Transgenici Roditore Assay per quantificare Maschio cellule germinali Mutant Frequenza

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la frequenza di mutazioni indotte in un gene marcatore isolato da cellule germinali di topi maschi transgenici, a seguito di esposizione a un agente mutageno chimico o fisico. Ciò viene ottenuto esponendo innanzitutto topi maschi a un presunto agente mutageno per le cellule germinali. Il secondo passaggio consiste nel raccogliere le cellule germinali dopo che hanno completato le fasi desiderate della spermatogenesi.

Successivamente, il DNA contenente il transgene di segnalazione della mutazione viene recuperato dalle cellule germinali. L'ultimo passaggio consiste nell'inserire i geni reporter recuperati all'interno di particelle di fago lambda. Infine, un saggio di selezione positiva in vitro viene utilizzato per misurare la proporzione di geni reporter recuperati dalle cellule germinali che sono stati mutati.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il test del locus specifico o il test domino little, consiste nel fatto che le mutazioni vengono misurate direttamente nelle cellule germinali anziché valutando la progenie mutante. È possibile analizzare un elevato numero di cellule germinali provenienti da un singolo maschio, aumentando così la sensibilità del saggio rispetto ai metodi tradizionali, riducendo al contempo in modo significativo il numero di animali, le risorse e il tempo necessari. Questo metodo può affrontare questioni fondamentali nel campo della tossicologia genetica e della mutagenesi, come l'identificazione di agenti mutageni per le cellule germinali e la chiarificazione dei loro meccanismi d'azione.

Sebbene descriviamo il metodo per il modello murino Muta, esso può essere facilmente applicato ad altri sistemi di roditori transgenici che portano vettori di segnalazione delle mutazioni da fago batterico. Inoltre, mentre il metodo descrive il processo per le cellule germinali maschili, esso ha un'applicabilità generale ai tessuti somatici e, cosa importante, è coperto da una linea guida per test armonizzata a livello internazionale pubblicata dall'OCSE. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà con i tempi della parte in vitro del saggio, poiché diversi passaggi prevedono lunghi periodi di attesa.

I passaggi devono essere attentamente pianificati e coordinati per completare questo metodo in modo tempestivo. A dimostrare la procedura saranno John Gingrich e Linda Soper, biologi nel mio laboratorio, prima di iniziare l'esperimento. Vanno selezionate tre variabili sperimentali fondamentali: il tempo di somministrazione, il tempo di campionamento e la popolazione di cellule germinali raccolta.

Queste variabili possono essere regolate per esaminare gli effetti dell'esposizione in diversi tipi cellulari germinali e in varie fasi della spermatogenesi. Per iniziare questa procedura, distribuire casualmente topi maschi transgenici di età compresa tra otto e dodici settimane in un gruppo di controllo e gruppi trattati, con un minimo di cinque animali per gruppo. Successivamente, trattare i topi con un composto in prova e un controllo appropriato mediante una via di esposizione adeguata per il tempo di somministrazione selezionato.

Successivamente, scegliere il tempo di campionamento appropriato in base al tipo cellulare metagenico dello sperma di interesse. Dopo che è trascorso il tempo di campionamento, eutanasia i topi mediante dislocazione cervicale sotto anestesia con isoflurano. Per rimuovere i testicoli, praticare un'incisione nell'addome e individuare il cuscinetto adiposo epidermico.

Estrarre con attenzione il cuscinetto adiposo per far uscire i testicoli e l'epididimo dallo scroto. Quindi escindere la coda dell'epididimo. Congelare la coda dell'epididimo in azoto liquido e conservare a meno 80 gradi Celsius per un uso successivo.

Quando si è pronti per processare lo sperma di Cota, scongelare l'epididimo di Cota su ghiaccio e quindi trasferire il coda scongelato in una piastra di Petri. Successivamente, utilizzare un bisturi o una lametta per trinciare accuratamente l'epididimo; pipettare 700 microlitri di DPBS a temperatura ambiente nella piastra di Petri. Quindi, utilizzare una punta pipetta da 1000 microlitri con orifizio largo per liberare gli spermatozoi dal coda, aspirando e rilasciando la sospensione circa 10 volte o fino a quando il DPBS diventa torbido per la presenza di spermatozoi. Filtrare la sospensione spermatica attraverso un filtro in maglia di acciaio inossidabile in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e quindi centrifugare il tubo a 11.000 × g per tre minuti.

