Isolamento dei vasi sanguigni derivati ​​da Multipotent precursori del muscolo scheletrico umano

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e purificare sottopopolazioni di cellule precursori multipotenti derivate da vasi sanguigni umani a partire da un singolo prelievo bioptico di muscolo scheletrico; in primo luogo, dissociare il campione bioptico muscolare e digerirlo con una combinazione di collagenasi di tipo uno, due e quattro. Successivamente, etichettare la sospensione cellulare monocellulare con anticorpi coniugati a fluorocromi che riconoscono una combinazione di specifici marcatori di superficie cellulare. Infine, eseguire il sorting cellulare attivato da fluorescenza mediante citometria a flusso.

Visualizzare ed espandere i sottotipi cellulari ordinati in condizioni di coltura specifiche a densità ottimali. In definitiva, l'analisi post-ordinamento delle cellule purificate, nonché il successivo citometria a flusso e analisi RT-PCR dei sottoinsiemi cellulari coltivati, vengono utilizzati per dimostrare la purezza di questi sottoinsiemi omogenei di BVSE. Sì, questo metodo, sa, può rispondere davvero, sa, a quale sia l'origine di quelle cellule staminali mesocameline?

Sai, perché molte persone hanno trovato diversi tipi di cellule staminali in diversi tessuti. Quindi ritengo che questo possa chiarire l'origine di tali cellule staminali, nonché il ruolo svolto dalle cellule perivascolari e da qualsiasi altra cellula derivata dai vasi sanguigni nella rigenerazione e riparazione dei tessuti. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale quanto la biopsia muscolare.

Le fasi di dissociazione possono essere difficili da apprendere. I dettagli tecnici e l'ottimizzazione della digestione con collaghenasi sono fondamentali per il rendimento e la purificazione delle cellule bersaglio. Trasportare il prelievo di muscolo scheletrico umano su ghiaccio.

In DM M supplementato con 5% di FBS e 1% di penicillina-streptomicina in condizioni sterili. Lavare il campione due volte con PBS contenente 2% di antibiotico-antimicotico, quindi in dms, supplementato con 2% di aa. Rimuovere il tessuto adiposo e connettivo aderente.

Rimuovere anche i vasi sanguigni di grandi dimensioni al microscopio stereoscopico. Tagliare ora il campione muscolare in piccoli pezzi. Trasferire i campioni in 20 millilitri di mezzo di conservazione per la conservazione a quattro gradi Celsius per un massimo di cinque giorni.

Il giorno dell'isolamento cellulare, rimuovere i pezzi di muscolo e lavarli due volte in PBS contenente 2% pen strip. Per preparare ora la soluzione di digestione, aggiungere 100 milligrammi per millilitro, ciascuno, di collagenasi di tipo uno, tipo due e tipo quattro in pm.

Infine, tritare e macinare meccanicamente i pezzi di muscolo con una piccola quantità di pm. Far passare la soluzione attraverso una pipetta sierologica da 10 millilitri, verificando l'assenza di coaguli. Rimuovere il tessuto adiposo e connettivo residuo durante questo processo.

Quindi trasferire metà del campione adulto in 20 millilitri o tutto il campione fetale in 10 millilitri di soluzione di digestione. Incubare il campione per 50-60 minuti a 37 gradi Celsius su un agitatore orbitale a 70-80 giri al minuto. Osservare lo stato di digestione ogni 15-20 minuti.

Ottimizzare il rendimento cellulare e la conservazione degli antigeni di superficie regolando il tempo di digestione e/o la velocità di agitazione in base alla quantità di tessuto; quando la turbidità è quasi completamente scomparsa, pipettare vigorosamente il tessuto digerito da tre a cinque volte. Aggiungere un volume equivalente di PM per arrestare la reazione, quindi centrifugare a 400 G per quattro minuti. Rimuovere con attenzione il sopranatante, lavare il pellet e risospendere in 10 millilitri di PM. Filtrare attraverso un filtro cellulare da 100 micron, centrifugare a 400 G per quattro minuti e rimuovere con attenzione il sopranatante.

Successivamente, risospendere i pellet nel buffer di lisi dei globuli rossi e filtrare attraverso un filtro cellulare da 70 micron per ottenere una sospensione monocellulare. Dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri. Se si osserva della precipitazione, pellettare le cellule mediante centrifugazione e risospendere.

Sospendere in 0,5 millilitri di PBS e contare il numero di cellule per la colorazione. Diluire la sospensione di cellule singole a meno di 5 milioni di cellule per millilitro con un'aliquote di PBS, da 50 a cento microlitri di sospensione cellulare, e suddividere in 11 provette per il controllo non colorato, i controlli negativi e i controlli positivi monocromatici. Se necessario, bloccare la sospensione di cellule singole per 10 minuti a quattro gradi Celsius nel siero di topo.

