Name: High Yield Purificazione di Plasmodium falciparum Merozoiti Per luso in opsonizzante anticorpo saggi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Scopri la purificazione ad alto rendimento di merozoiti di Plasmodium falciparum per saggi di opsonizzazione anticorpale. Questo metodo consente di quantificare la fagocitosi dipendente da opsonizzazione mediante citometria a flusso.

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Gli autori desiderano ringraziare i bambini ei donatori di plasma adulti, e il personale della Papua Nuova Guinea Institute of Medical Research. Gli autori desiderano ringraziare Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie, Danny Wilson W, Ivo Mueller e Diana S Hansen per il loro contributo allo sviluppo di questa tecnica, e ringraziare la Croce Rossa australiana per sangue e siero confezioni. Questo lavoro è stato reso possibile attraverso Victorian Government Stato operativo infrastruttura di supporto e governo australiano NHMRC IRIISS. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Health and Medical Research Council concede # 1031212 e # 637406, e National Institutes of Health di sovvenzione # AI089686.

NOTA: Tutte le fasi, oltre a centrifugazione e citometria a flusso, devono essere eseguiti entro una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità. Assicurarsi che siano prese opportune precauzioni per quanto riguarda la manipolazione dei campioni umani. Il test è molto sensibile per piccole quantità di plasma. Le diluizioni previste sono ottimali per la risoluzione delle risposte che vanno 5-78% con il plasma dai bambini semi-immuni da Papua Nuova Guinea (PNG). La diluizione ottimale può variare con i set di plasma in fase di test, e perciò si raccomanda che il plasma essere titolato per determinare le condizioni sperimentali per ciascuna applicazione. Garantire l&#39;inserimento di due controlli negativi cellule THP-1 con merozoites in assenza di plasma; e cellule THP-1 con merozoites opsonizzati con un pool di plasma da malaria persone ingenue. Ciò consentirà di controllo per merozoite aderenza alla cellule THP-1 e per consentire rigorosa citometria a flusso gating di eventi fagocitosi. L&#39;uso di campioni di plasma PNG eraapprovato dal Comitato di Medical Research Advisory, Papua Nuova Guinea Ministero della Salute, il Walter e Eliza Corridoio Comitato di Etica umano della ricerca (numero di progetto 04/04). Il consenso scritto è stato ottenuto da genitori / tutori di tutti i partecipanti. 1. THP-1 Cultura <ol><li> Mantenere la linea cellulare monocitica umana THP-1 in terreno RPMI-1640 integrato con siero di vitello fetale al 10% (FCS) e 55 mM 2-mercapthoethanol (THP-1 medium) ed a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5%. </li><li> Mantenere le cellule ad una densità inferiore a 5 x 10 5 cellule / ml. NOTA: Overgrowth si tradurrà in differenziamento in cellule aderenti e down-regulation dei recettori Fc. Una volta che le cellule sono state fatte passare circa 10 volte, scongelare un nuovo flacone di mantenere fenotipo cellulare. </li></ol> 2. Preparazione del campione anticorpo e diluizione <ol><li> Il calore inattivare il plasma da testare e plasma di controllo della malaria-naïve incubando a 56 °; C per 30 min </li><li> Serialmente diluire campioni di plasma a 1/2, 000 in THP-1 medium. </li><li> Conservare il plasma diluito a -20 ° C. </li></ol> 3. Cultura altamente sincronizzata P. falciparum NOTA: La linea parassita-GFP che esprimono D10-PfPHG 27 è stato utilizzato per la sua 48 ore ciclo di vita che aiuta la sincronizzazione dei parassiti e la tempistica controllata di E64 aggiunta. Inoltre, perché questa linea esprime GFP nel citoplasma, questa linea permette di rilevare parassitemia e merozoiti gratuiti da rilevamento mediante citometria a flusso di GFP. Tuttavia, l&#39;intensità di fluorescenza GFP non è sufficiente a fornire la visualizzazione all&#39;interno di cellule THP-1, e quindi, merozoiti sono contrastate con etidio bromuro (EtBr). Altri ceppi di parassiti possono essere utilizzati, a condizione che la sincronia stretto è realizzabile. Sincronizzare i parassiti utilizzando una combinazione di trattamento sorbitolo per lisare forme mature 28 e eparina per inibire l&#39;invasione 15 </sup&gt;. <ol><li> Mantenere P. falciparum parassiti in O + eritrociti umani (RBC) al 3% di ematocrito in terreno RPMI-1640 (pH 7,4) supplementato con 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ipoxantina ml, 10% di siero umano riunito, 2 mg / bicarbonato di sodio ml, e 20 mg / ml di gentamicina (Parasite medio). Aggiungere 5 mg / ml Blasticidin S-cloridrato al mezzo di coltura di selezionare per GFP + parassiti. </li><li> Incubare culture in scatole a tenuta d&#39;aria o fiasche di coltura alternativa doppia tenuta a 37 ° C in atmosfera di 1% O 2, 4% di CO 2 e il 95% N 2. </li><li> Preparare vetrini striscio sottile, fissare in 100% di metanolo per 10 secondi, e macchia con il 10% di soluzione di Giemsa a 6,7 ​​mM (pH 7.1) tampone fosfato (soluzione Giemsa) per 10 min per monitorare parassitemia. Dopo la colorazione, sciacquarlo in acqua e aria secca. Valutare parassitemia con un obiettivo a immersione in olio 100X. </li><li> Mantenere culture parassita in un parassitemia di sotto del 5% RBC infetto dividendo culture e aggiungendo infettoRBC come richiesto. </li><li> Per la sincronizzazione con eparina, aggiungere 20 UI / ml di medico-grado eparina a squillare stadio culture. </li><li> Quando la maggior parte dei parassiti sono in fase schizonte, le cellule pellet a 300 xg per 5 minuti, togliere medio contenenti eparina e risospendere in mezzo parassita per consentire la rottura schizonte e merozoite invasione. </li><li> Dopo 4 ore, aggiungere 20 UI / ml di eparina torna a culture, bloccando ogni ulteriore invasione merozoite. NOTA: Diversi cicli di sorbitolo e trattamento con eparina può essere richiesto prima che i parassiti sono sufficientemente sincronizzati. Per generare numeri adeguati di merozoiti, preparare 150 ml di cultura parassita al 3-5% parassitemia. </li></ol> 4. Isolamento di fase avanzata P. falciparum Trofozoiti <ol><li> Trentasei ore dopo il ritorno eparina a culture, pellet cellule in coltura a 300 xg per 5 minuti, e risospendere pellet in mezzo parassita al 25% di ematocrito. </li><li> Attaccare una grande colonna magnetica (volume matrice di 6,3ml) ad un magnete, ed equilibrare la colonna con mezzo parassita, assicurandosi tutte le bolle d&#39;aria vengono rimosse. </li><li> Aggiungere il P. risospeso cultura falciparum alla colonna, e regolare la velocità di flusso di una goccia al sec. </li><li> Una volta che la cultura è passato attraverso la colonna, lavare la colonna con il mezzo parassita fino a quando il flow-through è pulita. </li><li> Parassiti eluire dalla colonna in 30 ml di 37 ° C media parassita. </li><li> Preparare uno striscio sottile di parassiti, fissare in 100% di metanolo per 10 secondi, e macchiare con la soluzione Giemsa per 3 min. Esaminare il vetrino sotto il microscopio, e garantire che i parassiti quasi riempire il globulo rosso, e sembrano essere nelle fasi iniziali schizonte. Se i parassiti non hanno raggiunto la fase di maturazione appropriato, ritorno parassiti purificati ad un incubatore a 37 ° C in atmosfera di 1% O 2, 4% di CO 2 e il 95% N 2 fino