FIBS-enabled non invasiva Metabolic Profiling

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare il livello intracellulare di glucosio o glutammina in modo non invasivo utilizzando biosensori basati su proteine geneticamente codificate. Ciò si ottiene effettuando prima il transzionamento delle cellule di interesse con il gene biosensore contenente il plasmide e selezionando quelle cellule che esprimono il biosensore. Nella seconda fase, i campioni di coltura cellulare vengono prelevati da colture batch o alimentate e vengono misurati i loro rapporti di fret.

La concentrazione intracellulare di glucosio o glutammina dei campioni può quindi essere determinata mediante un test indipendente. In definitiva, il fret ratio dei campioni può essere utilizzato per calcolare la concentrazione intracellulare di glucosio o glutammina in modo non invasivo e in tempo reale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al miglioramento dei bioprocessi perché si tratta di un metodo affidabile per ottenere informazioni metaboliche in tempo reale che possono essere utilizzate per l'ottimizzazione e il controllo online.

Sebbene il metodo possa essere utilizzato per fornire informazioni sui bioprocessi, può essere utilizzato anche in altri sistemi, incluso il rilevamento dei marcatori di malattia. Inizia rivitalizzando le cellule CHO in nove millilitri di terreno di crescita completo. Quindi centrifugare le cellule, risospendere il pellet in 10 millilitri di crescita fresca, mezzo, e contare le cellule per trippa in esclusione del dado blu.

Successivamente, avviare una coltura a una densità di semina di tre volte 10 alla quinta cellula per millilitro in 125 millilitri. Palloni di agitazione a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 su una piattaforma di agitazione orbitale. Con una rotazione di 125 giri/min, sottocoltivare le cellule ogni tre o quattro giorni nel mezzo di crescita completo a una densità di seduta di due volte 10 al quinto per millilitro per la trasfezione cellulare.

Mantenere le celle a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 per 12-24 ore prima della trasfezione per assicurarsi che le cellule si dividano attivamente. Quindi, dopo aver preparato il DNA plasmidico, contare le cellule mediante trippa e blue die exclusion e diluire le cellule fino a un volume di lavoro di 20 millilitri di terreno di coltura cellulare. In un pallone da 125 millilitri, agitare il pallone a una concentrazione di una volta per 10 per la sesta cellula per millilitro.

Utilizzare un kit di trasfezione adatto alla linea cellulare in uso, che includa almeno un pozzetto di controllo negativo contenente cellule, ma non DNA. Incubare le cellule trasfettate per quattro giorni in modalità statica. Ora aggiungi l'antibiotico appropriato per la selezione del plasmide a una concentrazione appropriata determinata da una curva di uccisione.

Ad esempio, in questo studio, lo zin è stato aggiunto a una concentrazione finale di 400 grammi per millilitro per la selezione delle cellule trasfettate, quindi trasferire le colture su una piattaforma di agitazione rotante a 125 giri/min. Cambiare il terreno a un intervallo di tempo appropriato per la linea cellulare, aggiungendo antibiotico ogni volta fino a quando le cellule nel pozzetto di controllo non sono morte. Usa i pozzetti più confluenti per passare alle colture di scuotimento.

Quindi congelare le cellule in fiale criogeniche contenenti da una volta 10 alla settima cellula vitale in un millilitro di miscela di liofilizzazione per generare curve di crescita batch e batch. In primo luogo, stabilire colture cellulari triplicate delle cellule CHO trasfettate in fiasche Shake da 250 millilitri con un volume di lavoro di 50 millilitri. Quindi posizionare le colture in un incubatore cellulare umidificato con agitazione e rimuovere campioni da 4,1 millilitri da ciascuna coltura in crescita a intervalli di 24 ore Per le colture batch Fed, integrare le cellule con la quantità appropriata di glucosio o glutammina il sesto giorno per ripristinare le loro concentrazioni ai valori iniziali.

