Name: Trasferimento Gene vascolare da stent metallico superfici utilizzando Adenoviral Vettori Tethered tramite idrolizzabili Cross-linker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Impara a impiantare uno stent eluente geni nell'arteria carotide comune di ratti da laboratorio per valutare l'espressione del transgene luciferasi nel tempo. Questo metodo combina terapia genica e biologia vascolare.

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da rivelare.

<ol><li>Boeckle, S., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+targeted+gene+delivery%3A+chemical+modification+of+viral+vectors+and+synthesis+of+artificial+virus+vector+systems%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems.</a> AAPS J. 8, E731-E742 (2006).</li>
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<li>Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+and+fibrin+hydrogels+with+concentrated+DNA%2FPEI+polyplexes+for+local+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery.</a> J Control Release. 153, 255-261 (2011).</li>
<li>Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+biomaterial+systems+to+enhance+viral+vector+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery.</a> Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).</li>
<li>Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+by+surface+immobilization+of+plasmid+to+tissue-engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds.</a> Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).</li>
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</ol>

Lo sviluppo del protocollo e gli studi presentati in questo documento sono stati supportati in parte dalle sovvenzioni per lo sviluppo degli scienziati dell'American Heart Association (I.F. 0735110N e M.C. 10SDG4020003), dalla sovvenzione HL 72108 (R.J.L.) del National Heart, Lung, and Blood Institute degli Stati Uniti e dal National Heart, Lung, and Blood Institute T32 007915 (SPF). I cateteri per angioplastica sono stati gentilmente donati da NuMED (Hopkinton, NY). Gli autori desiderano ringraziare l'assistenza di segreteria della signora Susan Kerns.

<html> Il protocollo presentato descrive un metodo operativo per substrato mediata consegna genico ottenuto attraverso l&#39;attaccamento reversibile di vettori adenovirali per senza cappotto superfici in acciaio inox. Mentre sviluppato per lo scopo specifico della terapia genica basata stent-di restenosi vascolare, questa tecnica ha applicazioni molto più ampie nei settori dei biomateriali, protesi biomedicali e la terapia genica. Anche se gli studi presentati sono esclusivamente utilizzato ...

L&#39;efficacia della terapia genica come modalità terapeutica è ostacolata dalla capacità di targeting poveri di vettori di terapia genica 1,2. La mancanza di risultati di targeting propri in livelli sub-terapeutici di espressione del transgene nella posizione di destinazione e porta a una vasta diffusione dei vettori di organi non bersaglio 3, comprese quelle responsabili per il montaggio risposte immunitarie contro sia il vettore e codificati prodotto terapeutico 4, 5. Un potenziale significa compensare la promiscuità di trasduzione e di promuovere il targeting è quello di introdurre vettori genetici nella posizione desiderata in una forma che impedisce la loro libera diffusione attraverso il sangue e la linfa. Tipicamente, tali sforzi si basano su un sistema di consegna locale iniettabili comprendenti sia di vettori virali o non virali mescolati con fibrina, collagene o acido ialuronico matrici di idrogel 6-10 che sono in grado di transitoriamente sostengono vettori genetici nel sito di iniezione intrappolando fisicamente them in una rete polimerica. Un altro paradigma generalmente accettato per la terapia genica localizzata utilizza immobilizzazione di vettori genetici sulla superficie dei dispositivi protesici impiantati 11,12. Impianti medici permanenti (endovascolari, bronchiali, stent urologici e gastrointestinali, pacemaker, articolazioni artificiali, maglie chirurgici e ginecologici, ecc.) Sono utilizzati ogni anno in decine di milioni di pazienti 13. Mentre generalmente efficace, questi dispositivi sono inclini a complicazioni che non sono adeguatamente controllati dalla pratiche mediche attuali 14-17. Dispositivi protesici impiantabili presentano un&#39;opportunità unica per fungere da piattaforme di proxy per il trattamento localizzato la terapia genica. Dal punto di vista farmacocinetico, la superficie derivatizzazione di protesi mediche con dosi relativamente basse di ingresso di vettori genici risultati nel raggiungimento sia alte concentrazioni locali di vettori genetici sulla interfaccia impianto / tessuto e rallentare la cinetica di their eliminazione da questa posizione. Come conseguenza di residenza protratto e migliorato assorbimento da parte della popolazione di cellule bersaglio, vettore immobilizzazione minimizza propagazione del vettore gene. Così l&#39;inoculazione involontaria di tessuti non bersaglio è ridotta. Tethering superficie di vettori genici sui biomateriali impiantabili (anche definito come substrato mediata consegna del gene o la consegna del gene fase solida) è stato implementato in colture di cellule animali e gli esperimenti utilizzando sia specifica (antigene-anticorpo 18-20, avidina-biotina 21,22) e 23-26 (a pagamento, di van der Waals) interazioni non-specifiche. L&#39;attacco covalente di vettori per la superficie del dispositivo impiantato è stata precedentemente considerata non funzionale fin troppo forti legami con la superficie precludono vettore internalizzazione dalle cellule bersaglio. Recentemente è stato dimostrato che questa limitazione può essere superata mediante l&#39;uso di spontaneamente idrolizzabile reticolante usato come tetlei tra la superficie metallica modificata dello stent e del capside proteine ​​del vettore adenovirale 27,28. Inoltre, il tasso di rilascio vettoriale e decorso di espressione del transgene in vitro e in vivo possono essere modulati con l&#39;uso di idrolizzabili reticolanti espongono diverse cinetiche di idrolisi 28. Il presente lavoro fornisce un protocollo dettagliato per il legame covalente reversibile di vettori adenovirali per superficie metallica attivato e introduce un setup sperimentale utile per lo studio successivi eventi di trasduzione in vitro nel muscolo liscio colto e cellule endoteliali e in vivo nel modello di ratto di stent carotideo angioplastica .

