Name: Scalabile High Throughput Selection Da sintetici Biblioteche Antibody fagi-visualizzato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Scopri un metodo scalabile per isolare frammenti di anticorpi ad alta affinità da librerie di fagi visualizzati contro centinaia di antigeni in parallelo. Questa tecnica accelera la scoperta di anticorpi rinnovabili per l'ingegneria immunologica.

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Vorremmo riconoscere il Fondo comune NIH - proteine ​​reagenti acquisire il programma per finanziare lo sviluppo della selezione e caratterizzazione di anticorpi ricombinanti gasdotto anticorpo Network e la Fondazione canadese per l&#39;innovazione per l&#39;acquisto il finanziamento della piattaforma di selezione robotica.

<ol><li>Winter, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Man-made+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Man-made antibodies.</a> Nature. 349, 293-299 (1991).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nel condurre nelle selezioni di anticorpi in vitro, i due fattori determinanti principali di successo di selezione sono: 1) l&#39;isolamento di obiettivi antigeniche ben piegati, per la selezione su e 2) la disponibilità di una libreria di anticorpi diversità funzionale. In molti casi, la disponibilità di quantità sufficienti di ben piegata, proteina intera può essere limitante. Un approccio per superare questa limitazione è quello di utilizzare i domini individuati dall&#39;analisi bioinformatica <sup...

Con l&#39;inizio dell&#39;età post-genomica, la disponibilità dei reagenti vincolanti alta qualità per caratterizzare e modulare proteine ​​è essenziale per aprire nuove ricerche e vie terapeutiche. Anticorpi continuano ad essere fondamentale per entrambi i ricercatori accademici e industriali come la ricerca di base e gli strumenti diagnostici e potenziali terapie. Non sorprende, c&#39;è stata una crescita impressionante di imprese di sviluppo di anticorpi contratto, la maggior parte dei quali si basano su tecnologie ibridomi convenzionali per generare anticorpi personalizzati. Tuttavia, la selezione in vitro utilizzando le librerie di anticorpi fagi-visualizzato sta diventando una potente tecnologia alternativa in grado di offrire vantaggi unici e di successo in cui le tecnologie convenzionali possono affrontare limitazioni 1, 2. Alla luce della forte domanda per gli anticorpi di alta qualità come strumenti di ricerca, due sfide principali per la generazione di anticorpi rinnovabili sono: 1) la velocità di selezione e 2) av antigenevata disponibilità. Un certo numero di gruppi hanno ora descritto in gasdotti di selezione in vitro volti ad aumentare la produttività e il tasso di individuazione di anticorpi. Queste descrizioni particolare una varietà di approcci vitali che includono la selezione su o full-length obiettivi 3,4, o strutturalmente domini 5,6,7 correlato, utilizzando 6,8 o piatto a base di 3,4 schemi antigene immobilizzazione basati bead-. Inoltre, la crescente adozione di tecnologie di sintesi del gene 9 ha generazione sistematica antigene, in particolare di domini isolati, ragionevolmente conveniente e può potenzialmente alleviare la difficoltà di ottenere quantità sufficienti di purificato, antigeni full-length. Utilizzando le due tecnologie in tandem, una pipeline autonomo e generazione antigene scalabile e selezione anticorpo è stato ideato che consente l&#39;isolamento parallelo di anticorpi per grandi insiemi di domini antigeni espressi e facilitare lo sviluppo di reagenti per characterizing intere classi di proteine ​​strutturalmente o funzionalmente collegate. Verso questo obiettivo, una pipeline integrata che è stato sviluppato coppie in silico individuazione di domini antigene esprimibili, sintesi genica, espressione batterico high-throughput di antigeni e anticorpi selezioni scalabili fagi-visualizzato. Questo gasdotto richiede solo infrastrutture di base a disposizione la maggior parte dei laboratori di scienze della vita (comprese le biblioteche di anticorpi che sono sempre disponibili tramite licenza o trasferimento di materiale accordo), ma è anche suscettibile di automazione per l&#39;utilizzo su scala industriale. Utilizzando questo protocollo, è possibile generare centinaia di domini antigene-tag di affinità e di routine isolare altamente specifici frammenti anticorpali a molti di questi antigeni. Tecnologia di visualizzazione dei fagi ha dimostrato la compatibilità dimostrata con una vasta gamma di formati di reagenti affinità ricombinanti tra cui Fab, scFv, e domini autonomi Fv ecrescente schiera di piccoli &#39;quadri alternativi &quot;(progettati proteine ​​ankyrin ripetizione (DARPINS), fibronectina (FN), domini lipocalina e più 10). La discussione è limitata in questo esempio per l&#39;isolamento di frammenti anticorpali Fab, anche se si presume questi metodi possono essere adattati ad altri tipi di librerie. Grazie a questa tecnologia, Fabs con bassa affinità nanomolare piccolo, tagged domini proteici compresi settori fattore di trascrizione, i domini SH2,-RNA binding proteine ​​e altri sono stati selezionati con successo, molti dei quali legano la proteina full-length e sono funzionali in test immunologici quali immunofluorescenza , immunoprecipitazione ed immunoistochimica. È importante sottolineare che, cloni vincolanti ricombinanti sono completamente rinnovabili e possono essere rigenerati dalla espressione costruisce attraverso un&#39;offerta produzione batterica maggiore coerenza, riproducibilità ed economicità, giustificando così la spesa di convalida clone rigorosa. In questo protOcol e video di accompagnamento, sono dimostrati metodi di base per la selezione di anticorpi da librerie fagiche-visualizzato utilizzando domini antigene immobilizzati. Questo particolare metodo utilizza i domini di proteine ​​GST-tagged immobilizzati per adsorbimento passivo in micropiastra, anche se altri tag 11,12,13 e formati di selezione 13,14,2 sono stati utilizzati con successo. Considerazioni critiche per l&#39;impostazione e lo svolgimento delle selezioni con monitoraggio parallelo di parametri di selezione volti a identificare e isolare anticorpi monoclonali specificamente arricchiti per la convalida sono dettagliati.