Versare con attenzione il soprannatante fuori dal tubo senza disturbare il pellet. Quindi aggiungere un millilitro di soluzione fredda di salino citrato di sodio 1x e vortexare il tubo fino a quando il pellet non è completamente risospeso. Successivamente, aggiungere 15 microlitri di SDS al 10% al tubo e agitare vigorosamente per 30 secondi per rompere le cellule non spermatiche.

Quindi centrifugare il tubo a 11.000 ×g per due minuti. Dopo la centrifugazione, versare con attenzione il soprannatante fuori dal tubo e aggiungere 940 microlitri di citrato di sodio salino freddo 0,2 x, quindi vortexare nuovamente il tubo fino a quando il pellet non viene risospeso. Aggiungere 120 microlitri di beta-mercaptoetanolo, 100 microlitri di SDS al 10%, 20 microlitri di EDTA 0,5 moli, pH otto e 20 microlitri di 60 milligrammi per millilitro.

Proteasi K allo sperma risospeso. Mescolare bene la soluzione, quindi posizionare il tubo su un rotatore per tutta la notte a 37 gradi Celsius per la digestione. Estrarre il DNA dallo sperma coda seguendo i passaggi descritti nel protocollo testuale per eseguire un'estrazione con fenolo-cloroformio dopo l'estrazione.

Sciogliere il precipitato di DNA in 40-100 microlitri di tampone tris EDTA a pH otto e conservare a quattro gradi Celsius. Attendere diversi giorni perché il DNA si sciolga completamente prima di procedere con il passaggio successivo. Prima di eseguire il saggio di mutazione LAX Z, preparare e sterilizzare in autoclave una quantità sufficiente di agarosio inferiore in base al numero di campioni da processare.

Quindi, in condizioni asettiche, versare l'agar in piastre di Petri da 90 millimetri e lasciare solidificare l'agar in un tubo da 50 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di brodo LB, 100 microlitri di soluzione di maltosio al 20%, 25 microlitri di ampicillina a 20 milligrammi per millilitro e 20 microlitri di soluzione a 5 milligrammi per millilitro. Successivamente, inoculare il tubo con *E. coli* LAX Z negativo per GAL e negativo per e, e coltivare per tutta la notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 240 RPM. Il primo giorno del saggio, sotto-colture le cellule preparando un'opportuna diluizione 1:100 della coltura notturna in LB fresco senza antibiotici.

Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con agitazione a 240 giri al minuto per circa tre ore o fino a quando l'OD 600 raggiunge il valore di uno. Una volta raggiunto l'OD 600 di uno, dividere la sospensione cellulare in modo uniforme in provette da 50 millilitri e centrifugare a 1.300 ×g a 15 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere quindi il soprannatante e risospendere le cellule in metà del volume originale di LB contenente solfato di magnesio 10 millimolare.

Mettere da parte le cellule mentre si preparano gli altri reagenti. Incapsulare il DNA in particelle di fago Lambda prelevando innanzitutto con una pipetta. Quattro microlitri del DNA estratto dallo sperma della coda, utilizzando una pipetta con punta larga, in un tubo da 1,5 millilitro.

Scongelare il primo tubo di un kit di estratto per l'impacchettamento di fagi a temperatura ambiente, quindi pipettare 4,8 microlitri di estratto di impacchettamento nel tubo contenente il DNA. Successivamente, mescolare delicatamente la soluzione con la punta della pipetta e incubare il tubo in un bagno termostatato a 30 gradi Celsius per 1,5 ore. Successivamente, scongelare il secondo tubo di estratto per l'impacchettamento e, nuovamente, pipettare 4,8 microlitri nel tubo contenente il DNA.

