Super-Resolution Imaging di vescicole neuronali Dense-core
2 luglio 2014
Si descrive come implementare fotoattivati microscopia localizzazione (PALM) a base di studi di vescicole in fissi, neuroni in coltura. I componenti chiave del nostro protocollo includono etichettatura vescicole con chimere fotoconvertibile, la raccolta di immagini crude scarsamente campionate con un sistema di microscopia super-risoluzione, e l'elaborazione delle immagini crude per produrre un'immagine super-risoluzione.
L'obiettivo generale della seguente procedura è ottenere immagini fluorescenti a super risoluzione che chiariscano aspetti importanti dell'organizzazione delle vescicole a una risoluzione altrimenti irraggiungibile mediante microscopia fluorescente. Questo risultato si ottiene innanzitutto trasfettando neuroni ippocampali con DNA codificante chimere fotoconvertibili di carico vescicolare. Nel secondo passaggio, vengono acquisite immagini grezze campionate in modo sparso mediante il sistema di microscopia a super risoluzione.
Successivamente, le immagini grezze vengono elaborate per produrre un'immagine a super risoluzione. Nell'ultima fase, i dati vengono quantificati per chiarire l'organizzazione delle vescicole. Infine, i profili lineari dell'intensità dei punti possono essere utilizzati per confrontare la separazione tra vescicole con l'ampiezza delle vescicole stesse, determinando così se le vescicole sono abbastanza vicine da formare un aggregato mediante questa procedura.
La microscopia di localizzazione attivata da foto a singolo colore, o PALM, può essere utilizzata per studiare l'organizzazione degli organelli nella maggior parte dei tipi di cellule in coltura. Per avviare il sistema di imaging a super risoluzione per l'acquisizione delle immagini, iniziare accendendo l'alimentazione della lampada ad arco. Successivamente, accendere il PC del sistema e gli interruttori dei componenti sul telecomando di alimentazione.
Passare su on dopo che il tablet di controllo del microscopio si è acceso, accendere il computer e avviare il software. Espandere la finestra dello stato di avvio per verificare che il sistema si stia caricando normalmente e selezionare l'opzione di avvio del sistema nella finestra di accesso. Per posizionare il campione per la visualizzazione, aprire i pannelli frontale e superiore dell'armadio di sicurezza per il laser e inclinare il braccio della luce trasmessa per accedere alla piastra e agli obiettivi.
Successivamente, applicare olio sull'obiettivo alpha plan APO Chromat da 100x per la riflessione totale interna, fluorescenza o obiettivo turf. Quindi selezionare un obiettivo a basso ingrandimento per la fase iniziale di messa a fuoco. Ora montare il campione sul palchetto ed elevare l'obiettivo verso il campione.
Monitorare la posizione della lente utilizzando la funzione X, Y, Z del tablet di controllo. Fermarsi quando la lente è approssimativamente a fuoco. Per visualizzare il campione e regolare finemente il fuoco.
Abbassare il braccio della luce e chiudere completamente i pannelli di accesso. Quindi, nella scheda "localizza", fare clic sul simbolo di espansione dell'oculare per visualizzare uno schema del percorso della luce, selezionare "trans on" e verificare che lo schema mostri la luce trasmessa dalla lampadina che incide sul campione. Guardare negli oculari e mettere a fuoco le cellule utilizzando il tablet di controllo come guida.
Quindi, per identificare le cellule che esprimono la DRA due, selezionare la luce riflessa e il filtro appropriato per visualizzare l'emissione verde da den due. Scansionare il vetrino utilizzando luce riflessa a bassa intensità finché non si trova una cellula sana e luminosa, quindi configurare il software per acquisire i dati palm. Passare alla scheda di acquisizione e utilizzare il gestore dell'esperimento per caricare la configurazione appropriata per l'acquisizione palm dell'esperimento.
Quando appare il menu a comparsa con la richiesta di attivare i laser, fare clic su sì. Quindi mettere a fuoco l'immagine della cellula sul piano della telecamera. Selezionare solo la traccia 488. Regolare i parametri di acquisizione, come il guadagno E-M-C-C-D, quindi scegliere l'acquisizione continua.
Successivamente, regolare la luminosità del display e muovere l'obiettivo finché l'immagine sullo schermo non sarà a fuoco. Per acquisire un'immagine convenzionale a campo largo, fare clic sul pulsante di acquisizione e salvare l'immagine. Per configurare l'illuminazione turf sul canale 488, selezionare l'opzione turf sul pulsante epi turf.
Per ottimizzare l'illuminazione basata sul metodo turf, selezionare l'acquisizione continua e regolare l'angolo del fascio di luce fino a quando lo sfondo non si scurisce improvvisamente e il campione può essere messo a fuoco in un solo piano. Passare al canale 561 spegnendo il laser a 405 nanometri. Impostare il guadagno E-M-C-C-D a circa 200 e il tempo di esposizione a circa 50 millisecondi.