Aggiungere le soluzioni di anticorpi in base al disegno sperimentale e incubare per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Pellettare le cellule mediante centrifugazione e lavare ogni pellet campione una volta in PM diluito a una concentrazione finale di 5 milioni di cellule per millilitro per l'esclusione delle cellule morte, utilizzando un diluizione da uno a 100 di sette a a d, quindi incubare per 15 minuti a temperatura ambiente per il controllo negativo e i controlli positivi monocromatici. Risospendere i pellet cellulari in 0,5 millilitri di PM diluito.

Trasferire tutte le sospensioni cellulari in provette per citofluorimetria in polistirolo con fondo rotondo. Preparare ora le provette per la raccolta delle cellule aggiungendo 500 microlitri del mezzo coerente appropriato. Trasportare le sospensioni cellulari su ghiaccio fino alla cella.

Eseguire il sorting delle sospensioni cellulari sul citofluorimetro in ordine: controllo non colorato, controlli negativi, controlli positivi monocromatici e sospensione cellulare principale, regolando rigorosamente l'intensità del laser, la compensazione dei canali e il gating delle popolazioni cellulari per massimizzare la purezza cellulare. Raccogliere le popolazioni cellulari desiderate nei tubi di raccolta appropriati. Conservare le cellule raccolte a quattro gradi Celsius.

Se non si semina immediatamente, seminare subito dopo il sorting. Cellule endoteliali miogeniche in MPM su piastre precedentemente rivestite con collagene di tipo I per il successivo confezionamento del seme ECS.

3.500-4.000 cellule per centimetro quadrato in MPM su piastre o fiasche pre-ricoperte con seme di collagene di tipo I. Parassiti appena selezionati in e gm due su piastre appena ricoperte con gelatina 0,2% per il primo e il secondo passaggio. Suddividere le cellule in rapporto 1:3 in mezzo PC su colture di polistirene regolari.

Piastre a partire da P tre in poi. Seminare le cellule a una densità compresa tra 6.500 e 7.000 cellule per centimetro quadrato in mezzo PC su piastre di coltura in polistirene ordinario. Per i flaconi, seminare le cellule di tessuto avventizio appena ordinate in mezzo AC su piastre di coltura in polistirene ordinario per il successivo confezionamento delle cellule seme ACS a una densità compresa tra 6.000 e 7.000 cellule per centimetro quadrato in mezzo AC su piastre di coltura in polistirene ordinario.

I parametri dei fatti dei flaconi vengono inizialmente corretti in base ai dati ottenuti dal controllo non colorato, dai controlli negativi e dai controlli positivi monocromatici, dopo l'esclusione delle cellule morte; la sospensione cellulare marcata con fluorescenza viene quindi sottoposta a una serie di selezioni di marcatori di superficie cellulari negativi e positivi. Innanzitutto, le cellule positive per CD45 vengono selezionate ed escluse. Successivamente, le cellule positive per CD56 e quelle negative per CD56 vengono separate dalla frazione negativa per CD45.

La frazione positiva per CD56 viene ulteriormente sottoposta alla selezione per CD34 e CD144, in cui solo le cellule doppio-positive vengono identificate come cellule endoteliali miogeniche e successivamente raccolte. Analogamente, la frazione negativa per CD56 viene ulteriormente sottoposta alla selezione per CD34 e CD146, in cui solo le cellule negative per CD34 e positive per CD146 vengono identificate come parassiti e successivamente raccolte; la frazione positiva per CD34 e negativa per CD146 viene sottoposta a un'ulteriore selezione negativa per CD31 per escludere le cellule endoteliali, e solo il sottoinsieme positivo per CD34 e negativo per CD31 viene identificato come cellule adv per la raccolta. In questo caso, CD144 può essere utilizzato al posto di CD31 per l'esclusione delle cellule endoteliali.

Questi sottoinsiemi di C-S-V-P-U sono stati purificati da biopsie muscolari di un singolo donatore. A differenza delle tipiche cellule staminali muscolari eterogenee, le colture di sottoinsiemi di cellule staminali derivate dai vasi sanguigni umani rimangono omogenee anche dopo un'espansione a lungo termine. Come sapete, ritengo molto importante che i ricercatori specializzati in auto utilizzino la stessa tecnica per isolare, sapete, quelle cellule staminali derivate dai vasi sanguigni che abbiamo descritto nei nostri laboratori.

Pertanto, riteniamo che questa tecnica, applicata in modo comparativo, permetterà alle persone di riprodurre i nostri risultati e di confrontare efficacemente i risultati ottenuti da un gruppo di lavoro rispetto a un altro. Non dimenticate che lavorare con tessuto umano fresco può essere estremamente pericoloso. È necessario adottare precauzioni, come indossare guanti in nitrile e protezioni per gli occhi, durante l'esecuzione di questa procedura.