adeguatamente sviluppato. NOTA: purezza superiore al 90% infette globuli rossi è necessaria per garantire RBCs Non contaminare le preparazioni merozoite. </li><li> Trattare schizonti isolati con 10 pM E64 (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4 guanidino) butano (E64) per 6-10 ore. NOTA: i tempi di incubazione più lunghi con E64 sono possibili, ma i merozoiti prodotti non saranno più invasivi. </li></ol> 5. Isolamento di P. falciparum merozoiti <ol><li> Dopo l&#39;incubazione con E64, striscio parassiti, fissare le cellule in 100% di metanolo, e macchia con soluzione Giemsa per valutare la formazione di merozoiti membrana chiusa. NOTA: Una buona resa di merozoiti sarà ottenuta se superiore al 50% dei parassiti si sono formate membrana merozoiti chiusi. </li><li> Schizonti Pellet E64-trattato a 1.900 xg per 8 min. Lavare con 50 ml di RT mezzo RPMI-1640 (pH 7.4) supplementato con 25 mg / ml HEPES, 50 pg / ml ipoxantina, 2 mg / ml di bicarbonato di sodio, e 20 ug / ml di gentamicina (lavare medio) per rimuovere i residui di siero umano . </li><li> Risospendere il pellet in 2 ml di terreno di lavaggio. NOTA: Utilizzando FCS contenenti THP-1 media produrrà la formazione di schiuma durante la filtrazione. </li><li> Filtrare i 2 ml di risospesa E64-schizonti attraverso un filtro a siringa da 1,2 μm/32 mm. Raccogliere il filtrato in una provetta da 10 ml. NOTA: Il filtrato contiene merozoites e cristalli hemozoin, con schizonti non-rottura e detriti raccolti nel filtro. </li><li> Attaccare una piccola colonna magnetica ad un magnete, ed equilibrare con 500 microlitri THP-1 medium. </li><li> Passare il filtrato sopra la colonna magnetica. Raccogliere il flow-through. NOTA: hemozoin si legherà alla colonna, mentre merozoites passeranno attraverso. </li><li> Passare il flow-through sopra la colonna altre due volte per rimuovere hemozoin, raccogliendo il flusso attraverso ogni volta. </li><li> Lavare la colonna con 2 ml di RT THP-1 media per raccogliere eventuali merozoiti rimanenti. </li><li> Aggiungere EtBr a 10 pg / ml (concentrazione finale) e colorazione per 30 minuti a RT. Proteggere dalla luce per evitare photobleaching. Nota: assicurarsi che tutto il liquido e p EtBr contaminatirifiuti lastic vengono smaltiti in modo adeguato per le sostanze chimiche citotossiche. Merozoiti non sono più invasive termine dell&#39;incubazione. </li><li> Spin down merozoiti a 4.000 xg per 10 min. </li><li> Gettare il surnatante in apposito contenitore per rifiuti. </li><li> Risospendere merozoite pellet in 4 ml THP-1 media e spin down a 4000 xg per 10 min. </li><li> Aggiungi THP-1 media fino a un volume di 15 ml, e proteggere dalla luce. </li></ol> 6. Quantificare merozoite Concentrazione mediante citometria di flusso <ol><li> Portare il conteggio perline per RT. </li><li> Preparare PBS con 0,5% BSA per diluire merozoiti. </li><li> Conte merozoiti a 3 diluizioni; 1 a 100; 1 a 50 e 1 a 25. Preparare provette 3 FACS con 940, 930 e 910 microlitri di PBS +0,5% BSA, rispettivamente. Aggiungere 10, 20 e 40 pl di merozoiti purificati per provetta, rispettivamente. </li><li> Perle di conteggio Vortex per 30 secondi, e aggiungere 50 ml di perline per tubo FACS contenente merozoiti diluiti. </li><li> Eseguire i tre dilcampioni merozoite decentrate su un citometro a flusso dotati di un laser a 488 nm. Impostare un cancello rigoroso per merozoiti basato su EtBr e fluorescenza GFP doppia fluorescenza, e il conteggio cancello beads di fluorescenza in un canale separato. Acquisire gli eventi fino a 2.000 perline vengono raccolti. Nota: Queste istruzioni si riferiscono a contare GFP + merozoiti che sono stati contro-colorate con EtBr. Se non utilizzano GFP che esprimono parassiti quindi impostare porte merozoite basati su side scatter e EtBr fluorescenza. </li><li> Determinare il rapporto di merozoiti: perline dividendo il numero di eventi merozoite dai 2.000 eventi tallone conteggio, calcolare un rapporto per ogni diluizione. Utilizzare le specifiche lotti tallone conteggio per determinare il numero di perle in 50 ml di perline aggiunti per provetta. </li><li> Moltiplicare il numero di perline in 50 microlitri per il fattore di diluizione e dal merozoite: branello rapporto per tale fattore di diluizione. Questo numero corrisponde alla concentrazione di merozoiti per ml. Eseguire thESE passaggi per ogni diluizione. </li><li> La media delle concentrazioni misurate merozoite tutti e tre diluizioni. NOTA: Le deviazioni standard superiori al 10% per le concentrazioni stabilite per 1 in 100, 1 in 50, e 1 su 25 diluizioni indicano imprecisioni tecniche di preparazione dei campioni di conteggio. </li><li> Risospendere merozoiti a 8 x 10 6 / ml merozoiti in THP-1 medio per garantire un rapporto finale di quattro merozoiti per THP-1 cella. NOTA: Altro merozoite di THP-1 ratio può essere usato, e concentrazioni devono essere modificati di conseguenza. </li></ol> 7. Fagocitosi Assay <ol><li> Aggiungere 200 ml di calore FCS inattivi per pozzetto di 96 piastre ben inferiori a U, e lasciare a RT O / N per bloccare le piastre. Dopo l&#39;incubazione, rimuovere FCS e lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di PBS sterile. Rimuovere PBS e le piastre conservare a 4 ° C fino al momento. </li><li> Calcolare il numero di cellule THP-1 necessarie per analizzare campioni di plasma e controlli, permettendo pozzetti in triplicato per campione a 1 x 10 <sup&gt; 5 THP-1 le cellule per pozzetto. </li><li> Determinare THP-1 concentrazione cultura caricando 10 ml di coltura su un vetrino emocitometro. Contare il numero di cellule presenti in 4 gruppi di 16 quadrati angolari della emocitometro sotto un microscopio, poi la media dei conteggi. Moltiplicare il conteggio medio da 10.000 a calcolare il numero di cellule per ml. </li><li> Centrifugare il numero di cellule THP-1 a 500 xg per 5 min, e risospendere a 6.7 x 10 5 cellule / ml in THP-1 medium. </li><li> Aggiungere 150 microlitri di cellule THP-1 in THP-1 medium per pozzetto di una FCS-bloccata 96 pozzetti con fondo a U, con conseguente 10 5 cellule / pozzetto. Preparare 3 pozzetti per campione che saranno testati. Piastra Ritorno al incubatore fino al momento di aggiungere merozoiti. </li><li> Aggiungere 150 ml di preparazione merozoite a 8 x 10 6 / ml per pozzetto di una FCS-bloccata 96 pozzetti fondo U-separato. Preparare un pozzetto per ogni campione testato </li><li> Aggiungere 10 ml di campioni di plasma preparati diluiti per bene, per tegli piastra che contiene i merozoiti, e mescolare bene per garantire la soluzione omogenea. </li><li> Rimuovere la piastra THP-1 dal termostato, e aggiungere 50 ml di soluzione di merozoite / plasma per pozzetto contenente cellule THP-1, con pozzetti in triplicato per ogni campione di plasma. </li><li> Mescolare bene e incubare a 37 ° C in 5% di CO 2, incubatore umidificato per 40 min. Coprire con un foglio per proteggere dalla luce. </li><li> Dopo 40 min, campioni di centrifugazione per 5 min a 500 xg in una 4 ° C prechilled centrifuga ad arrestare fagocitosi. