Purificazione non-cromatografico di polipeptidi di elastina ricombinante simili e le loro fusioni con Peptidi e Proteine ​​da Escherichia coli

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di purificare i polipeptidi ricombinanti simili all'elastina da e coli mediante cicli di transizione inversa. Ciò si ottiene raccogliendo prima il lisato dalle cellule di e coli che hanno espresso elastina ricombinante come il polipeptide e rimuovendo i detriti cellulari insolubili mediante centrifugazione. Il secondo passo consiste nel rimuovere i contaminanti solubili inducendo la transizione polipeptidica simile all'elastina con l'aggiunta di sale o calore.

Quindi raccogliendo l'elastina come il rivestimento polipeptidico mediante centrifugazione e scartando il surnatante. Questo passaggio è definito hot spin. Successivamente, la soluzione polipeptidica simile all'elastina risospesa viene centrifugata per rimuovere i contaminanti insolubili.

Il polipeptide solubile simile all'elastina nel surnatante viene trattenuto e il pellet viene scartato. Questo passaggio è definito centrifuga a freddo, cicli ripetuti di centrifughe calde e fredde fino a raggiungere una purezza soddisfacente del polipeptide simile all'elastina. In definitiva, il ciclo di transizione inversa produce prodotti polipeptidici simili all'elastina pura che possono essere caratterizzati per l'uso in una varietà di applicazioni biomediche.

I polipeptidi simili all'elastina purificati con questa tecnica hanno una serie di applicazioni utili, tra cui il biorilevamento, l'ingegneria tissutale e la somministrazione di farmaci, in cui la temperatura di transizione e l'architettura del biopolimero del polipeptide simile all'elastina possono essere regolate in modo specifico per ogni applicazione. Per iniziare, esprimere il plasmide codificante ELP desiderato in e coli utilizzando le condizioni descritte nel protocollo di testo allegato. Dopo aver agitato una coltura da un litro in un'incubatrice per 24 ore a 37 gradi Celsius, trasferire la coltura in una bottiglia da centrifuga da un litro, quindi centrifugare la bottiglia a 2000 Gs per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi, scartare il surnatante e risus. Sospendere il pellet in acqua PBS o altro tampone desiderato fino a un volume totale di 45 millilitri. Quindi ha trasferito la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri.

Posizionare la sospensione cellulare sul ghiaccio e, una volta raffreddata, sonicare per un totale di nove minuti in cicli di 10 secondi di accensione e 20 secondi di spegnimento. Con una potenza di uscita di 85 watt. Lasciare raffreddare il campione su ghiaccio per circa 10 minuti dopo il primo ciclo di sonicazione, quindi ripetere il ciclo di sonicazione di nove minuti.

Trasferire il lisato in una provetta da centrifuga a fondo tondo da 50 millilitri. Quindi aggiungere due millilitri di polietilene al 10% in peso per volume per ogni litro di coltura e agitare la provetta per mescolarla successivamente, centrifugare la provetta a 16.000 GS per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga pulita da 50 millilitri a fondo tondo e scartare il pellet.

Aggiungere cloruro di sodio cristallino al campione per indurre la transizione ELP. Una volta che il sale si è dissolto, la soluzione diventerà torbida, il che indica la separazione di fase dell'ELP dalla soluzione. Quindi pellettare l'ELP centrifugando il campione a 16.000 GS per 10 minuti.

A temperatura ambiente, il pellet ELP può inizialmente apparire opaco, scartare il surnatante e quindi aggiungere da uno a cinque millilitri del tampone desiderato dopo il raffreddamento. Il pellet ELP può apparire traslucido e di colore marrone. Resus sospendere il pellet pipettando o ruotando il tubo a quattro gradi Celsius.

Pipettare quindi un millilitro di aliquote della soluzione ELP risospesa in provette pulite da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare le provette a 16.000 GS per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi trasferire il surnatante in una provetta pulita e gettare i pellet.

Indurre la transizione ELP con l'aggiunta di cloruro di sodio. Se l'ELP ha un'elevata temperatura di transizione che non può essere indotta con il solo sale, incubare il campione su un blocco termico per 15 minuti a una temperatura superiore alla temperatura di transizione ELP. Quindi centrifugare il campione a 16.000 GS per 10 minuti a una temperatura superiore alla temperatura utilizzata per la fase di transizione ELP.

Scartare il surnatante e risospendere il pellet ELP in 500-750 microlitri di tampone desiderato pipettando o ruotando la provetta a quattro gradi Celsius fino a quando il pellet non viene risolubilizzato. Quindi, centrifugare il campione a 16.000 GS per 10 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare eventuali contaminanti insolubili. Quindi trasferire la bocchetta in un tubo pulito e gettare il pellet Ripetere il ciclo di transizione inversa fino a quando non si osserva alcun pellet contaminante.

Ciò richiede in genere da due a cinque cicli. Preparare una serie di diluizioni di soluzioni ELP in PBS o in un altro tampone desiderato. Quindi utilizzare uno spettrofotometro UV v a temperatura controllata per misurare la densità ottica a 350 nanometri in un intervallo di temperature, riscaldando il campione a una velocità di un grado Celsius al minuto.

Se non si osserva alcun aumento della densità ottica, la temperatura di transizione può superare il limite di temperatura superiore. Quindi, misurare la diminuzione della densità ottica nello stesso intervallo di temperature a una velocità di raffreddamento di un grado Celsius al minuto. Per verificare la reversibilità del grafico di transizione ELP, la densità ottica rispetto alla temperatura, determinare la temperatura di transizione dell'omopolimero ELP.

Identificando il punto di flesso su questo profilo di torbidità, il successo della purificazione degli LP è confermato dalla pagina SDS, come si può vedere qui. Il numero di contaminanti è molto maggiore nel lisato iniziale di e coli rispetto al campione dopo un ciclo di transizione inversa. La temperatura di transizione ELP è caratterizzata da torbidità a temperatura programmata per un omopolimero ELP.

Il profilo di torbidità mostra un singolo forte aumento della densità ottica, che definisce la temperatura di transizione a una data concentrazione. La natura reversibile della transizione ELP è confermata da una scansione di torbidità di raffreddamento. I copolimeri a blocco di stampi ELP mostrano un profilo di torbidità più complesso rispetto agli LP omopolimerici.

È quindi possibile effettuare misurazioni dinamiche della diffusione della luce per confermare il comportamento di questi LP dedotto dal file del profilo di torbidità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare i polipeptidi simili all'elastina ricombinante da e coli utilizzando il ciclo di transizione inversa. No, no, no, no, no.