<table><tbody><tr><td>MATERIALI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitatore per incubatore impilabile New Brunswick Innova44</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0004</td><td></td></tr><tr><td>Liquidatore Sistema di pipettaggio manuale da banco a 96 canali</td><td>Anachem Ltd Anachem Ltd</td><td>LIQ-96-200</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore per micropiastre</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific Centrifuga da banco Sorvall ST-40</td><td>Prodotto</td> <td>termico</td><td></td>75004525</tr><tr><td>ELx405 Select Lavatrici per micropiastre a pozzetti profondi</td><td>Biotek</td><td>ELX405USD</td><td></td></tr><tr><td>Robot per la selezione automatizzata dei fagi ad alta produttività personalizzata</td><td>S & P Robotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provetta Falcon conica in plastica: 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Provetta Falcon conica in plastica: 15 ml</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga Axygen da 1,7 ml</td><td>Corning</td><td>MCT-175-L-C</td><td></td></tr><tr><td>Piastra Maxisorp a 96 pozzetti/384 pozzetti</td><td>Sigma</td><td>M9410-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Corning Blocco a pozzetti profondi con fondo a V a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3960</td><td></td></tr><tr><td>Axygen Mini-provetta Micropiastra sterile a 96 pozzetti scatola blu</td><td>Corning</td><td>AXY-MTS-06-C-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola sigillante per piastre adesive traspirante</td><td>VWR</td><td>60941-084</td><td></td></tr><tr><td>REAGENTI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero</td><td></td>di catalogo</tr><tr><td>polietilenglicole</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>estratto di lievito</td><td>Bioshop</td><td>YEX401.1</td><td></td></tr><tr><td>bio-triptone</td><td>Bioshop</td><td>TRP402.1</td><td></td></tr><tr><td>Ammina N-Z</td><td>Sigma</td><td>C7290</td><td></td></tr><tr><td>glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>lattosio</td><td>Bioshop</td><td>LAC234</td><td></td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.500</td><td></td></tr><tr><td>carbenicillina</td><td>Bioshop</td><td>CAR544.10</td><td></td></tr><tr><td>kanamicina</td><td>Bioshop</td><td>KAN201.25</td><td></td></tr><tr><td>tetraciclina&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>TET701.25</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Bioshop</td><td></td><td>TWN510.500</td><td></td></tr><tr><td>fosfato di potassio monobasico</td><td>Bioshop</td><td>PPM302.1</td><td></td></tr><tr><td>fosfato di sodio bibasico</td><td>Anachemia</td><td>84486-440</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.10</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di potassio</td><td>Bioshop</td><td>POC308.1</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di calcio</td><td>Bioshop</td><td>CCL302.500</td><td></td></tr><tr><td>solfato di magnesio</td><td>EMD</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di magnesio</td><td>Bioshop</td><td>MAG510.500</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Bioshop</td><td>SOS513.500</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe DNA gel colorante</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>acido fosforico</td><td>Acros Organics</td><td>201140010</td><td></td></tr><tr><td>lisozima</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.25</td><td></td></tr><tr><td>benzonasi</td><td>Novagen</td><td>71205</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td>Bioshop</td><td>TRX506.500</td></tr><tr><td>cocktail di inibitori della proteasi compresse</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>resina Ni-NTA&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>1.000x fago helper (M13K07) stock (1013 fago per ml)</td><td>NEB</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>HRP coniugato anticorpo M13-specifico (anti-M13-HRP).</td><td>Substrato TMB GE Healthcare</td><td>27-9241-01</td><td></td></tr>: <tr><td>miscelare volumi uguali di TMB e substrato di perossidasi H2O2</td><td>KPL</td><td>50-76-00</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Biobasic</td><td>DD0056</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimerasi</td><td>Genscript</td><td>E00007</td><td></td></tr><tr><td>Esonucleasi</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>EZ0073X-EZ</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasi alcalina per gamberetti</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z-EZ</td><td></td></tr></tbody></table>

scalabile high throughput selection da sintetici biblioteche antibody fagi-visualizzato