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare le cellule due volte in PBS freddo +0,5% BSA 2 mM EDTA (buffer FACS). NOTA: EDTA faciliterà nel mantenere una sospensione singola cella per citometria a flusso. </li><li> Fissare le cellule in 90 ml di 2% paraformaldeide (PFA) in PBS +0,5% BSA 2 mM EDTA (FACS fissativo). Lasciare in ghiaccio fino all&#39;acquisizione, al riparo dalla luce. </li></ol> 8. Citometria a Flusso <ol><li> Acquisire i campioni utilizzando un citofluorimetro wi attrezzatath un laser a 488 nm e throughput elevato lettore di piastra di fissaggio. NOTA: Ciò consentirà fino a 400 campioni di plasma da analizzare da una preparazione merozoite. Le cellule possono anche essere trasferiti in provette per uso caricamento del campione. </li><li> Cancello vitali cellule THP-1 di avanti e scatter laterale. </li><li> Impostare il cancello positivo EtBr basato sulle &#39;cellule THP-1 con merozoites e senza plasma&#39; di controllo. </li><li> Acquisire un minimo di 10.000 eventi per campione. </li></ol> 9. Analisi dei dati <ol><li> Analizzare i dati in citometria a flusso software di analisi, e impostare porte stringenti per gli eventi positivi EtBr. </li><li> Calcolare la fagocitosi percentuale per ogni campione: la% di EtBr + cellule per campione meno le cellule positive% con plasma non immune. </li><li> Risultati medi in tutta triplicati. NOTA: le deviazioni standard per un triplice copia in eccesso del 10% indicano imprecisioni sperimentali. Alcuni retroscena eventi EtBr positivi possono essere osservati a seguito di merozoiTE adesione alla superficie di cellule THP-1, ma dovrebbe essere costante per tutti i campioni contenenti merozoiti. Impostazione del cancello sulla base delle «cellule THP-1 con merozoites e nessun plasma &#39;di controllo, e sottraendo qualsiasi sfondo delle&#39; cellule THP-1 con i non-immune plasma &#39;di controllo si tradurrà in% fagocitosi che riflette la fluorescenza a causa interiorizzato / fagocitati solo merozoiti. </li></ol>

<ol><li>Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-globulin+and+acquired+immunity+to+human+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria.</a> Nature. 192, 733-737 (1961).</li>
<li>Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G. The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFowkes%2C+FJI+%22PLoS+Medicine%22">PLoS Medicine</a>. Medicine, P. L. oS. 7, (2010).</li>
<li>Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+that+protect+humans+against+Plasmodium+falciparum+blood+stages+do+not+on+their+own+inhibit+parasite+growth+and+invasion+in+vitro%2C+but+act+in+cooperation+with+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).</li>
<li>Jafarshad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+mechanism+involved+in+defense+against+malaria+requires+costimulation+of+monocytes+FcgammaRII+and+FcgammaRIII%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII.</a> Journal of immunology. 178, Baltimore, MD. 3099-3106 (1950).</li>
<li>Genton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+blood-stage+malaria+vaccine+reduces+Plasmodium+falciparum+density+and+exerts+selective+pressure+on+parasite+populations+in+a+phase+1-2b+trial+in+Papua+New+Guinea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea.</a> The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).</li>
<li>Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+malaria+by+MSP3+candidate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine.</a> The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).</li>
<li>Llewellyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+antibody-dependent+respiratory+burst+activity+from+mouse+neutrophils+on+Plasmodium+yoelii+malaria+challenge+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome.</a> Journal of leukocyte biology. , (2013).</li>
<li>McIntosh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+human+FcgammaRI+in+mediating+protection+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria.</a> PLoS pathogens. 3, 72(2007).</li>
<li>Pleass, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+antimalarial+antibodies+highlight+the+importance+of+the+antibody+Fc+region+in+mediating+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection.</a> Blood. 102, 4424-4430 (2003).</li>
<li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonizing+Antibodies+to+P.+falciparum+Merozoites+Associated+with+Immunity+to+Clinical+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Joos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Protection+from+Falciparum+Malaria+Correlates+with+Neutrophil+Respiratory+Bursts+Induced+by+Merozoites+Opsonized+with+Human+Serum+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li>
<li>Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonization+and+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+merozoites+measured+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+diagnostic+laboratory+immunology%22%5BJournal%5D)">Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry.</a> Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).</li>
<li>Richards, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Prioritization+of+Merozoite+Antigens+as+Targets+of+Protective+Human+Immunity+to+Plasmodium+falciparum+Malaria+for+Vaccine+and+Biomarker+Development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development.</a> The Journal of Immunology. , (2013).</li>
<li>Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+parasite+exit+from+the+host+erythrocyte%3A+a+two-step+process+requiring+extraerythrocytic+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).</li>
<li>Boyle, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viable+Plasmodium+falciparum+merozoites+to+define+erythrocyte+invasion+events+and+advance+vaccine+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).</li>
<li>Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+timing+of+action+of+anti-malarial+drugs+against+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).</li>
<li>Angrisano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Localisation+of+Actin+Filaments+across+Developmental+Stages+of+the+Malaria+Parasite%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+dissection+of+coordinated+events+during+malaria+parasite+invasion+of+the+human+erythrocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte.</a> Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).</li>
<li>Zuccala, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcompartmentalisation+of+Proteins+in+the+Rhoptries+Correlates+with+Ordered+Events+of+Erythrocyte+Invasion+by+the+Blood+Stage+Malaria+Parasite%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Marapana, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Parasite+Signal+Peptide+Peptidase+is+an+ER-Resident+Protease+Required+for+Growth+but+not+for+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion.</a> Traffic. 13, 1457-1465 (2012).</li>
<li>Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+effect+of+monocytes+with+Papua+New+Guinea+sera+on+Plasmodium+falciparum+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture.</a> International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).</li>
<li>Schofield, L., Mueller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+immunity+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical immunity to malaria.</a> Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).</li>
<li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+measurement+of+opsonizing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+merozoites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer+Journal+international+du+cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).</li>