Agitare delicatamente la soluzione con la punta della pipetta, quindi incubare il tubo in un bagno termico a 30 gradi Celsius per 1,5 ore. Ri-sospendere le particelle fagiche impacchettate in 500 microlitri di tampone salino contenente magnesio, e posizionare i tubi su un agitatore rotante per 30 minuti a 20 giri al minuto. Dopo la rotazione, vortexare brevemente i campioni e quindi centrifugarli a 11.000 ×g per 30 secondi per raccogliere i campioni sul fondo del tubo.

Le particelle fagiche sono ora pronte per l'infezione. Successivamente, preparare otto millilitri di agarosio superiore per ogni piastra di titolazione e per ogni piastra mutante. Mantenere l'agarosio superiore a 50 gradi Celsius prima di aggiungere il solfato di magnesio alla concentrazione di 10 millimolari e aggiungere tre grammi per litro dell'agente selettivo PGAL per la selezione dei mutanti.

Utilizzare solo l'estrattore superiore prima dell'infezione delle cellule. Etichettare due provette da 50 millilitri per ogni campione, etichettandone una come mutante e una come titolo. Quindi etichettare otto piastre con estrattore per ogni campione, quattro come mutanti e quattro come titolo.

Successivamente, pipettare due millilitri di cellule risospese in ciascun tubo da 50 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di particelle fagiche confezionate in un tubo da 50 millilitri etichettato come mutante. Mescolare delicatamente il tubo e lasciare che le particelle fagiche infettino le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione di 30 minuti, vortexare brevemente le cellule infette e quindi trasferire 15 microlitri delle cellule infette nel corrispondente tubo da 50 millilitri per la titolazione. Aggiungere 30 millilitri di agarosio per titolazione alla temperatura di 50 gradi Celsius nel tubo da 50 millilitri per la titolazione. Distribuire immediatamente la miscela di agarosio e cellule tra le quattro piastre per titolazione.

Assicurarsi che siano stati aggiunti tre grammi per litro di P gal al selezionatore di mutanti a 50 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 30 millilitri del selezionatore di mutanti contenente PGAL al tubo mutante da 50 millilitri. Quindi distribuire immediatamente la miscela di selezionatore e cellule sulle quattro piastre mutanti.

Lasciare solidificare le piastre, quindi capovolgerle e incubarle a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Dopo l'incubazione notturna, contare il numero di placche sulle piastre mutant e su quelle di titolazione. Successivamente, stimare la frequenza dei mutant dividendo il numero totale di placche mutant contate, rilevate sulle quattro piastre mutant, per il numero stimato totale di unità formanti placca nel volume totale di cellule infette determinato a partire dalle piastre di titolazione.

Un saggio tipico di mutazione nelle cellule germinali di roditore transgenico produce un numero molto ridotto di placche sulle piastre mutanti, specialmente nei gruppi di dose controllo. D'altro canto, vengono rilevate centinaia di placche sulle piastre di titolazione. L'esposizione di topi mutt maschi a una singola dose orale acuta di 0,25, 50 e 100 milligrammi per chilogrammo di ENU, seguita da un tempo di campionamento di 70 giorni, ha permesso la misurazione degli eventi mutazionali nelle cellule staminali dello spermatogonio.

La bassa dose di ENU ha indotto un aumento di 2,6 volte della frequenza di mutanti rispetto ai controlli, e la dose massima ha prodotto un aumento di 4,4 volte. Nella progettazione di esperimenti che utilizzano questa procedura, è importante considerare attentamente i tempi. Il ciclo metagenico dello sperma, il momento dell'amministrazione, il momento del campionamento e il tipo di cellule raccolte devono essere selezionati con cura al fine di osservare gli effetti derivanti dal tipo cellulare metagenico dello sperma desiderato.

Al termine di questa procedura, è possibile eseguire il sequenziamento del DNA sui fagi mutanti per caratterizzare le mutazioni e identificare i mutanti che potrebbero derivare da eventi di espansione clonale. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della tossicologia genetica per identificare mutageni che potrebbero colpire la linea germinale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come determinare la frequenza mutante indotta nelle cellule germinali o nei topi maschi transgenici esposti a un mutageno.

Questo saggio ha potenziali applicazioni nei test regolatori per mutageni delle cellule germinali e in indagini meccanicistiche più mirate.