<table><tbody><tr><td>316 dischi a rete in acciaio inossidabile</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>E200-SS</td><td></td></tr><tr><td>Generico stent in acciaio inossidabile di grado 304</td> Ordine <td>personalizzato</td><td></td><td>Laserage</td></tr><tr><td>AdeGFP</td><td>Università della Pennsylvania Vector Core</td><td>AD-5-PV0504</td><td></td></tr><tr><td>AdLuc</td><td>University of Pennsylvania Vector Core</td><td>AD-5-PV1028</td><td></td></tr><tr><td>AdEMPTY</td><td>University of Pennsylvania Vector Core</td><td>A858</td><td></td></tr><tr><td>Cy3(NHS)2</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23000</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose 6B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6B100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Piastre UV a 96 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimetria Piastre a 96 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari a 96 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato (TCEP)</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>20490</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>20290</td><td></td></tr><tr><td>sulfo-LC-SPDP</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>21650</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofluorimetro</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>SpectraMax Gemini EM</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore con agitatore orbitale</td><td>VWR</td><td>1575R</td><td></td></tr><tr><td>Forno a flusso d'aria orizzontale</td><td>Shel Lab</td><td>1350 FM</td><td></td></tr><tr><td>Centra-CL2 centrifuga&nbsp;</td><td>International Equipment Company</td><td>426</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore digitale a vortice</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE300 microscopio a fluorescenza</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Telecamera CCD TE300</td><td></td></tr><tr><td>DC 500</td><td>Sistema PCR in</td> tempo reale Leica <td>DC-500</td><td></td></tr><tr><td>7500</td><td>Biosistemi applicati</td><td>non disponibile</td><td></td></tr><tr><td>Stazione di bioluminescenza dello spettro IVIS</td><td>Perkins-Elmer</td><td>non disponibile</td><td></td></tr><tr><td>Sale dipotassico EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P</td><td></td></tr><tr><td>Frazione di albumina sierica bovina V (BSA)</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Dumont pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>A10 linea cellulare</td><td>ATCC</td><td>CRL-1476</td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali dell'aorta bovina</td><td>Lonza</td><td>BW-6002</td><td></td></tr><tr><td>Luciferina, sale di potassio</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1Ge</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>PBS senza calcio e magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina/streptomicina</td><td>Gibco</td><td>11540-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto glucosio</td><td>Cellule Corning</td><td>gro 10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Kit micro DNA</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>Power Sybr Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp</td><td>Biosystems applicata</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>Film adesivo ottico MicroAmp</td><td>Biosystems applicati</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Cephazolin&nbsp;</td><td>Apotex</td><td>non disponibile</td><td></td></tr><tr><td>Loxicom (Meloxicam)</td><td>Norbrook</td><td>non disponibile</td><td></td></tr><tr><td>Eparina sodica</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>non disponibile</td><td></td></tr><tr><td>Ketavet (Ketamina)</td><td>VEDCO</td><td>non disponibile</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xilazina)&nbsp;</td><td>Lloid</td><td>non disponibile</td><td></td></tr><tr><td>Forano (isoflurano)&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>non disponibile</td><td></td></tr><tr><td>Pinze curve per iride Moria</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Pinze curve per Graefe extrafini</td><td>Strumenti per le scienze Fine</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Dumont #5</td><td>Strumenti per le scienze Fini</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas Forbici per le</td><td>scienze fini</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per le scienze fini - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Sutura Vicryl (5-0)</td><td>Ethicon</td><td>J385</td><td></td></tr><tr><td>Filo di sutura (seta 4/0)&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>Clip per sutura Michel</td><td>Fine Science Tools</td><td>12040-02</td><td></td></tr><tr><td>Dilatatore per ferite (Lancaster eye speculum)</td><td>KLS Martin</td><td>34-149-07</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore a perline calde</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Applicatore di clip per sutura Michel</td><td>Fine Science Tools</td><td>112028-12</td><td></td></tr><tr><td>Insyte Autoguard 24 G IV catetere</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>2F Catetere Fogarty</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>120602F</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in teflon</td><td>Vention</td><td>041100BST</td><td></td></tr><tr><td>Catetere PTA</td><td>NuMed</td><td>ordine</td><td></td>personalizzato</tr><tr><td>Tamponi di garza</td><td>Kendall Healthcare</td><td>9024</td><td></td></tr><tr><td>Applicatori in cotone</td><td>Solon Manufacturing</td><td>WOD1003</td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Saline Baxter</td><td>281321</td><td></td></tr><tr><td>10 ml (Luer-Lok)</td><td>Siringa Beckton-Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 ml (Luer-Lok)</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Clippers con lama #40</td><td>Oster&nbsp;</td><td>78005-314</td><td></td></tr><tr><td>Nastro chirurgico transporoso</td><td>3M</td><td>MM 15271</td><td></td></tr><tr><td>Puralube unguento veterinario</td><td>Pharmaderm</td><td>non disponibile</td><td></td></tr></tbody></table>