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

La richiesta di anticorpi che soddisfano le esigenze di applicazioni sia di ricerca di base e clinica è alta e aumenterà notevolmente in futuro. Tuttavia, è evidente che le tecnologie tradizionali monoclonali non sono soli fino a questo compito. Questo ha portato allo sviluppo di metodi alternativi per soddisfare la domanda di alta qualità e reagenti di affinità rinnovabili a tutti gli elementi accessibili del proteoma. A questo fine, i metodi high throughput per condurre le selezioni da librerie di anticorpi sintetici fagi-visualizzati sono stati ideati per applicazioni con diversi antigeni e ottimizzato per la velocità rapida e di successo. Qui, un protocollo è descritto in dettaglio che illustra con video dimostrativo la selezione parallela di cloni Fab-fago da librerie alte diversità contro centinaia di obiettivi utilizzando sia un gestore di liquido 96 canali manuale o sistema robotico automatizzato. Usando questo protocollo, un singolo utente può generare centinaia di antigeni,selezionare anticorpi a loro in parallelo e validare vincolante entro 6-8 settimane di anticorpi. Evidenziate sono: i) un formato antigene praticabile, ii) caratterizzazione dell&#39;antigene preselezione, iii) passaggi critici che influenzano la scelta di specifiche e di alta cloni affinità, e iv) modi di efficacia selezione monitoraggio e tempestivamente clone anticorpo caratterizzazione. Con questo approccio, abbiamo ottenuto i frammenti di anticorpi sintetici (FAB) a molte classi di destinazione, tra cui i recettori single-pass di membrana, ormoni proteici secreti, e multi-dominio proteine ​​intracellulari. Questi frammenti sono facilmente convertiti in anticorpi full-length e sono stati convalidati per esibire elevata affinità e specificità. Inoltre, essi hanno dimostrato di essere funzionale in una varietà di immunodosaggi standard, tra cui Western blotting, ELISA, immunofluorescenza cellulari, immunoprecipitazione e saggi relativi. Questa metodologia accelerare la scoperta di anticorpi e infine ci avvicinano a realizzare l&#39;obiettivo of generazione rinnovabili, anticorpi di alta qualità al proteoma.

Il protocollo qui descritto è stato usato per isolare frammenti anticorpali ad una varietà di entrambi i domini antigene strutturalmente e funzionalmente correlati da combinatori fago visualizzato librerie Fab in parallelo. Questioni relative alla disponibilità di antigene possono essere aggirate, in molti casi, per l&#39;identificazione in silico di domini antigene esprimibili che sono adatti per la selezione di anticorpi 23. Accoppiando espressione dell&#39;antigene alla selezione anticorpo nello stesso lab...

Un metodo è descritto con accompagnamento visivo per lo svolgimento scalabili, selezioni elevati di throughput da combinatorie librerie di anticorpi sintetici fagi-mostrato contro centinaia di antigeni contemporaneamente. Usando questo approccio parallelo, abbiamo isolato frammenti anticorpali che presentano elevata affinità e specificità per diversi antigeni che sono funzionali in immunodosaggi standard.

Scalabile High Throughput Selection Da sintetici Biblioteche Antibody fagi-visualizzato

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

L'obiettivo generale di questa procedura scalabile è isolare cloni fagici Fab specifici e ad alta affinità da una libreria espressa su fago, utilizzando un approccio ad alto rendimento che permette la selezione parallela contro centinaia di domini antigenici. Questo viene ottenuto innanzitutto immobilizzando domini antigenici purificati in piastre a micropozzi. I passaggi successivi consistono nell'esporre, catturare, rilasciare e amplificare cloni fagici Fab che si legano specificamente all'antigene immobilizzato sulla micropiastra, in successivi cicli di selezione.Durante questo processo, l'efficacia della selezione viene monitorata mediante metodi in pool a ogni passaggio. L'ultimo passaggio consiste nella valutazione della specificità, affinità e/o attività dei cloni di fab isolati. In definitiva, frammenti di fab ad alta affinità e specifici contro un elevato numero di antigeni vengono isolati in parallelo, consentendo la generazione di anticorpi utili nell'analisi di intere classi di proteine strutturalmente o funzionalmente correlate.L'importanza di questo metodo risiede nel fatto che offre un'alternativa in grado di contribuire a superare le limitazioni e accelerare il ritm

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Immunologia e Infezioni

In questo video, dimostriamo la tecnica di visualizzazione dei fagi per isolare proteine pre-ingegnerizzate che esprimono proteine con un'elevata affinità per la proteina bersaglio.

