High Yield Purificazione di

L'obiettivo generale di questa procedura è generare maiti puri di Plasmodium falciparum con un'elevata resa, al fine di quantificare la loro opsonizzazione da parte di anticorpi umani. Questo risultato si ottiene innanzitutto inibendo la rottura di S schon con E 64, al fine di generare strutture di maiti racchiuse in membrana. Nel secondo passaggio, i maiti liberi vengono raccolti e quindi colorati con bromuro di AUM per la quantificazione; nell'ultimo passaggio, i maiti vengono incubati con diversi campioni di plasma umano e con cellule monocitiche umane THP one.

In definitiva, l'opsonizzazione dei maites da parte dei diversi campioni di plasma umano può essere differenziata mediante citometria a flusso. I vantaggi di questa tecnica rispetto ai saggi esistenti di immunità funzionale alla malaria meite sono l'utilizzo di mes integri e la robustezza e quantificabilità delle risposte di fagocitosi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia della malaria, come ad esempio qual è l'importanza degli anticorpi ossidanti e della fagocitosi nell'immunità contro la malaria in individui vaccinati o naturalmente esposti?

La visualizzazione di questa tecnica è fondamentale poiché il momento dell'aggiunta di E 64 è essenziale per garantire la formazione del mezo. E poiché la preparazione e il conteggio del mezo richiedono competenze tecniche elevate, dopo la separazione magnetica dei trofozoiti di P. falciparum in fase avanzata, valutare la maturazione del parassita fissando un’impronta sottile di parassiti in metanolo al 100% per 10 secondi e colorandoli in Giza per tre minuti. Esaminare il vetrino colorato al microscopio per assicurarsi che i parassiti occupino quasi completamente i globuli rossi e appaiano in fase iniziale di zen.

Se i parassiti non hanno raggiunto lo stadio di maturazione appropriato, continuare l'incubazione fino a quando non saranno adeguatamente sviluppati. Una volta raggiunta la maturità adeguata, trattare lo schizonte isolato con 10 micromolar E 64 e incubare per altre sei-dieci ore. Dopo l'incubazione con E 64, preparare uno striscio dei parassiti trattati.

Fissare il vetrino in metanolo al 100% e colorare con Giza per confermare che almeno il 50% dei parassiti abbia formato la membrana. Pellettare i maites racchiusi nel restante schizonte trattato con E 64 per otto minuti a 1900 Gs a temperatura ambiente. Quindi lavare i parassiti in 50 millilitri di soluzione a temperatura ambiente.

Lavare il mezzo per rimuovere qualsiasi siero umano residuo. Dopo aver scartato il sopranatante, risospendere il pellet di parassiti in due millilitri di mezzo di lavaggio, quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro per siringa da 1,2 micrometri, raccogliendo i parassiti e i cristalli di emo nei tubi da 10 millilitri. Successivamente, fissare una piccola colonna magnetica su un magnete ed equilibrarla con 500 microlitri di mezzo THP-1.

Filtrare il filtrato attraverso la colonna magnetica per tre volte, raccogliendo i maites nel flusso in uscita ogni volta. Quindi lavare la colonna con due millilitri di mezzo THP uno a temperatura ambiente per raccogliere eventuali maites rimanenti.

La rimozione dell'emina è un passaggio fondamentale per la purificazione delle maites. Se le maites non vengono separate dall'emina, si formeranno aggregati di maites ed emina, con conseguente conteggio inaccurato delle maites mediante citometria a flusso. Le cellule THP-1 possono fagocitare l'emina, quindi gli aggregati di maites ed emina possono anche essere ceto.

Pertanto, se l'emina non viene rimossa, il potenziale opsonizzante del plasma in esame verrà sovrastimato. Colorare i maites raccolti con 10 microgrammi per millilitro di bromuro di ahy a temperatura ambiente, protetti dalla luce. Dopo 30 minuti, centrifugare i maites, scartare il soprannatante in un contenitore per rifiuti appropriato e lavare il pellet di maites con quattro millilitri di mezzo THP uno per pellet di maites.

Quindi risospendere le cellule in 15 millilitri di mezzo TP1 protetto dalla luce. Per quantificare le MAIT mediante citometria a flusso, contare le MAIT in diluizioni di uno a 100, uno a 50 e uno a 25.

Per prima cosa, distribuire rispettivamente 940, 930 e 910 microlitri di PBS più BSA in tre provette fax diverse e aggiungere 10, 20 e 40 microlitri di maites purificati in ciascuna provetta. Successivamente, vortexare le perle per il conteggio a temperatura ambiente per 30 secondi, quindi aggiungere 50 microlitri delle perle in ciascuna provetta fax contenente i maites diluiti. Eseguire i tre campioni di maites diluiti su un citometro a flusso dotato di un laser a 488 nanometri, impostando una finestra rigorosa per i maites in base alla doppia fluorescenza di bromuro di aterio e GFP, e raccogliere le perle in un canale separato acquisendo eventi fino a quando non sono state raccolte 2000 perle.