<li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust%2C+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).</li>
<li>Ataíde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+Improved+Phagocytosis+Assay+to+Evaluate+the+Effect+of+HIV+on+Specific+Antibodies+to+Pregnancy-Associated+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li>
<li>Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fluorescent+Plasmodium+falciparum+for+in+vitro+growth+inhibition+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays.</a> Malar J. 9, 152(2010).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li>
<li>Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+proteolytic+activity+of+a+membrane+protein+in+Plasmodium+falciparum+by+phosphatidyl+inositol-specific+phospholipase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase.</a> C. Nature. 332, 457-459 (1988).</li>
<li>Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemozoin+induces+macrophage+chemokine+expression+through+oxidative+stress-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms.</a> J Immunol. 174, 475-484 (2005).</li>
<li>Schofield, L., Tachado, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+host+cell+function+by+glycosylphosphatidylinositols+of+the+parasitic+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa.</a> Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).</li>
<li>Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Plasmodium+falciparum+merozoite+phagocytosis+by+monocytes+from+immune+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals.</a> Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).</li>
<li>Lunov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+uptake+of+functionalized+polystyrene+nanoparticles+by+human+macrophages+and+a+monocytic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22ACS%22%5BJournal%5D)">Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line.</a> ACS. 5, 1657-1669 (2011).</li>
<li>Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptor-mediated+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+experimental+immunology%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro.</a> Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).</li>
<li>McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonopsonic+monocyte%2Fmacrophage+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-parasitized+erythrocytes%3A+a+role+for+CD36+in+malarial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance.</a> Blood. 96, 3231-3240 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per misurare merozoite fagocitosi, conoscenza di due tecniche è necessaria: purificazione di merozoiti e THP-1 test fagocitosi. I passaggi più critici per la combinazione di queste due tecniche sono le seguenti: 1) i parassiti altamente sincronizzati; 2) Aggiunta di E64 al momento giusto per produrre membrane merozoites chiusi; 3) Rimozione hemozoin per evitare aggregati; 4) Accurate conteggio merozoite mediante citometria di flusso; 5) la diluizione del plasma utilizzato; e 6) mantenendo bassa densità cellulare e numero passaggio di cellule THP-1. Un&#39;attenta considerazione di questi aspetti fondamentali garantirà risposte fagocitosi robuste siano rispettate. Sebbene, qui descritto è la preparazione di merozoiti per valutare la fagocitosi, la tecnica può essere utilizzata per una vasta gamma di applicazioni. Indipendentemente dalla metodologia a valle, preparazioni ottimali merozoite dipendono temporizzazione corretto E64 aggiunta per generare merozoiti. Il metodo qui descritto E64 ha dimostrato di yield merozoiti invasive per l&#39;uso in microscopia ad alta risoluzione degli eventi di invasione e di saggi di sensibilità ai farmaci 15-20. Mentre la redditività merozoite non è essenziale per la fagocitosi, è necessaria l&#39;integrità del rivestimento superficiale merozoite. Pertanto, il metodo E64 qui descritto consente merozoites alta qualità per essere prodotto per valutare la risposta anticorpale al rivestimento superficiale. Come illustrato in Figura 1, se E64 viene aggiunto troppo presto o membrana merozoiti chiusi troppo tardi non si formano. Per questo motivo, sono necessarie culture parassita altamente sincroni. Qui, l&#39;uso di trattamenti sorbitolo e eparina a stretto sincronizzare culture parassita D10-GFP ad una finestra di 2 ore è descritto. L&#39;eparina può promuovere gametocytogenesis in altri laboratori isolati, e quindi deve essere usato con cautela. Metodi di sincronizzazione alternativi come alanina possono anche essere utilizzati purché parassiti ben sincronizzati vengono prodotti 29. Se E64 viene aggiunto ai parassiti asincroni, un puntello più bassoortion di merozoiti membrana chiusa sarà prodotto e rimanendo parassita-infetti RBC sarà o rottura normalmente o sviluppare morfologia anormale. La presenza di parassiti che non hanno sviluppato in membrana racchiuso merozoiti comporterà intasamento del filtro e ridurre significativamente la resa merozoite ottenuto. Durante la filtrazione di merozoiti membrana chiusa, hemozoin è liberato dai vacuoli digestivi ed è presente come cristalli liberi in soluzione. Hemozoin è altamente pro-infiammatorio ed è stato segnalato per modulare monociti e macrofagi fagocitosi risposte 30, 31. Oltre a modulare la fagocitosi, come mostrato nella Figura 2, hemozoin può formare aggregati merozoiti in soluzione. Come cellule THP-1 possono fagocitare questi aggregati, questo può essere un confounder importante per la risoluzione di anticorpo fagocitosi mediata. Pertanto, la rimozione di hemozoin è necessario in questo saggio di avoid complessità di hemozoin su phagocyte biologia. Inoltre, la mancata rimozione hemozoin può anche essere deleterio quando si utilizza questa tecnica per generare merozoiti libero per altre applicazioni, specialmente dove è richiesta merozoite quantificazione. Come illustrato nella Figura 4, il numero di merozoiti aggiunto al dosaggio può influenzare il grado di fagocitosi da cellule THP-1. Anche se citometria a flusso consente l&#39;enumerazione di concentrazione merozoite, attenta pipettaggio e replicare conti di merozoiti sono necessarie per migliorare la precisione. Ciò è particolarmente importante se più linee parassiti vanno testati side-by-side. È stato precedentemente dimostrato che il plasma dai bambini semi-immuni da PNG può essere notevolmente diluito prima risposte declino 23. Descritto qui è la diluizione ottimale di plasma (1/120, 000 diluizione finale di plasma) per una coorte di 5-12 anni i bambini PNG che ha prodotto la vasta gamma di phagocyt. risposte OSIS descritte nella Figura 5 Questa gamma ha permesso per la stratificazione delle risposte in quattro gruppi (0-19%, 20-39%, 40-59% e 60-79% fagocitosi), e il modello di regressione ha rivelato che le risposte opsonizzante sono stati associati con protezione dalla malattia clinica e ad alta densità parassitemia 10 Per diverso coorte studi può essere necessario regolare la diluizione del plasma per garantire la fagocitosi da cellule THP-1 non è saturo o al di sotto del livello di rilevazione. Citometria a flusso permette fagocitosi veloce e quantificabile con una migliore precisione in microscopia. Questo protocollo è un alto