dell'influenza, seguito dalla generazione di virus ricombinanti della baula. Il secondo passo consiste nell'utilizzare questi virus ricombinanti della baula per esprimere le proteine dell'emoagglutinina e della neuraminidasi nelle cellule degli insetti.

Successivamente, le proteine ricombinanti vengono purificate dal surnatante della coltura cellulare utilizzando la cromatografia di affinità. Il passo finale consiste nel caratterizzare queste proteine per garantire una buona qualità e funzionalità biologica. In definitiva, le proteine ricombinanti vengono utilizzate per studiare le risposte immunitarie alle glicoproteine di superficie del virus dell'influenza.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'espressione batterica di HA, ad esempio, è che gli antigeni purificati sono ripiegati correttivamente e rimangono anche biologicamente attivi, invece di utilizzare interi preparati virali per i saggi immunologici. Questi reagenti consentono di misurare le risposte immunitarie contro l'emoagglutinina e le proteine non neuraminidasi. Iniziare questo protocollo solo con la generazione di virus ricombinante della baula come descritto nel protocollo di testo lavorando in modo asettico in una piastra a cappa a flusso laminare, SF nove cellule di insetto in piastre a sei pozzetti a una densità di 200.000 cellule per centimetro quadrato.

E sediamoci per 20 minuti in un'incubatrice a 28 gradi Celsius senza CO2. Quindi mescolare due microgrammi di back mid ricombinante con 100 microlitri di Trico Leia ginocchio formulazione media HINK o TNM fh. Quindi mescolare sei microlitri di agente di trasfezione con 100 microlitri di terreno per insetti TNM FH.

Unire i due volumi, mescolare delicatamente e lasciare riposare la miscela di trasfezione per 20 minuti. A temperatura ambiente includere una finta trasfezione come controllo, che contiene il reagente di trasfezione ma non il DNA. Rimuovere lo SNAT dalle nove cellule SF piatte e sostituirlo con due millilitri di terreno TNM FH privo di siero contenente l'1% di penicillina streptomicina soluzione.

Aggiungere l'intero volume della miscela di trasfezione alle celle e agitare accuratamente la piastra a sei pozzetti per cinque secondi. Incubare in un incubatore a 28 gradi Celsius senza CO2 per sei ore. Sostituire il terreno con un terreno TNM FH completo e fresco prima di incubare la piastra nelle stesse condizioni per sei giorni.

Controllare le cellule di tanto in tanto al microscopio. Le cellule infette di solito appaiono più grandi. I nuclei più rotondi si sono ingranditi e iniziano a staccarsi.

Raccogliere le cellule sei giorni dopo la trasfezione mediante centrifugazione a 2000 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Il surnatante contiene il virus della baula ricombinante e verrà utilizzato per generare immediatamente scorte di lavoro, oppure può essere conservato a quattro gradi Celsius per anni. Controllare l'espressione proteica tramite SDS page e western blot e preparare le scorte di lavoro come descritto nel protocollo di testo.

Le nove cellule SF supportano molto bene la crescita del virus maculare. Tuttavia, la loro capacità di secernere grandi quantità di proteine ricombinanti è limitata. Pertanto, utilizziamo un'altra linea cellulare di insetto.

Cinque cellule per l'espressione di proteine ricombinanti secrete. Queste cellule non supportano la crescita del virus balo ad alti titoli, ma hanno una capacità secretoria molto elevata. Coltiva alte cinque cellule in un terreno di coltura cellulare di insetti SFX in fiasche da 175 centimetri quadrati a giorni alterni.

Dividendoli in un rapporto di uno a tre. Coltiva cinque fiasche confluenti per una coltura di espressione da 200 millilitri per raccogliere e infettare le cinque cellule. Per prima cosa, stacca le cinque celle toccando le fiasche.

Raccogliere la sospensione cellulare e trasferirla in provette da centrifugazione da 50 millilitri. Centrifugare i tubi a 1200 G per sette minuti a temperatura ambiente. Togliete il surnatante per decantazione e unite i pellet per resus, sospendendoli in 15 millilitri di brodo P tre.

Lasciare riposare le cellule per 15 minuti nella cappa di flusso. Trasferire 200 millilitri di terreno di coltura SFX ad alto clone in un pallone shaker sterile pulito da 1000 millilitri. Quindi trasferire la sospensione di tre celle P nel sigillo dell'agitatore con un foglio di alluminio sterile prima di agitare a 70 giri/min e 28 gradi Celsius per 72-96 ore.

