L'uso di gas cromatografia per analizzare compositivo Variazioni degli acidi grassi nel fegato di ratto tessuto durante la gravidanza

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare la composizione degli acidi grassi del fegato. Ciò si ottiene pesando prima un campione di fegato e omogeneizzandolo. Il secondo passo consiste nell'estrarre tutti i lipidi dal campione di fegato omogeneizzato.

Successivamente, le singole classi lipidiche, come gli esteri del colesterolo, vengono separate mediante estrazione in fase solida. La fase finale è la rettifica e la derivatizzazione delle classi lipidiche in esteri metilici degli acidi grassi. In definitiva, la gascromatografia viene utilizzata per mostrare come la composizione degli acidi grassi dei tessuti possa cambiare in seguito a un intervento nutrizionale o essere influenzata da cambiamenti nello stato fisiologico come la gravidanza.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla composizione degli acidi grassi dei tessuti, può essere applicato anche ad altri tipi di campioni come olio, semi e alimenti. In generale, gli utenti che non conoscono questa tecnica possono avere difficoltà poiché alcune parti del protocollo richiedono destrezza manuale e hanno bisogno di pratica, come la raccolta ripetitiva delle fasi superiore e inferiore. A dimostrare la procedura saranno Hena, Fisk e Annette West, un tecnico e dottoranda del nostro laboratorio.

Per prima cosa tagliare circa 100 milligrammi di fegato congelato e pesare il tessuto. Metti il fazzoletto in un tubo di plastica in un secchiello per il ghiaccio e aggiungi 0,5 millilitri di cloruro di sodio ghiacciato allo 0,9%. Quindi omogeneizzare il tessuto e trasferirlo in una provetta di vetro con tappo a vite.

Utilizzare altri 0,3 millilitri di cloruro di sodio allo 0,9% per trasferire il tessuto rimanente nella provetta con tappo a vite di vetro. Successivamente, aggiungere 100 microgrammi di colesterolo heta dechen standard disciolto in due a uno, cloroformio secco a metanolo nella provetta, seguiti da altri cinque millilitri della stessa soluzione solvente contenente 50 milligrammi per litro di butilidrossitoluene. Dopo aver aggiunto un millilitro di cloruro di sodio molare, tappare la provetta e mescolare accuratamente il campione agitando il vortice fino a renderlo uniforme.

Quindi centrifugare il campione a 1000 volte G per 10 minuti con una bassa pausa a temperatura ambiente. Al termine, raccogliere la fase inferiore utilizzando un bicchiere oltre la sua pipetta e trasferirla in un nuovo tubo di vetro con tappo a vite. Quindi asciugare il campione sotto azoto a 40 gradi Celsius.

A questo punto, collegare il serbatoio SPE a una pompa a vuoto e posizionare una cartuccia SPE di silice amminica propilica sul serbatoio. Posizionare un nuovo tubo di vetro con tappo a vite etichettato TAG e CCE nel rack del serbatoio sotto la colonna per raccogliere la prima frazione. Sciogliere l'estratto lipidico totale in un millilitro di cloroformio secco e mescolare il campione mediante vortex.

Successivamente, trasferire il campione nella colonna utilizzando una pipetta in pasta di vetro e lasciare gocciolare il liquido nel tubo con tappo a vite per gravità. Quando il liquido non gocciola più dalla colonna, rimuovere il liquido rimanente con l'aspirapolvere. Successivamente, eluire la frazione TAG e CE lavando la colonna due volte con un millilitro di cloroformio secco sotto vuoto.

Quando tutto il liquido è uscito dalla colonna, essiccare la frazione TAG e CE sotto azoto a 40 gradi Celsius. Posizionare una nuova cartuccia SPE di silice amminica propilica sul serbatoio SPE e posizionare un tubo di vetro con tappo a vite nel vassoio del serbatoio sotto la cartuccia per raccogliere i rifiuti. Lavare la colonna con un millilitro di esano secco tre volte sotto vuoto.

Dopo aver spento l'aspirapolvere, lavare la colonna con un ultimo millilitro di esano H per gravità. Dopo aver sostituito il tubo di scarico con un nuovo tubo di vetro con tappo a vite etichettato ce, sciogliere il TAG essiccato e la frazione CE in un millilitro di esano secco e mescolare il campione mediante vortex. Quindi trasferire il campione nella colonna utilizzando un passaggio di vetro o una pipetta e lasciare che il liquido goccioli attraverso la colonna per gravità.

Quando il liquido non gocciola più dalla colonna, rimuovere il liquido rimanente sotto vuoto sotto vuoto. Lavare la colonna due volte con un millilitro di esano secco per eluire il CE e asciugare la frazione raccolta sotto azoto a 40 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di toluene secco alla frazione CE separata e mescolare il campione mediante vortex.