rendimento, piatto a base di e automatizzata acquisizione di piastre a 96 pozzetti per studiare acquisita naturalmente immunità umorale. Il metodo richiede la colorazione di merozoiti con etidio bromuro, macchie DNA tuttavia alternative come SybrGreen, DAPI e propidio iodio, macchie o macchie proteine ​​di membrana potrebbero essere utilizzati. Questo test potrebbe essere suscettibile di Primarmonociti e neutrofili y, e potrebbero essere adattati se fagociti o FcR biologia sia di interesse. Cellule primarie o cellule THP-1 differenziate in vitro con PMA possono essere utilizzati per studiare la fagocitosi in malaria e altri agenti patogeni 12, 32-34. Tuttavia utilizzando cellule primarie può essere impegnativo in quanto queste cellule sono aderenti e anche la visualizzazione non-mediata anticorpo fagocitosi 35. Inoltre, la variabilità in purezza, vitalità e funzionalità sono alcune limitazioni chiave per l&#39;uso di cellule fagocitarie primarie. I recettori Fc coinvolti nella fagocitosi merozoite rimangono uncharacterized, e quindi utilizzando anticorpi bloccanti a specifici recettori Fc potrebbe chiarire il contributo di ciascun recettore Fc per merozoite fagocitosi. Come THP-1 fagocitosi è FcR dipendente, questo permette interpretazione semplice della fagocitosi osservata. Questo test si presta anche ad affrontare la specificità antigenica dei opsonizzare anticorpi che potrebbero essere raggiunte da utilizing parassiti knock-out per gli antigeni di superficie merozoite, oppure utilizzando anticorpi umani purificati affinità per merozoite proteine ​​di superficie. Inoltre, in studi approfonditi di risposte citochine seguenti merozoite fagocitosi mancano, e potrebbero essere raggiunti da questo test. Queste due tecniche costituiscono notevoli progressi allo studio degli anticorpi antimerozoite funzionali. La purificazione di merozoiti di alta qualità è vantaggioso utilizzare merozoites crioconservati, o microsfere fluorescenti rivestiti con antigeni merozoite. Sebbene questo test è stato utilizzato come strumento di valutazione immunità acquisita naturalmente, può rivelarsi uno strumento importante per affrontare l&#39;acquisizione di immunità in risposta alla vaccinazione. Mentre è stato recentemente dimostrato che la fagocitosi o merozoiti opsonised è associato con protezione da malaria clinica, non è possibile trarre conclusioni dirette dal vitro THP-1 fagocitosi in vivo phagocytosis di merozoiti la fagocitosi in questo saggio si verifica in condizioni statiche e in assenza di competere globuli rossi. I possibili adattamenti di questo test può quindi fornire uno strumento versatile per una maggiore comprensione della malaria e merozoite fagocitosi.

L&#39;importanza di anticorpi per l&#39;immunità di malaria da Plasmodium falciparum è stato mostrato 40 anni fa, quando immunoglobulina dagli adulti iperimmuni è stato passivamente trasferito a bambini affetti da malaria grave con conseguente malattia alleviato 1. Di conseguenza, ha cercato notevole sforzo per identificare gli obiettivi di protezione dell&#39;immunità malarica, principalmente attraverso la misurazione titoli anticorpali di peptidi o proteine ​​in batteri espresse da ELISA. Sierologia basato ELISA ha anche dimostrato molto variabile tra gli studi, e non affronta la funzionalità anticorpale 2. Molti antigeni malaria inducono una IgG1 cytophilic e IgG3 profilo di anticorpi, in particolare gli antigeni di superficie merozoite 3. Questo pregiudizio sottoclasse suggerisce che l&#39;anticorpo-Fc-recettore (CFR) interazioni con i fagociti sono importanti per le funzioni effettrici delle opsonizzare anticorpi antimerozoite 4. Diversi vaccini antigene merozoite in fase di sviluppo sono progettati persuscitare funzioni effettrici fagocita 5, 6 e sebbene evidenze significative per l&#39;importanza delle interazioni anticorpo-FCR in modelli di roditori malaria esiste 7-9, e alcuni studi recenti sostengono l&#39;importanza di anticorpi funzionali e funzioni dei fagociti effettrici dell&#39;immunità malaria nell&#39;uomo 10, 11, questa zona rimane poco studiato. Studio sulle anticorpi specifici opsonizzante merozoite è stato limitato da due fattori; la difficoltà di isolare merozoiti buona qualità; e le risposte fagocitosi variabili da cellule primarie. Fino a poco tempo, centrifugazione ad alta velocità o densità Percoll gradienti sono stati utilizzati per isolare merozoites da surnatanti di coltura di rottura culture schizonte. Questi merozoiti raramente erano vitali, e spesso ulteriormente manipolati da centrifugazione densità e di lavaggio più passaggi 12, o la crioconservazione 11 prima dell&#39;uso in saggi. Questi processes potenzialmente staccano molte proteine ​​associate perifericamente dalla superficie merozoite, proteine ​​note per essere bersagli antigenici di immunità malarica 13. Recentemente l&#39;inibitore cisteina proteasi trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butano (E64) è stato usato per generare merozoiti vitali. E64 previene la rottura schizonte, generando membrana chiusa merozoites 14, che possono essere interrotti per filtrazione per liberare merozoites vitali 15, 16. Questa tecnica ha portato alla risoluzione spaziale di numerose proteine ​​durante eritrociti invasione 15, 17-19 e ha chiarito l&#39;effetto specifico stadio di numerosi farmaci antimalarici 16, 20. Tuttavia, la generazione di merozoiti vitali rimane tecnicamente difficile. Per facilitare la diffusione di questa tecnica e applicazione di saggi funzionali di immunità, un protocollo dettagliato per la purificazione vitale merozoite e il loro utilizzo in unsaggio funzionale standardizzata di anticorpi: cooperazione cellulare in opsonizzazione e fagocitosi è descritto qui. Questa tecnica dimostra un significativo passo avanti rispetto alle precedenti saggi in vitro di merozoite opsonization, come neutrofili scoppio respiratorio, Antibody Dependent Cellular inibizione (ADCI), e saggi merozoite fagocitosi alternative. Questi test sono scarsamente riproducibile a causa di variazione ingressi parassita e l&#39;attività dei fagociti primarie 11, 21. Contaminanti hemozoin può anche influenzare profondamente la funzione dei fagociti 22. Un recentemente riportato robusto e riproducibile merozoite fagocitosi dosaggio 23 utilizza la linea cellulare promonocytic THP-1 24. Si tratta di un tipo di cellula ideale per saggi flusso elevato throughput citometria com&#39;è non aderente e specificamente esegue Fc-Receptor fagocitosi mediata 25, 26. Un ulteriore complessità, mentre investitoritigating fagocitosi è che il grado di fagocitosi dipende dal numero di merozoiti relativi a cellule THP-1 e la concentrazione plasmatica. Per garantire la riproducibilità tra esperimenti, merozoites devono essere enumerati e una concentrazione definita utilizzati. A causa delle loro piccole dimensioni, il flusso è necessaria la quantificazione citometria. La procedura qui descritta rimuove hemozoin e genera merozoiti vitali, e descrive l&#39;applicazione di questi merozoiti per citometria a flusso conteggio di merozoiti seguita da opsonizzazione e fagocitosi. Anche se tecnicamente impegnativo, le tecniche descritte possono essere utili a chiarire il contributo delle risposte anticorpali specifiche di superficie merozoite per acquisita naturalmente e vaccino indotto l&#39;immunità.