Scegliere il filtro di emissione che trasmette nella regione rossa e impostare l'intensità del laser al circa 40%. Verificare nuovamente l'angolo del prisma per la traccia 561. Per ridurre il fondo, illuminare il campione fino a quando il segnale di fondo non si attenua. Utilizzare la traccia 561 attivando esclusivamente il laser 561.
Per raccogliere i dati palm, accendere il laser a 405 nanometri per la traccia 561 e regolare l'intensità del laser a 405 nanometri a circa lo 0,01%. Per monitorare l'immagine palm calcolata durante l'acquisizione, espandere il menu delle opzioni di elaborazione online e selezionare elaborazione palm in linea per elaborare con parametri predefiniti. Fare clic su avvia esperimento per iniziare l'acquisizione; durante la raccolta dati, monitorare visivamente la fotoconversione, aumentando l'intensità del laser fotoconvertente a 405 nanometri. Quando la fotoconversione inizia a diminuire.
Quando la conversione fotochimica non aumenta ulteriormente a seguito di un incremento dell'intensità del laser, fare clic su "termina il passaggio corrente". Per concludere l'esperimento, salvare il file. Per elaborare le immagini salvate, fare clic sulla scheda di elaborazione, espandere il menu del metodo ed espandere il sottomenu palm.
Scegliere nuovamente palma tra le quattro sottopzioni. Selezionare l'immagine appropriata in modo che appaia nella finestra di visualizzazione. Espandere i parametri del metodo e fare clic su seleziona per inserire l'immagine, espandere il campo delle impostazioni e scegliere predefinito per eseguire la ricerca dei picchi e la localizzazione con le opzioni predefinite.
Premere "Applica" nella scheda di elaborazione per calcolare l'immagine palmare, che apparirà in una scheda separata nella finestra di visualizzazione, al fine di filtrare eventuali componenti mal campionate nei dati. Utilizzare il teorema del campionamento di Nyquist e lo strumento "Rimuovi outlier palmari" per eliminare i picchi in regioni in cui la distanza media tra i picchi, indicata con d minuscolo, è troppo grande per risolvere una vescicola di diametro D maiuscolo. Nell'immagine palmare visualizzata, fare clic su "Seleziona" per inserire l'immagine e quindi su "Applica". La nuova immagine apparirà in una scheda separata nella finestra di visualizzazione per filtrare eventuali componenti della flora.Fours mal localizzate.
Vai alla scheda del filtro PAL, delimita la flora accettata. Quattro precisioni di localizzazione con una sigma inferiore a 35 nanometri. Per scegliere una modalità di visualizzazione dell'immagine PAL, vai alla scheda di rendering PAL, seleziona una risoluzione in pixel e la modalità di visualizzazione desiderata.
In questa immagine, un prodotto finale rappresentativo della palma derivato dall'imaging e dalla elaborazione di una vescicola a nucleo denso neuronale, o DCV, è mostrato in rosso. Le coordinate laterali delle localizzazioni rilevate sono indicate in bianco utilizzando la modalità di visualizzazione Centro, mentre l'immagine a super risoluzione della vescicola associata è mostrata mediante la modalità di visualizzazione Gaussiana. In questa seconda figura, sono riportate immagini analoghe in campo chiaro in verde e palm in rosso del soma e dei processi prossimali di un neurone ippocampale coltivato in vitro per otto giorni e che esprime tpa, un tracciatore di tipo due.
Caratteristiche importanti delle immagini includono l'estesa corrispondenza uno a uno e la sovrapposizione in giallo tra i puncta e le immagini convenzionali e palm. La dimensione significativamente più piccola dei puncta palm e la risoluzione occasionale di un singolo puncta widefield in più puncta palm. Qui, un'immagine palm di D cvs lungo una parte di un processo di un secondo neurone ippocampale che esprime tpa.
Viene mostrato DENDRA due. Si noti il piccolo diametro e l'aspetto omogeneo dei puntini e l'osservazione rara di puntini strettamente adiacenti, che rappresentano presunti aggregati di vescicole dense (DCV). In quest'ultima figura, viene delineato un semplice metodo quantitativo per determinare se due o più vescicole dense sono sufficientemente vicine da costituire un aggregato.
Vengono generati profili lineari delle intensità dei punti, come mostrato nei grafici, che possono quindi essere utilizzati per quantificare la separazione delle vescicole dense (DCV) e la larghezza delle DCV. Se la separazione supera significativamente la larghezza, le DCV non sono a contatto tra loro. Diversamente, se la separazione è approssimativamente uguale alla larghezza, le DCV potrebbero essere a contatto. In base a questi criteri, le DCV in questa immagine sono state classificate come non a contatto, mentre le DCV in questa immagine sono state classificate come a contatto seguendo questa procedura.
Altri metodi, come il palmo a due colori, possono essere utilizzati per studiare la localizzazione relativa di strutture distinte.
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per l'implementazione della microscopia a localizzazione attivata da luce (PALM) allo scopo di studiare l'organizzazione delle vescicole in neuroni coltivati fissati. Il metodo consente ai ricercatori di ottenere immagini fluorescenti a super-risoluzione che rivelano dettagli sull'organizzazione delle vescicole non visibili mediante microscopia fluorescente convenzionale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Microscopia a super-risoluzione
Sfondo
- Le vescicole svolgono un ruolo cruciale nella comunicazione neuronale.