Per quantificare il numero di maites in ogni diluizione, calcolare la media delle tre misurazioni della concentrazione di maites. Successivamente, risospendere i maites a una concentrazione di otto per 10 alla sesta maites per millilitro in mezzo THP uno per garantire un rapporto finale di quattro maites per cellula THP uno al fine di misurare la fagocitosi dei maites. Innanzitutto, formare un pellet di un numero sufficiente di cellule THP uno per il saggio e risospendere le cellule a 6,7 per 10 alla quinta cellule per millilitro in mezzo THP uno.

Successivamente, aggiungere 150 microlitri di cellule THP-1 per pozzetto, in triplicato per ogni condizione da testare, in una piastra a 96 pozzetti fondo rotondo bloccata con FCS, per ottenere una concentrazione finale di 105 cellule per pozzetto. Collocare la piastra nell'incubatore fino al momento dell'aggiunta delle MAIT. Quindi, aggiungere 150 microlitri delle MAIT isolate a una concentrazione di 8 × 106 cellule per millilitro per pozzetto in una piastra separata a 96 pozzetti fondo rotondo bloccata con FCS, utilizzando un pozzetto per ogni condizione da testare.

Aggiungere 10 microlitri di campioni di plasma diluiti preparati in ciascun pozzetto della piastra di miscelazione, mescolando accuratamente per garantire una soluzione omogenea. Successivamente, aggiungere 50 microlitri della soluzione di plasma maites in ciascun pozzetto della piastra THP uno, in triplice replicato per ciascun campione di plasma da testare. Mescolare bene i campioni, quindi incubare le colture cellulari in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius in atmosfera di anidride carbonica al 5%.

Dopo 40 minuti, centrifugare i campioni in una centrifuga preraffreddata per arrestare la fagocitosi. Quindi lavare le cellule due volte in tampone fax freddo dopo il secondo lavaggio. Fissare le cellule in 90 microlitri di fissativo fax e lasciarle sul ghiaccio.

Proteggere dalla luce fino all'acquisizione. Lo stadio di maturazione dei parassiti prima del trattamento con E 64 è fondamentale per generare maites racchiusi da membrana. I parassiti devono essere di grandi dimensioni, quasi riempire completamente il globulo rosso e mostrare una colorazione a macchie dei gems.

L'aggiunta di E 64 in questa fase produrrà maites racchiusi in membrana dopo un'incubazione di sei-dieci ore. Se E 64 viene aggiunto in anticipo a parassiti allo stadio di trofozoiti, i maites racchiusi in membrana non verranno generati. Se E 64 viene aggiunto in ritardo, la rottura di schon schon non viene inibita.

È richiesto un elevato livello di sincronia del parassita. In caso contrario, dopo il trattamento con E 64, si osserverà una gamma di tutti e tre gli esiti descritti. La misurazione della fagocitosi mediante la fluorescenza del bromuro di aum consente una risoluzione superiore della fagocitosi del parassita rispetto alla sola fluorescenza GFP. L'aumento del rapporto tra maites e cellule TP uno determina un incremento dell'adesione dei maites alle cellule THP uno.

In assenza di anticorpi specifici per le MAITE, l'aumento del rapporto tra cellule MEITE e cellule THP-1 determina anche un incremento della fagocitosi compreso tra lo zero e il 78%. L'opsonizzazione delle MAITE è stata osservata utilizzando campioni di plasma della Papua Nuova Guinea a un rapporto di quattro a uno tra MAITE e cellule THP-1. Questi dati mostrano esempi dei quattro quartili delle risposte acide a PHA di quattro individui rappresentativi della Papua Nuova Guinea. È stato dimostrato che gli anticorpi opsonizzanti misurati mediante questo saggio si associano all'immunità clinica contro la malaria durante il tentativo di questa procedura.

I punti chiave da ricordare per garantire un'esecuzione corretta della citosi PE consistono nell'utilizzare parassiti altamente sincronizzati per ottenere maiti completamente maturi e integri, e nel mantenere in modo appropriato le colture cellulari di THP-1. La tecnica per la purificazione dei maiti descritta in questo protocollo può essere adattata a qualsiasi applicazione che richieda maiti di elevata qualità, come marizzazione, saggi di invasione, proteomica o sierologia. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il metodo E-64 per purificare i maiti e per studiare gli anticorpi opsonizzanti misurando la fagocitosi da parte delle cellule THP-1.