<table><tbody><tr><td>Linea cellulare THP-1</td><td>Collezione di colture di tipo americano</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td>Uso in cappa aspirante</td></tr><tr><td>Pen/soluzione streptococco (100x)</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SAFC</td><td>90909C</td><td>Grado di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Ipoxantina</td><td>Calbiochem</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>Siero umano&nbsp;</td><td>Donazione della Croce</td><td></td> Rossa Australiana <td>Disponibile in commercio (ad es. Invitrogen)</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Pfizer</td><td>61022027 Qualità per</td><td>iniezione</td></tr><tr><td>Eparina sodica BP (5000 UI/ml)</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Origine suina</td></tr><tr><td>Blasticidina S-cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-70-4</td><td></td></tr><tr><td>E64 Inibitore della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132-10MG</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>98281-100G</td><td>Utilizzare per tampone fosfato</td></tr><tr><td>Na2HPO4.2H20</td><td>Merck</td><td>10383.4G</td><td>Utilizzare per il tampone fosfato</td></tr><tr><td>Giemsa's azur eosina soluzione blu di metilene</td><td>Merck</td><td>1.09204.0500</td><td>diluizione 1:10 in 6,7 mN Tampone fosfato (fare fresco ogni colorazione)</td></tr><tr><td>Sale disodico EDTA</td><td>Merck</td><td>10093,5 V</td><td>0,1 M, pH 7,2</td></tr><tr><td>Filtri per siringa Acrodisc 1,2-&mu; m/32-mm</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4656</td><td></td></tr><tr><td>Separatore QuadroMACS (per colonna piccola)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-091-051</td><td>Intercambiabile con MidiMACS&nbsp;</td></tr><tr><td>Separatore VarioMACS (per colonne grandi)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-090-282</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>LS Colonna (colonna magnetica piccola)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Colonna magnetica grande</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-041-305</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Bio-Rad</td><td>1510433</td><td>Conteggio citotossicoPerle</td></tr> di <tr><td>conteggio assoluto Bright</td><td>Invitogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Citometro a flusso con lettore di piastre HTS</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sale disodico EDTA</td><td>Merck</td><td>10093.5V</td><td>0.1 M, pH 7.2</td></tr><tr><td>FlowJo Software di analisi citometrica</td><td>Tree Star</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high yield purificazione di<em&gt; plasmodium falciparum</em&gt; merozoiti per l&#39;uso in opsonizzante anticorpo saggi

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum antigeni merozoite sono in fase di sviluppo come potenziali vaccini contro la malaria. Un aspetto di immunità contro malaria è la rimozione di merozoiti liberi dal sangue da parte delle cellule fagocitiche. Tuttavia valutare l&#39;efficacia funzionale di anticorpi specifici opsonizzante merozoite è impegnativo a causa della breve emivita del merozoiti e la variabilità dei fagociti primarie. Descritto in dettaglio in questa sede è un metodo per la generazione di merozoiti vitali usando l&#39;inibitore della proteasi E64, e un saggio di merozoite opsonina-dipendente fagocitosi utilizzando la linea cellulare pro-monocitica THP-1. E64 previene la rottura schizonte consentendo lo sviluppo di merozoiti che vengono rilasciati da filtrazione di schizonti trattati. Merozoiti etidio bromuro sono etichettati opsonizzati con campioni di plasma umano e aggiunti a cellule THP-1. La fagocitosi è valutata da un protocollo standardizzato alto rendimento. Merozoiti vitali sono una risorsa preziosa per la valutazione numerAspetti DIVERSI DI P. biologia falciparum, compresa la valutazione della funzione immunitaria. Livelli anticorpali misurati da questo test sono associati con l&#39;immunità alla malaria clinica in individui naturalmente esposti. Il dosaggio può anche essere utile per valutare gli anticorpi vaccino ha indotto.

La fase di maturazione dei parassiti prima del trattamento E64 è fondamentale per la generazione di merozoiti membrana chiusa. Figura 1AI mostra il grado di maturazione appropriato di schizonti per l&#39;aggiunta E64. I parassiti dovrebbero essere grandi e quasi riempire il globulo rosso. Un aspetto maculato di Giemsa indica merogonia è iniziato, e E64 dovrebbe essere aggiunto per produrre merozoiti membrana chiusa (Figura 1Aii). Se si aggiunge E64 in precedenza per trofozoita parassiti teatrali, membrana merozoites chiusi non vengono generati anche dopo 12 ore di E64. Invece parassiti assumono morfologia anormale come l&#39;allargamento del vacuolo digestivo (Figura 1BI e 1Bii), e merozoiti non si formano. Se E64 è aggiunto in seguito per schizonti, merozoites membrana chiusa non vengono generati come rottura schizonte è disinibita (Figura 1CI e 1Cii). Occorre un elevato livello di parassita sincronia, altrisaggio una serie di tre risultati descritti si vedrà dopo il trattamento E64. Rimozione di hemozoin è un altro passo fondamentale per merozoiti purificazione. Se merozoiti non vengono purificati da hemozoin allora cluster merozoite-hemozoin forma che non può essere sloggiato da pipettaggio. Questi aggregati eseguiti sul citometro come singoli eventi, anche se con diverse caratteristiche forward-scatter e side-scatter di singoli merozoiti, con conseguente imprecisa conteggio merozoite mediante citometria di flusso (Figura 2A). Come cellule THP-1 possono anche fagocitare hemozoin, questi cluster merozoite-hemozoin possono anche essere fagocitati (Figura 2B). Questi aggregati sono fluorescenti altamente EtBr in quanto contengono più merozoiti. Fagocitosi dei risultati aggregati in un profilo EtBr fluorescenza THP-1 equivalente a quello osservato per la fagocitosi di più singoli merozoiti. Quindi, se hemozoin non viene rimosso, la fluorescenza EtBr di cellule THP-1 sarà un overestimate del potenziale opsonizzante per il plasma in prova. Hemozoin è anche riferito di alterare significativamente la funzione dei fagociti. GFP merozoiti positivi sono bancone colorati con EtBr per aumentare la visualizzazione di merozoiti fagocitati da cellule THP-1. Utilizzando le condizioni descritte in questo protocollo, tutti merozoiti GFP positive sono contrastate con EtBr che ha una intensità di fluorescenza più luminoso (Figura 3A). Valutazione fagocitosi da EtBr fluorescenza permette una risoluzione superiore di merozoite fagocitosi di fluorescenza GFP (Figura 3B). Il numero di merozoiti aggiunte al saggio sarà modulare la quantità di fagocitosi osservato. Per questo motivo, un conteggio preciso mediante citometria a flusso è critica. Aumentando rapporti di merozoiti: THP-1 si tradurrà in maggiore aderenza dei merozoiti di cellule THP-1 in assenza di plasma (Figura 4A). Aumentare merozoite: THP-1 ratio si traduce anche in una maggiore phrisposte agocytosis quando merozoiti sono opsonizzati (Figura 4B). A 4:01 merozoite: THP-1 ratio è raccomandato per le risposte fagocitosi robuste. Usando questo rapporto, e la diluizione del plasma indicato, questo test è in grado di risolvere bassi, intermedi e alti livelli di anticorpi opsonizzante. Tra 0 e 78 per cento di risposte fagocitosi sono state osservate utilizzando campioni di plasma PNG e le altre condizioni descritte. Tali risposte sono state recentemente dimostrato di associarsi con l&#39;immunità clinica acquisita naturalmente alla malaria 10. Figura 5 mostra esempi di 4 quartili di risposte fagocitosi da privati ​​PNG. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Tempi della E64 Inoltre è fondamentale per la generazione di merozoiti membrana chiusa. (A) maturatio appropriato. n fase di parassiti i) prima del trattamento E64, e ii) merozoiti membrana chiusa prodotti dopo 6 ore di trattamento E64 (B) membrana merozoites chiusi non vengono generati se E64 viene aggiunto ai parassiti immaturi; i) trofozoiti tardivamente, e ii) dopo 12 ore di E64 (C) schizonte la rottura non è inibito se E64 è aggiunto segmentato in ritardo schizonti.; i) schizonti fase avanzata, e ii) dopo 6 ore di E64. Barra della scala rappresenta 10 micron. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Rimozione hemozoin è fondamentale per generare una sospensione merozoite cella singola. Aggregati merozoite-hemozoin formano a seguito di filtrazione a membrana merozoiti chiusi, a meno che hemozoin è magneticamente separato dal merozoiti. (A) Forward-scatter e side-scatter appezzamenti di merozoiti con hemozoin rimossoe hemozoin mantenuto. (B) aggregati hemozoin-merozoite possono essere fagocitati dalle cellule THP-1. Diff-Quick colorati diapositive cito spin di cellule THP-1 incubati con PNG plasma opsonizzati preparazioni merozoite con o senza hemozoin. Barra della scala rappresenta 10 micron. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Colorazione con etidio bromuro consente per la risoluzione superiore di merozoite fagocitosi. D10-GFP merozoites purificate sono di contrasto con EtBr per migliorare intensità di fluorescenza. (A) citometria a flusso histrogram di merozoiti purificati con gating su GFP merozoites positivi, e una macchia dot mostra EtBr fluorescenza all&#39;interno di questa popolazione GFP positive gated. (B) scatter in avanti rispetto GFP e scatter in avanti rispetto EtBr di cellule THP-1 a seguito fagocitosi di merozoiti fluorescenti dual GFP e EtBr. Gates sono stati d<html> Rawn basato sulle cellule THP-1 con merozoiti e nessun controllo di plasma. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 Il merozoite:. THP-1 ratio influisce sul grado di fagocitosi osservato. (A) Cinque merozoite: THP-1 ratio sono raffigurate; 50:1, 20:01, 10:01, 04:01, 01:01. Solo le cellule di controllo indica fluorescenza di fondo a causa di cellule THP-1. THP-1 EtBr fluorescenza per ciascun rapporto è indicato per merozoites opsonizzati con un pool di plasma o PNG con il plasma non immune australiano (B) Media fluorescenza intensità di cellule THP-1 per diverso merozoite:. THP-1 ratio, e opsonization con piscina di PNG plasma o plasma non immune australiano (media + SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> ove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Un&#39;ampia gamma di anticorpi opsonizzante può essere misurata. Merozoiti stati opsonizzati con plasma da individui PNG e incubati con cellule THP-1. Vengono mostrati quattro risposte fagocitosi rappresentativi. Gates sono state elaborate sulla base di cellule THP-1 con merozoites e nessun controllo di plasma e numeri indicano la fagocitosi% dopo la sottrazione delle cellule THP-1 con controllo di plasma non-immune. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Funzione di misura anticorpo è la chiave per comprendere l&#39;immunità a malaria da Plasmodium falciparum. Questo metodo descrive la purificazione di merozoiti vitali, e la misurazione di opsonizzazione-dipendente fagocitosi mediante citometria di flusso.

High Yield Purificazione di<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiti Per l&#39;uso in opsonizzante anticorpo saggi

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare maiti puri di Plasmodium falciparum con un'elevata resa, al fine di quantificare la loro opsonizzazione da parte di anticorpi umani. Questo risultato si ottiene innanzitutto inibendo la rottura di S schon con E 64, al fine di generare strutture di maiti racchiuse in membrana. Nel secondo passaggio, i maiti liberi vengono raccolti e quindi colorati con bromuro di AUM per la quantificazione; nell'ultimo passaggio, i maiti vengono incubati con diversi campioni di plasma umano e con cellule monocitiche umane THP one.In definitiva, l'opsonizzazione dei maites da parte dei diversi campioni di plasma umano può essere differenziata mediante citometria a flusso. I vantaggi di questa tecnica rispetto ai saggi esistenti di immunità funzionale alla malaria meite sono l'utilizzo di mes integri e la robustezza e quantificabilità delle risposte di fagocitosi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia della malaria, come ad esempio qual è l'importanza degli anticorpi ossidanti e della fagocitosi nell'immunità contro la malaria in individui vaccinati o naturalmente esposti?La visualizzazione di questa tecnica è fondamentale poiché il momento dell'aggiunta di E 64 è essenziale per garantire la formazione del mezo. E poiché la preparazione e il conteggio del mezo richiedono competenze tecniche elevate, dopo la separazione magnetica dei trofozoiti di P. falciparum in fase avanzata, valutare la maturazione del parassita fissando un’impronta sottile di parassiti in metanolo al 100% per 10 secondi e colorandoli in Giza per tre minuti. Esaminare il vetrino colorato al microscopio per assicurarsi che i parassiti occupino quasi completamente i globuli rossi e appaiano in fase iniziale di zen.Se i parassiti non hanno raggiunto lo stadio di maturazione appropriato, continuare l'incubazione fino a quando non saranno adeguatamente sviluppati. Una volta raggiunta la maturità adeguata, trattare lo schizonte isolato con 10 micromolar E 64 e incubare per altre sei-dieci ore. Dopo l'incubazione con E 64, preparare uno striscio dei parassiti trattati.Fissare il vetrino in metanolo al 100% e colorare con Giza per confermare che almeno il 50% dei parassiti abbia formato la membrana. Pellettare i maites racchiusi nel restante schizonte trattato con E 64 per otto minuti a 1900 Gs a temperatura ambiente. Quindi lavare i parassiti in 50 millilitri