DNBS / TNBS Colite Modelli: Fornire Insights Into malattia infiammatoria intestinale e gli effetti di grassi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di offrire un metodo alternativo ed economico per studiare la malattia infiammatoria intestinale o IBD utilizzando l'acido nitrobenzene zonico DY o DNBS. Ciò si ottiene somministrando prima la DNBS per via intrarettale tramite un leggero inserimento nell'ano. Nella seconda fase, vengono acquisite sezioni di tessuto dell'intestino crasso per lo screening istologico e per valutare l'attività della mielo perossidasi dei tessuti stimolati con DNBS, in definitiva gli effetti degli oli alimentari sulla perdita di peso e sulla colite possono essere valutati sia con metodi macroscopici che microscopici.

Il vantaggio principale di questa materia rispetto al metodo esistente del destrano solfato di sodio è che il metodo DNBS è facile da eseguire, meno costoso e altamente riproducibile. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sull'IBD, come ad esempio quali sono i ruoli dello stress e della depressione nella recidiva dell'IBD, o quali sono i meccanismi alla base del danno intestinale e della riparazione Per l'installazione rettale di DNBS nei topi, iniziare collegando una siringa da un millilitro a un ago calibro 19. Dotato di un catetere in polietilene 50, aspirare quindi il DNBS appena preparato nel catetere.

Successivamente, applicare il gel lacrimale su un topo anestetizzato e applicare una leggera pressione con la punta delle dita sull'estremità posteriore dell'animale per rimuovere eventuali feci presenti nel colon distale. Ora iniettare una piccola quantità della soluzione DNBS per lubrificare il colon per facilitare l'inserimento mentre si inserisce delicatamente il catetere per via intrarettale di circa tre o quattro centimetri. Una volta posizionato il catetere, iniettare 100 microlitri di DNBS o un volume uguale di etanolo al 50% per gli animali di controllo.

Quindi posizionare la testa dell'animale verso il basso per 90 secondi per evitare la perdita dei reagenti. Dopo la somministrazione di DNBS, somministrare agli animali l'8% di acqua di saccarosio in soluzione salina allo 0,2% per prevenire la disidratazione durante la prima settimana. Monitorare attentamente l'animale ogni giorno per la perdita di peso, la disidratazione o l'angoscia per tutta la durata dell'esperimento, ovvero nel momento desiderato.

Dopo la provocazione DNBS, aprire la cavità addominale dell'animale soppresso e rimuovere l'intero intestino crasso. Quindi aprire l'intestino longitudinalmente. Le ulcere macroscopiche della mucosa devono essere osservate a circa due o tre centimetri prossimalmente dall'estremità distale del colon.

Raccogliere sezioni di 0,5 centimetri prossimali al sito del massimo danno macroscopico negli animali da esperimento e segmenti del colon dalle corrispondenti posizioni anatomiche degli animali di controllo. Quindi congelare a 0,5 centimetri da una sezione di controllo e trattata con NBS 1D in azoto liquido per la valutazione dell'attività della mielo perossidasi e fissare le altre sezioni in formina tamponata neutra al 10% durante la notte o in analisi istologica. La mattina successiva, lavare i tessuti fissati in formalina con etanolo al 70% e metterli in una cassetta da inviare a una struttura istologica per essere incorporati in paraffina e colorati con ematina ed eoina per il punteggio istologico.

Quindi valutare almeno tre sezioni di tessuto da ciascun animale al microscopio ottico per determinare i punteggi di danno istologico per ciascun gruppo Per testare l'attività della mielo perossidasi dei tessuti sfidati da DNBS. In primo luogo, omogeneizzare il controllo congelato a scatto e i tessuti sperimentali nel tampone di omogeneizzazione della mielo perossidasi per ottenere un segmento di colon di 50 milligrammi per millilitro di sospensione del tampone di omogeneizzazione. Quindi aliquotare la soluzione omogeneizzata in porzioni da un millilitro e centrifugarle per due minuti a 10.000 volte g e quattro gradi Celsius.

Successivamente, trasferire 100 microlitri di ciascuna aliquota in cuvette individuali e aggiungere 2,9 millilitri di PBS integrati con IDE, dicloridrato e perossido di idrogeno mescolando energicamente. Infine, misurare il tasso di assorbanza utilizzando uno spettrofotometro a 460 nanometri. A seguito di provocazione intrarettale con DNBS, come appena dimostrato.

Una significativa perdita di peso si osserva entro 48 ore nei ratti con olio di pesce o di colza e entro 72 ore nei ratti con olio di cartamo. La massima perdita di peso osservata si verifica a 48 ore nell'olio di pesce, nei ratti integrati e entro 72 ore nei ratti. Integrato con olio di colza o cartamo.

L'aumento di peso è ripreso dopo 72 ore e cinque giorni dopo la somministrazione di DNBS, i gruppi trattati con olio di pesce e olio di cartamo hanno mostrato un peso corporeo simile ai loro valori basali. I ratti di controllo integrati con gli oli alimentari e sfidati con etanolo intrarettale hanno guadagnato costantemente peso durante l'intero periodo di studio di cinque giorni. Il danno intestinale causato dalla DNBS può essere diffuso.

Tuttavia, l'area del danno massimo è generalmente localizzata ai sei centimetri distali del colon nei ratti e ai tre centimetri distali nei topi. Dopo un'attenta valutazione istologica, si osserva un'estesa lesione epiteliale, inclusa la formazione di ulcere, infiltrazione di neutrofili e linfociti, deplezione di muco ed edema. Sebbene questi segni istologici di infiammazione e danno tissutale siano evidenti in tutti e tre i gruppi integrati con oli alimentari dopo la sfida con DNBS, il danno più grave si osserva nel gruppo dell'olio di cartamo seguito dal gruppo dell'olio di canola.

Mentre i ratti nel gruppo dell'olio di pesce dimostrano un danno epiteliale minimo e una limitata infiltrazione di cellule infiammatorie nella mucosa cosa. Le differenze nel danno istologico tra i campioni possono essere quantificate per consentire un migliore confronto tra i gruppi. Il grafico illustra i punteggi di danno istologico per i tre gruppi di oli alimentari durante la colite DNBS.

Come si osserva nelle sezioni colorate h ed e, il gruppo integrato con olio di cartamo mostra la maggiore entità di danno, seguito dal gruppo dell'olio di canola. Mentre il gruppo dell'olio di pesce mostra il minor numero di danni, l'entità dell'infiltrato cellulare infiammatorio, in particolare dei neutrofili, può essere ulteriormente esaminata eseguendo un test dell'attività della mielo perossidasi. Come previsto dai punteggi di danno istologico.

La valutazione dell'attività della mielo perossidasi nel colon di ratto al quinto giorno dopo l'esposizione alla DNBS rivela un aumento dell'attività in tutti e tre i gruppi con la maggiore attività della mielo perossidasi osservata nel gruppo dell'olio di cartamo, seguito dal gruppo dell'olio di colza e dal gruppo dell'olio di pesce. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di anestetizzare leggermente i topi e di ottimizzare le dosi di DNBS dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie infiammatorie intestinali per esplorare i meccanismi che controllano l'infiammazione intestinale nei modelli animali di IBD.

Non dimenticare che lavorare con DNBS può essere estremamente pericoloso, quindi precauzioni come indumenti protettivi, guanti, occhiali e trattamenti per il viso dovrebbero essere sempre indossati durante la preparazione della soluzione.