Raccogliere proteine ricombinanti da surnatanti ad alta espressione cellulare a 72-96 ore dopo l'infezione. Trasferire i surnatanti di coltura in secchi di centrifugazione da 500 millilitri. Centrifugare a 5, 500 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Nel frattempo, sciacquare tre volte il pallone con acqua distillata doppia. Pipetta successiva. Tre millilitri di impasto di resina di nichel in una provetta da 50 millilitri con 45 millilitri di PBS per 200 millilitri di coltura.

Agitare bene prima di centrifugare per 10 minuti a 3000 G e temperatura ambiente dopo la centrifugazione. Decantare il PBS e conservare il pellet. Miscelare il surnatante di cellule d'insetto con il pellet di resina di nichel e trasferire nei palloni shaker già sciacquati.

Incubare a quattro gradi Celsius per due o quattro ore agitando. Quindi, montare una colonna in polipropilene da 10 millilitri su un morsetto su un supporto di supporto. Rimuovere entrambi i tappi e posizionare un becher sotto la colonna per raccogliere il flusso.

Dopo l'incubazione del pallone agitatore, iniziare a trasferire la miscela di liquame surnatante sulla colonna. Manterrà la resina di nichel e solo il surnatante scorrerà attraverso. Passare l'intero volume sulla colonna.

Lavare la resina quattro volte con 15 millilitri di tampone di lavaggio. Far scolare il tampone di lavaggio dalla colonna e chiudere il lato inferiore con il tappo. Aggiungiamo due millilitri di tampone eluciano e lasciamo riposare per cinque minuti.

Apri la colonna e raccogli l'eit, tenendolo sul ghiaccio bagnato quando possibile. Ripeti l'operazione altre tre volte. Un EIT che contiene alte concentrazioni di proteine mostra tipicamente schiuma quando viene agitato per sostituire il tampone e concentrare prima la proteina, unità di centrifugazione ad ultrafiltrazione da 15 millilitri a rotazione libera con PBS a 3000 G e quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Scartare il flusso e caricare l'EIT sulla colonna di rotazione. Riempire la colonna con cinque millilitri di PBS sterile ghiacciato prima di centrifugare nelle stesse condizioni per 60 minuti. Scaricare nuovamente il flusso, riempire con 15 millilitri di PBS ghiacciato e centrifugare per altri 60 minuti.

Ripetere questa procedura ancora una volta, quindi raccogliere il concentrato scambiato con il tampone che rappresenta la proteina ricombinante altamente concentrata. Mantenere sempre il concentrato sul ghiaccio. Sciacquare la colonna centrifuga con 400 microlitri di PBS sterile ghiacciato e aggiungerlo al concentrato.

La proteina può quindi essere caratterizzata come descritto nel protocollo del testo. Le proteine HA e NA espresse dai ceppi ENUE e Shanghai hanno mostrato livelli di espressione moderati che vanno da 0,2 milligrammi per litro per l'influenza A raccolti a Shanghai a 0,7 milligrammi per litro per l'influenza. Le molecole A raccolte in enue, neuraminidasi o NA di entrambi i ceppi hanno mostrato livelli di espressione moderati che vanno da 0,2 milligrammi per litro per l'influenza A raccolta a Shanghai a 0,7 milligrammi per litro per l'influenza A raccolta in enue.

Tutti e quattro i preparati proteici avevano pochissime o nessuna impurità e l'ha era di purezza superiore a quella del nas, il che può essere spiegato dal livello di espressione. L'influenza A raccolta a Shanghai HA è stata ulteriormente analizzata utilizzando ELI SA con l'anticorpo monoclonale umano reattivo al gambo ampiamente neutralizzante CR 9 1 1 4. Come mostrato qui in blu, questo anticorpo monoclonale si lega a un epitopo di conferma sensibile nel dominio stock e viene utilizzato qui come sonda per il corretto ripiegamento di questo dominio.

L'anticorpo mostra un buon legame, come evidenziato dall'aumento dell'assorbanza a 490 nanometri, che dà la certezza che l'HA sia effettivamente piegato correttamente. Un secondo, Eliza con anti emoagglutinina del siero policlonale di topo del sottotipo sette è stato eseguito per confermare l'identità della proteina ottenuta come emoagglutinina di origine del sottotipo sette. Dopo aver visto questo video, hai una buona comprensione di come esprimere il virus dell'influenza ricombinante, l'emoagglutinina e le proteine della neuraminidasi nel tuo laboratorio.

Questo processo potrebbe anche essere utile per l'espressione di altre proteine virali o di membrana cellulare. Vi auguro buona fortuna per i vostri esperimenti.