Utilizzo del phage display per selezionare proteine con elevata affinità per una proteina target

Phage display è una tecnica potente per catturare proteine ​​o porzioni di proteine ​​che interagiscono con una molecola immobilizzata di interesse. Una volta presa una decisione del tipo di libreria di cDNA fagi per creare e lo schermo, il protocollo qui descritto consente la selezione affinità efficiente che porta alla identificazione di interattori.

Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante

I protocolli descritti consentono la costruzione, la caratterizzazione e la selezione (contro il bersaglio di scelta) di una libreria di "domainome" fatta da qualsiasi fonte di DNA. Questo risultato è ottenuto da una pipeline di ricerca che combina diverse tecnologie: phage display, un reporter pieghevole e sequenziamento di nuova generazione con uno strumento web per l'analisi dei dati.

Interactoma-Seq: Un protocollo per la costruzione della libreria Domainome, la convalida e la selezione di Phage Display e sequenziamento di nuova generazione

Questo protocollo descrive una procedura dettagliata per la costruzione di una libreria dei fagi-visualizzato anticorpo sintetico con diversità su misura. Gli anticorpi sintetici hanno vaste applicazioni dalla ricerca di base alla malattia diagnostica e terapeutica.

Costruzione del fago sintetico visualizzato favolosa biblioteca con diversità su misura

La creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine indotta chimicamente con l'affinità e la specificità desiderate per ogni piccolo ligando molecolare avrebbe molte applicazioni biologiche di rilevamento e attuazione. Qui, descriviamo un metodo efficiente e generalizzabile per l'ingegneria de novo di sistemi di dimerizzazione chimicamente indotti attraverso la selezione graduale di una libreria di anticorpi combinatori combinatori e di foragi.

Creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine altamente specifici indotta chimicamente mediante la selezione stepwise di phage di una biblioteca combinatoria di anticorpi a dominio singolo

Questo studio mirava a presentare una strategia per identificare le interazioni farmaco-peptidico. La strategia prevede la biopanning di peptidi corti che riconoscono farmaci basati su un biosensore QCM (Quartz-Crystal Microbalance), seguito da un'analisi bioinformatica per valutare quantitativamente le informazioni ottenute per il riconoscimento del farmaco e l'annotazione dei siti di legame farmacologico sulle proteine.

Strategia di biopanning e analisi bioinformatica ad alta produttività basata su biosensore per la convalida globale delle interazioni farmaco-proteina

L'ubiquitinazione è una modificazione post-traduzionale critica della proteina, la cui disregolazione è stata implicata in numerose malattie umane. Questo protocollo descrive in dettaglio come la visualizzazione dei fagi può essere utilizzata per isolare nuove varianti di ubiquitina in grado di legare e modulare l'attività delle ligasi E3 che controllano la specificità, l'efficienza e i modelli di ubiquitinazione.

Utilizzo di Phage Display per sviluppare modulatori varianti di ubiquitina per le ligasi E3

Questo protocollo descrive i passaggi essenziali per condurre campagne di selezione della superficie del lievito per arricchire le varianti proteiche che si legano a un antigene di interesse.

Ingegneria delle proteine mediante display superficiale del lievito

Descriviamo un metodo efficace per separare singolo filamento di DNA a doppio filamento di DNA e le molecole di RNA virale ambientale comunità. Gli acidi nucleici sono frazionate mediante cromatografia di idrossiapatite con concentrazioni crescenti di fosfati contenenti buffer. Questo metodo consente l'isolamento di tutti i tipi virali acidi nucleici da campioni ambientali.

Separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica del DNA e RNA da una Comunità Ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite

Questo metodo descrive l'utilizzo di Infrared sistema colorante di imaging based per il rilevamento di H1N1 in bronchioalveolar lavaggio (BAL) fluido di topi infettati ad una sensibilità elevata. Questa metodologia può essere eseguita in uno 96 - o 384-bene piastra, richiede &lt;10 volume pl di materiale di prova e ha il potenziale per lo screening concomitante di agenti patogeni multipli.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Scopri un metodo scalabile per isolare frammenti di anticorpi ad alta affinità da librerie di fagi visualizzati contro centinaia di antigeni in parallelo. Questa tecnica accelera la scoperta di anticorpi rinnovabili per l'ingegneria immunologica.

Scalabile High Throughput Selection Da sintetici Biblioteche Antibody fagi-visualizzato

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