di soluzione a temperatura ambiente.Lavare il mezzo per rimuovere qualsiasi siero umano residuo. Dopo aver scartato il sopranatante, risospendere il pellet di parassiti in due millilitri di mezzo di lavaggio, quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro per siringa da 1,2 micrometri, raccogliendo i parassiti e i cristalli di emo nei tubi da 10 millilitri. Successivamente, fissare una piccola colonna magnetica su un magnete ed equilibrarla con 500 microlitri di mezzo THP-1.Filtrare il filtrato attraverso la colonna magnetica per tre volte, raccogliendo i maites nel flusso in uscita ogni volta. Quindi lavare la colonna con due millilitri di mezzo THP uno a temperatura ambiente per raccogliere eventuali maites rimanenti.La rimozione dell'emina è un passaggio fondamentale per la purificazione delle maites. Se le maites non vengono separate dall'emina, si formeranno aggregati di maites ed emina, con conseguente conteggio inaccurato delle maites mediante citometria a flusso. Le cellule THP-1 possono fagocitare l'emina, quindi gli aggregati di maites ed emina possono anche essere ceto.Pertanto, se l'emina non viene rimossa, il potenziale opsonizzante del plasma in esame verrà sovrastimato. Colorare i maites raccolti con 10 microgrammi per millilitro di bromuro di ahy a temperatura ambiente, protetti dalla luce. Dopo 30 minuti, centrifugare i maites, scartare il soprannatante in un contenitore per rifiuti appropriato e lavare il pellet di maites con quattro millilitri di mezzo THP uno per pellet di maites.Quindi risospendere le cellule in 15 millilitri di mezzo TP1 protetto dalla luce. Per quantificare le MAIT mediante citometria a flusso, contare le MAIT in diluizioni di uno a 100, uno a 50 e uno a 25.Per prima cosa, distribuire rispettivamente 940, 930 e 910 microlitri di PBS più BSA in tre provette fax diverse e aggiungere 10, 20 e 40 microlitri di maites purificati in ciascuna provetta. Successivamente, vortexare le perle per il conteggio a temperatura ambiente per 30 secondi, quindi aggiungere 50 microlitri delle perle in ciascuna provetta fax contenente i maites diluiti. Eseguire i tre campioni di maites diluiti su un citometro a flusso dotato di un laser a 488 nanometri, impostando una finestra rigorosa per i maites in base alla doppia fluorescenza di bromuro di aterio e GFP, e raccogliere le perle in un canale separato acquisendo eventi fino a quando non sono state raccolte 2000 perle.Per quantificare il numero di maites in ogni diluizione, calcolare la media delle tre misurazioni della concentrazione di maites. Successivamente, risospendere i maites a una concentrazione di otto per 10 alla sesta maites per millilitro in mezzo THP uno per garantire un rapporto finale di quattro maites per cellula THP uno al fine di misurare la fagocitosi dei maites. Innanzitutto, formare un pellet di un numero sufficiente di cellule THP uno per il saggio e risospendere le cellule a 6,7 per 10 alla quinta cellule per millilitro in mezzo THP uno.Successivamente, aggiungere 150 microlitri di cellule THP-1 per pozzetto, in triplicato per ogni condizione da testare, in una piastra a 96 pozzetti fondo rotondo bloccata con FCS, per ottenere una concentrazione finale di 105 cellule per pozzetto. Collocare la piastra nell'incubatore fino al momento dell'aggiunta delle MAIT. Quindi, aggiungere 150 microlitri delle MAIT isolate a una concentrazione di 8 × 106 cellule per millilitro per pozzetto in una piastra separata a 96 pozzetti fondo rotondo bloccata con FCS, utilizzando un pozzetto per ogni condizione da testare.Aggiungere 10 microlitri di campioni di plasma diluiti preparati in ciascun pozzetto della piastra di miscelazione, mescolando accuratamente per garantire una soluzione omogenea. Successivamente, aggiungere 50 microlitri della soluzione di plasma maites in ciascun pozzetto della piastra THP uno, in triplice replicato per ciascun campione di plasma da testare. Mescolare bene i campioni, quindi incubare le colture cellulari in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius in atmosfera di anidride carbonica al 5%.Dopo 40 minuti, centrifugare i campioni in una centrifuga preraffreddata per arrestare la fagocitosi. Quindi lavare le cellule due volte in tampone fax freddo dopo il secondo lavaggio. Fissare le cellule in 90 microlitri di fissativo fax e lasciarle sul ghiaccio.Proteggere dalla luce fino all'acquisizione. Lo stadio di maturazione dei parassiti prima del trattamento con E 64 è fondamentale per generare maites racchiusi da membrana. I parassiti devono essere di grandi dimensioni, quasi riempire completamente il globulo rosso e mostrare una colorazione a macchie dei gems.L'aggiunta di E 64 in questa fase produrrà maites racchiusi in membrana dopo un'incubazione di sei-dieci ore. Se E 64 viene aggiunto in anticipo a parassiti allo stadio di trofozoiti, i maites racchiusi in membrana non verranno generati. Se E 64 viene aggiunto in ritardo, la rottura di schon schon non viene inibita.È richiesto un elevato livello di sincronia del parassita. In caso contrario, dopo il trattamento con E 64, si osserverà una gamma di tutti e tre gli esiti descritti. La misurazione della fagocitosi mediante la fluorescenza del bromuro di aum consente una risoluzione superiore della fagocitosi del parassita rispetto alla sola fluorescenza GFP. L'aumento del rapporto tra maites e cellule TP uno determina un incremento dell'adesione dei maites alle cellule THP uno.In assenza di anticorpi specifici per le MAITE, l'aumento del rapporto tra cellule MEITE e cellule THP-1 determina anche un incremento della fagocitosi compreso tra lo zero e il 78%. L'opsonizzazione delle MAITE è stata osservata utilizzando campioni di plasma della Papua Nuova Guinea a un rapporto di quattro a uno tra MAITE e cellule THP-1. Questi dati mostrano esempi dei quattro quartili delle risposte acide a PHA di quattro individui rappresentativi della Papua Nuova Guinea. È stato dimostrato che gli anticorpi opsonizzanti misurati mediante questo saggio si associano all'immunità clinica contro la malaria durante il tentativo di questa procedura.I punti chiave da ricordare per garantire un'esecuzione corretta della citosi PE consistono nell'utilizzare parassiti altamente sincronizzati per ottenere maiti completamente maturi e integri, e nel mantenere in modo appropriato le colture cellulari di THP-1. La tecnica per la purificazione dei maiti descritta in questo protocollo può essere adattata a qualsiasi applicazione che richieda maiti di elevata qualità, come marizzazione, saggi di invasione, proteomica o sierologia. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il metodo E-64 per purificare i maiti e per studiare gli anticorpi opsonizzanti misurando la fagocitosi da parte delle cellule THP-1.

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