Alimentando le colture di controllo con lo stesso volume di acqua pura, utilizzare 100 microlitri dei campioni da 4,1 millilitri al giorno per contare le cellule per viaggio e l'esclusione del die blu fino a quando la concentrazione di cellule vitali non si riduce a zero. Per determinare le misurazioni del rapporto di fret, centrifugare due millilitri dei campioni giornalieri e risospendere il pellet in due millilitri di PBS ghiacciato, trasferire metà della sospensione cellulare in una piastra a sei pozzetti e aggiungere un campione bianco che non contiene cellule a uno. Bene, quindi misura immediatamente i livelli di fluorescenza blu e gialla a una lunghezza d'onda di eccitazione di 430 con una larghezza di banda di 35 nanometri e una lunghezza d'onda di missione di 465 con una larghezza di banda di 35 nanometri e 520 con una larghezza di banda di 10 nanometri rispettivamente per la fluorescenza blu e gialla.

Calcola i rapporti dei tasti determinando il rapporto tra la fluorescenza gialla rilevata e quella della fluorescenza blu. Ora centrifuga gli ultimi due millilitri di campioni giornalieri e poi lava il pellet due volte in PBS ghiacciato dopo il secondo lavaggio. Sonicare il campione cinque volte per tre minuti ogni volta a un impulso di 15 secondi acceso e 15 secondi spento.

Infine, eseguire i saggi dei metaboliti secondo le istruzioni del produttore e utilizzare le curve standard risultanti per calcolare i livelli intracellulari di glucosio o glutammina, a seconda dei casi. In questo esperimento rappresentativo, sono state mantenute colture in batch overgrown di due linee cellulari, come appena dimostrato, con campioni giornalieri utilizzati per la calibrazione in vivo di ciascuna fibs. In questo grafico viene dimostrato un profilo di crescita cellulare vitale rappresentativo delle due linee cellulari in relazione ai loro livelli intracellulari di glucosio o glutammina e in questa tabella sono presentate le corrispondenti misurazioni di FRET e le concentrazioni di metaboliti intracellulari determinate dai saggi enzimatici.

È stato determinato che il basso numero di cellule presente nei primi quattro giorni di coltura ha portato a un segnale di fret inaffidabile. Allo stesso modo, l'alto livello di lisato cellulare presente dopo l'ottavo giorno di coltura ha prodotto un'elevata quantità di diffusione della luce. Pertanto, solo i dati per i giorni da quattro a otto vengono utilizzati per costruire le curve di calibrazione per le fibs di glucosio e glutammina.

I risultati indicano che il segnale FIB produce una correlazione affidabile con le concentrazioni intracellulari comprese tra uno e cinque millimolari per il glucosio e 0,3 e due millimolari per la glutammina. Per convalidare i risultati delle fibs, sono state eseguite colture alimentate con bash overgrown delle due linee cellulari. Un mangime contenente un'alta concentrazione di substrato è stato integrato il sesto giorno della coltura cellulare per aumentare le concentrazioni extracellulari del substrato.

Come gli innesti raffigurano, i rapporti di fret su ogni giorno mostrano una chiara risposta all'alimentazione. Invertendo la tendenza, hanno seguito fino al sesto giorno. Ad esempio, nelle colture alimentate con glucosio, la concentrazione extracellulare di glucosio è aumentata fino a 36 millimolari.

Mentre nelle colture alimentate con glutammina, la concentrazione di glutammina è aumentata a quattro millimolari. Nell'esperimento del glucosio, il rapporto di fret per la linea cellulare scelta dalle fibs di glucosio è diminuito il settimo giorno in risposta all'aggiunta di glucosio. Poiché le fibs di glucosio seguono l'APO sulla configurazione.

Allo stesso modo, nell'esperimento sulla glutammina, il rapporto di fret per le fibs di glutammina scelte dalla linea cellulare è aumentato in risposta all'aggiunta di glutammina in linea con il principio dei sensori di spegnimento APO. Queste misurazioni dei tasti sono state infine utilizzate per calcolare le corrispondenti concentrazioni intracellulari di glucosio e glutammina in base alle curve di calibrazione sopra menzionate. Vengono confrontati con le concentrazioni intracellulari effettive di questi substrati determinati con i saggi enzimatici di glucosio e glutammina e mostrano un accordo adeguato dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'esplorazione dell'effetto di diverse formulazioni di terreni sulla produttività delle proteine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare i biosensori geneticamente codificati per monitorare le concentrazioni di metaboliti intracellulari.