- Comprendere l'organizzazione delle vescicole è essenziale per ottenere informazioni sulla funzione sinaptica.
- La microscopia convenzionale non dispone della risoluzione necessaria per studiare efficacemente la dinamica delle vescicole.
- La microscopia di localizzazione con attivazione fotochemica (PALM) offre una soluzione fornendo capacità di imaging a super-risoluzione.
Scopo dello studio
- Chiarire l'organizzazione delle vescicole nei neuroni.
- Confrontare la separazione e la larghezza delle vescicole utilizzando profili lineari dell'intensità dei puntini.
- Migliorare la comprensione dell'aggregazione vescicolare e delle sue implicazioni per la trasmissione sinaptica.
Metodi Utilizzati
- Trasfettare neuroni ippocampali con DNA che codifica per chimeri fotoconvertibili.
- Raccogliere immagini grezze campionate raramente mediante un sistema di microscopia a super risoluzione.
- Elaborare le immagini grezze per generare immagini a super risoluzione.
- Quantificare i dati per analizzare l'organizzazione delle vescicole.
Risultati principali
- Imaging riuscita dell'organizzazione delle vescicole a super-risoluzione.
- L'analisi quantitativa ha rivelato informazioni sul raggruppamento delle vescicole.
- I profili lineari hanno indicato relazioni tra la separazione delle vescicole e la loro larghezza.
- I risultati contribuiscono a una migliore comprensione dei meccanismi sinaptici.
Conclusioni
- Il protocollo basato su PALM è efficace per lo studio dell'organizzazione delle vescicole.
- L'imaging a super-risoluzione fornisce informazioni preziose sul funzionamento neuronale.
- Studi futuri possono basarsi su questa metodologia per esplorare ulteriormente la dinamica sinaptica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
L'imaging a super-risoluzione consente una caratterizzazione precisa di strutture subcellulari al di sotto del limite di diffrazione, colmando una lacuna fondamentale nella validazione degli bersagli nel contesto della scoperta di farmaci per le neuroscienze. Risolvendo l'organizzazione delle vescicole a nucleo denso su scala nanometrica, questo metodo supporta la riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli sinaptici e migliora la fiducia predittiva nell'identificazione dei composti promettenti. Fornisce un sistema rilevante per la patologia per valutare gli effetti dei composti sul traffico vescicolare e sui meccanismi di rilascio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche attraverso la visualizzazione dell'organizzazione delle vescicole con risoluzione <250 nm.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione dei rischi biologici mediante l'osservazione diretta degli stati di aggregazione delle vescicole a nucleo denso.
- Valore scientifico: Chiarisce il coinvolgimento di percorsi nei meccanismi di rilascio delle vescicole sinaptiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara modelli neuronali validati per lo screening ad alto contenuto di modulatori che influenzano la dinamica delle vescicole.
- Valore scientifico: Fornisce letture quantitative e riproducibili mediante l'analisi del profilo lineare dell'intensità e della separazione dei punti.
- Valore scientifico: Stabilisce la standardizzazione del saggio attraverso parametri definiti di fotoattivazione e acquisizione delle immagini.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Utilizza un sistema di neuroni ippocampali rilevante per la malattia, in linea con i fenotipi di disfunzione sinaptica.
- Valore scientifico: Offre un potenziale biomarcatore traslazionale attraverso metriche di separazione delle vescicole correlate alla probabilità di rilascio.
- Valore scientifico: Permette decisioni di avanzamento aggiustate per il rischio, quantificando gli effetti del composto sul raggruppamento delle vescicole.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo una validazione a super-risoluzione dell'interazione con il bersaglio in modelli neuronali prima dell'ottimizzazione del composto leader.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi di traffico delle vescicole mediante visualizzazione diretta a scala nanometrica.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso campionamento sparso e imaging a super-risoluzione di carico fotoconvertibile.
- Analisi: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti (distanza tra puntini, larghezza) per il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica mediante un modello di neuroni ippocampali rilevante per i disturbi della memoria e delle funzioni cognitive.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di super-risoluzione riutilizzabile per multipli bersagli associati alle vescicole in diversi programmi di neuroscienze.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nella segnalazione mediata da vescicole.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di fotoattivazione ed elaborazione delle immagini.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo evidenze strutturali della modulazione del bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione aggiustata per il rischio basata sui fenotipi di organizzazione delle vescicole.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a super-risoluzione e nella manipolazione di proteine fotoconvertibili.
- Necessita di un sistema di microscopia a super-risoluzione dotato di linee laser a 405 nm, 488 nm e 561 nm.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i parametri di acquisizione e di elaborazione delle immagini.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi modelli neuronali e tipi di carico delle vescicole.
- Comprende limitazioni pratiche, come il fotoblesamento e l'efficienza di marcatura, che influenzano la densità del segnale.
