Scalabile High Throughput Selection Da sintetici Biblioteche Antibody fagi-visualizzato

L'obiettivo generale di questa procedura scalabile è isolare cloni di fagi fab specifici e ad alta affinità da una libreria visualizzata di fagi utilizzando un approccio ad alto rendimento che consente la selezione parallela contro centinaia di domini bersaglio antigenici. Ciò si ottiene immobilizzando prima i domini antigenici purificati in piastre a micropozzetti. I prossimi passi sono l'esposizione, la cattura, il rilascio e l'amplificazione di cloni fagici fab che si legano specificamente all'antigene immobilizzato su micropiastra in cicli successivi di selezione.

Durante questo processo, l'efficacia della selezione viene monitorata utilizzando metodi aggregati in ogni fase. Il passo finale consiste nel valutare la specificità, l'affinità e/o l'attività dei cloni fab isolati. Infine, vengono isolati in parallelo specifici frammenti fab ad alta affinità contro un gran numero di antigeni, consentendo la generazione di anticorpi utili nell'analisi di intere classi di proteine strutturalmente o funzionalmente correlate.

L'importanza di questo metodo risiede nel fatto che offre un'alternativa che può aiutare a superare i limiti e accelerare il ritmo delle tecnologie convenzionali di sviluppo degli anticorpi in un laboratorio accademico o industriale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche convenzionali di sviluppo di anticorpi come l'ibridoma include che non richiede l'uso di animali. Può essere utilizzato praticamente per qualsiasi proteina, comprese le proteine tossiche e non immunogeniche.

Come vedremo, è facilmente parallelizzabile e alla fine produce DNA ricombinante rinnovabile che codifica un anticorpo ad alta affinità specifico per un particolare antigene e saggi immunologici funzionali e standard in appena sei-otto settimane. Data l'importanza degli anticorpi nella ricerca in biomedicina, abbiamo visto l'opportunità di adattare e scalare la generazione di antigeni e la selezione e l'identificazione degli anticorpi a un approccio ad alto rendimento, mantenendo l'accessibilità ai laboratori che variano sia per dimensioni che per risorse disponibili. La mattina del giorno della selezione dei fagi, scegli una singola colonia di cellule di e coli resistenti ai fagi T uno.

Aggiungilo a un millilitro di due terreni yt con tetraciclina a 50 microgrammi per millilitro. Lasciare che la colonia incubi agitandola a 200 giri/min in un agitatore orbitale da 2,5 centimetri. Una volta che la crescita della coltura è visivamente evidente, trasferire le cellule nel volume richiesto di terreno integrato con tetraciclina.

Deve esserci abbastanza per 100 microlitri per selezione di pozzetti, o circa 10 millilitri per 96. La piastra del pozzo espande le aliquote della coltura sia alla penicillina di carbonio che ai terreni integrati con canina. Queste colture garantiscono contro la pre-infezione nelle cellule da utilizzare per l'amplificazione.

Quando l'assorbanza ottica della coltura arriva a 0,4-0,8 a 595 nanometri. Dopo cinque-sette ore, le cellule sono pronte per essere applicate alle piastre dell'antigene. Affinché questo protocollo garantisca la copertura desiderata della libreria, preparare un numero sufficiente di piastre di antigene replicato e piastre di proteine di controllo non specifiche.

Utilizzando i dettagli del calcolo visualizzato, i dettagli sono forniti nel protocollo di testo. Dopo l'immobilizzazione notturna delle proteine bersaglio e di controllo aspecifiche, rimuovere la soluzione proteica dalla piastra. Aggiungere 200 microlitri di tampone bloccante e bloccare per un'ora agitando e lavare la piastra quattro volte prima di aggiungere la libreria di fagi mentre le cellule stanno crescendo.

Il giorno della selezione dei fagi, abbiamo pre-eliminato i cloni FAB visualizzati dalla libreria dei phage non specifici o del tag specifico trasferendo 100 microlitri di libreria di fagi alle piastre di selezione negative per l'aggiunta della selezione negativa. Rimuovere il fago legante il tag aggiungendo un eccesso di tag di affinità solubile. Per fare ciò, aggiungere una concentrazione finale di 10 micromolari di GST solubile a ciascuno.

Bene, quindi incubare le piastre per una o due ore su uno shaker a temperatura ambiente. Per preparare la piastra proteica target, aspirare la soluzione proteica dalla piastra, aggiungere 200 microlitri di tampone bloccante e bloccare per un'ora agitando e lavare quattro volte prima di aggiungere la libreria di fagi. Dopo l'incubazione, raccogliere la trappola fagica dalle piastre.

Utilizzando un gestore di liquidi a 96 canali, trasferire il fago supinato su piastre rivestite di antigene. Quindi incubare le piastre per una o due ore su uno shaker a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere il fago non legato lavando i pozzetti da otto a 15 volte utilizzando il tampone PT.

Questo può essere fatto manualmente o con una lavatrice automatica per lastre. Quindi, poco prima di aggiungere le cellule, rimuovere tutto il tampone di lavaggio in eccesso quando le cellule e le piastre dell'antigene sono pronte. Eluire il fago aggiungendo 100 microlitri di cellule in crescita a ciascun pozzetto e lasciare incubare le piastre a 37 gradi Celsius per mezz'ora.

Non ci si aspetta che i primi cicli di selezione producano un arricchimento significativo, ma la quantificazione dei titoli dei fagi in uscita può garantire l'illusione delle concentrazioni minime di fagi necessarie per il successo delle selezioni. Per fare ciò, un'aliquota di cellule può essere rimossa prima dell'aggiunta del fago helper al fine di restringere l'output del fago preparando e impiattando diluizioni seriali delle cellule su piastre di agar integrate con antibiotici. Dopo l'incubazione per mezz'ora, aggiungere M 13 K o sette fagi helper a ciascun pozzetto per una concentrazione di 10 miliardi di unità formanti colonie per millilitro.