Aggiungere un millilitro di un reagente di metilazione precedentemente preparato al campione disciolto in toluene secco. Quindi tappare saldamente la provetta e mescolare Riscaldare delicatamente il campione per due ore a 50 gradi Celsius. Una volta che i campioni si sono raffreddati a temperatura ambiente, aggiungere un millilitro di soluzione neutralizzante.

Quindi, aggiungere uno di esano secco al campione Dopo la centrifugazione a vortice, centrifugare i campioni a 250 volte G per due minuti con una bassa pausa a temperatura ambiente. Al termine, raccogli la fase di fama superiore e trasferiscila in un nuovo tubo di vetro usa e getta senza tappo a vite. Asciugare il campione di fama raccolto sotto azoto a 40 gradi Celsius.

Dopo aver posizionato un tubo di scarico nel serbatoio SPE e un gel di silice, una cartuccia SPE sul serbatoio, lavare la colonna tre volte con un millilitro di esano secco sotto vuoto e un millilitro di esano secco per gravità. Dopo la rimozione dei lavaggi di scarto. Aggiungere un nuovo tubo di scarico nel serbatoio, quindi sciogliere il campione CE fame in un millilitro di esano secco.

Dopo aver miscelato il campione mediante vortex, trasferirlo sulla colonna utilizzando un passaggio di vetro o una pipetta. Una volta che il liquido è gocciolato attraverso la colonna per gravità, lavare la colonna tre volte con un millilitro di esano sotto vuoto. Quindi, rimuovere i lavaggi di scarto e posizionare un nuovo tubo con tappo a vite non scontato etichettato CE fame nel serbatoio.

Eluire la frazione di fama CE con due millilitri di 95 a cinque esano secco in etere etilico. Quindi essiccare la frazione raccolta sotto azoto a 40 gradi Celsius, sciogliere la frazione essiccata in 75 microlitri di esano secco e mescolare il campione mediante vortice dopo che il campione è stato miscelato mediante vortex. Trasferirlo in una fiala di campionamento automatico GC dopo aver ripetuto il passaggio precedente.

Analizzare il campione su un gascromatografo se il protocollo viene seguito correttamente. Come illustrato qui, si dovrebbe ottenere un cromatogramma con picchi chiari simmetrici, ben definiti e con un rumore di fondo minimo. Se si è verificata una contaminazione, il cromatogramma mostrerà picchi aggiuntivi e mostrerà picchi non simmetrici o asimmetrici, come mostrato qui.

La contaminazione da colesterolo libero si verificherà durante l'esecuzione fama derivata da CE a meno che il colesterolo non venga rimosso. L'uso di una miscela di calibrazione preparata consente l'identificazione della fama nel campione. La miscela di calibrazione viene eseguita utilizzando le stesse impostazioni dello strumento dei campioni, in modo che il cromatogramma possa essere confrontato con il campione e i picchi identificati in base ai tempi di ritenzione, come illustrato qui.

Il picco di 16 zeri è evidenziato qui per illustrare il confronto dei tempi di ritenzione dalla miscela di calibrazione nel cromatogramma superiore agli acidi grassi. Nella traccia del campione inferiore, che consente una corretta etichettatura dell'area del picco degli acidi grassi, viene utilizzata per calcolare la percentuale di acidi grassi specifici all'interno del totale. Una volta raccolti i dati, è utile ispezionarli per individuare eventuali valori anomali, come illustrato di seguito.

I campioni anomali possono quindi essere ulteriormente studiati e/o l'estrazione e/o l'analisi possono essere ripetute, se necessario. Come mostrato qui, la fama all'interno del fegato di ratto CE è descritta come una percentuale degli acidi grassi totali all'interno del fegato. Questi dati descrivono gli acidi grassi CE nel fegato di ratti vergini o gravidi alimentati per 20 giorni con una delle tre diverse diete.

L'analisi statistica che utilizza Innova a due fattori rivela effetti significativi della dieta e della gravidanza sulla proporzione di diversi acidi grassi, nonché interazioni significative tra dieta e gravidanza. A titolo illustrativo, il contenuto di acido onico del CE epatico nei ratti gravidi è più influenzato dalla dieta rispetto a quello delle femmine vergini. Questa tecnica consente di completare 20 campioni al giorno dall'inizio alla fine se eseguita correttamente.

Una volta padroneggiati, il dosaggio dei campioni può aumentare la produttività e raddoppiare la quantità lavorata in una settimana. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare la composizione degli acidi grassi delle singole classi di lipidi utilizzando l'estrazione in fase solida e la gascromatografia. Non dimenticare che lavorare con i solventi può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare in cappe chimiche e indossare DPI adeguati.