Lasciare incubare le piastre per altri 45 minuti, questa volta agitando a 200 giri/min. Successivamente, trasferire le cellule in un blocco di pozzetti profondi 96 pozzetti con un fondo a V contenente 1,2 millilitri di terreno integrato da due YT per pozzetto. Lasciare incubare le piastre a pozzetti profondi a 37 gradi Celsius durante la notte con agitazione a 200 RPM il giorno successivo.

Pellettare i batteri facendo girare le piastre a 4.000 GS per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi da ciascuna piastra replicata trasferire volumi uguali di surnatante contenente il fago in una mini provetta. Micropiastra a 96 pozzetti blue box da utilizzare come input per i successivi cicli di selezione al fago raggruppato, aggiungere un 10° volume di 10 XPBT e mescolare per neutralizzare.

Ora ripeti il processo di selezione dalla libreria. Pre-clearance e incubazione antigenica dei fagi tre o quattro volte utilizzando fagi amplificati dal precedente ciclo di selezione. Eseguire questa operazione fino a quando non si osserva un arricchimento del legame del bersaglio rispetto al legame di proteine di controllo non specifiche da parte di Eliza Micro piastre a pozzetti codificate con due microgrammi per millilitro di antigene o proteina di controllo come precedentemente descritto nella pre-clearance della libreria e nell'incubazione del fago dell'antigene vengono quindi bloccate e lavate come prima per l'antigene bloccato e lavato e le piastre rivestite di proteine di controllo, applicare 100 microlitri di phage supt diluito ai pozzetti e lasciare incubare le piastre agitando per 15 minuti a temperatura ambiente Dopo l'incubazione, lavare le piastre otto volte con tampone PT.

Quindi, dopo i lavaggi, aggiungere 100 microlitri di anticorpo anti M 13 HRP a una luzione da uno a 5.000 in PBT a ciascun pozzetto incubare per mezz'ora per consentire il legame degli anticorpi al fago legato all'antigene. Quindi lavare le piastre con tampone PT sei volte e altre due volte con la preparazione PBS diretta, mescolare e applicare 100 microlitri di substrato TMB uno a uno su ciascuno dei pozzetti. Lascia che questo reagisca per 5-15 minuti, interrompendo le reazioni quando c'è un cambiamento di colore significativo.

Fermare le reazioni aggiungendo 100 microlitri di acido fosforico molare. Ora leggete l'assorbanza nei pozzetti a 450 nanometri e confrontate i segnali di legame del bersaglio con i segnali di legame delle proteine di controllo dopo l'arricchimento. I singoli cloni possono essere isolati e caratterizzati mediante sequenziamento del fago, conversione del DNA del fago legato alla fab libera e valutazione del legame diretto al bersaglio utilizzando il clonale FabuLisa, come spiegato nella parte testuale del protocollo.

Per i laboratori in cui è richiesta una maggiore produttività, questa metodologia può essere scalata e automatizzata. Con questo obiettivo in mente, è stata sviluppata una robotica personalizzata in grado di espandere la capacità di selezione automatizzando tutti gli aspetti della procedura, tra cui il blocco, il fago, il legame e l'eluciano e altro ancora. Un approccio per ottenere l'antigene da utilizzare nelle selezioni di anticorpi è l'uso di tecnologie geniche sintetiche per ottenere costrutti per l'espressione di domini proteici isolati.

Nella maggior parte dei casi, ciò consente l'espressione ad alto rendimento e l'isolamento di quantità adeguate di antigene purificato sufficientemente puro per la selezione. Durante le fasi successive del processo di selezione, le concentrazioni di fagi eluse e l'arricchimento del fago specificamente legato all'antigene è stato monitorato mediante titolazione dei fagi, come mostrato in precedenza, o monitorato con pool di fagi. In un test ELA, un rapporto di legame maggiore di due indica generalmente la presenza di specifici cloni di legame.

Al contrario, un rapporto più basso può aiutare a determinare la causa di un errore di selezione. La caratterizzazione del legame del clone utilizzando un saggio amminico colorimetrico consente di confrontare il fago fab legante o fab con l'antigene immobilizzato rispetto alla proteina di controllo negativo legante, ottenendo così una misura di specificità durante il ridimensionamento e l'automazione delle selezioni con unità robotiche di manipolazione dei liquidi. L'uso di cromofori assorbenti può aiutare a rilevare quando canali specifici nella fluidica sono ostruiti o hanno perso la loro tenuta, con conseguente erogazione di volume parziale, e aiutare nella risoluzione dei problemi durante l'ottimizzazione delle procedure di lavaggio, l'uso di cloni leganti noti assicura che il legame target venga mantenuto mentre il legame di fondo viene rimosso durante i lavaggi.

Inoltre, protocolli di decontaminazione efficaci garantiscono l'assenza di contaminazione incrociata da cicli di selezione successivi o da diverse procedure di selezione e si raccomanda che ulteriori parametri di risoluzione dei problemi siano esaminati nel protocollo di testo. Scalando questa tecnica per applicazioni industriali, speriamo di consentire ai ricercatori di esplorare intere classi di proteine strutturalmente o funzionalmente correlate accelerando la selezione e l'identificazione di anticorpi rinnovabili ad alta affinità con l'obiettivo finale di ottenere la massima copertura del proteoma.