trasferimento gene vascolare da stent metallico superfici utilizzando adenoviral vettori tethered tramite idrolizzabili cross-linker

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

In-stent restenosi presenta una complicazione maggiore di procedure di rivascolarizzazione basato stent-ampiamente utilizzati per ristabilire il flusso di sangue attraverso segmenti criticamente socchiusi delle arterie coronariche e periferiche. Stent endovascolari capaci di rilascio regolabile di geni con attività anti-restenotico può presentare una strategia alternativa di utilizzare attualmente stent a rilascio di farmaco. Per raggiungere traduzione clinica, gli stent a eluizione di geni devono presentare cinetica prevedibili del gene vettore di rilascio dello stent-immobilizzato e site-specific trasduzione dei vasi, evitando una eccessiva risposta infiammatoria tipicamente associati con i rivestimenti polimerici utilizzati per intrappolamento fisico del vettore. Questo documento descrive una metodologia dettagliata per il tethering senza cappotto di vettori genici adenovirali di stent sulla base di un legame reversibile delle particelle adenovirali per polyallylamine bifosfonati (PABT) -Modified superficie in acciaio inox con idrolizzabili reticolanti (HC). Una famiglia dibifunzionale HC (ammina e nonil fenolo tiolo-reattiva), con una t media mezzo di idrolisi in-catena compresa tra 5 e 50 giorni sono stati usati per collegare il vettore con lo stent. La procedura vettore immobilizzazione viene tipicamente effettuata entro 9 ore e comprende diverse fasi: 1) incubazione dei campioni di metallo in una soluzione acquosa di PABT (4 ore); 2) deprotezione dei gruppi tiolici installati in PABT con tris (2-carbossietil) fosfina (20 min); 3) l&#39;espansione del tiolo capacità reattiva della superficie metallica facendo reagire i campioni con polietileneimmina derivatizzati con pyridyldithio (PDT) gruppi (2 ore); 4) la conversione di gruppi di PDT per tioli con ditiotreitolo (10 min); 5) modifiche di adenovirus con HC (1 ora); 6) la purificazione di particelle adenovirali modificate per dimensione-esclusione cromatografia su colonna (15 min) e 7) immobilizzazione di particelle adenovirali tiolo reattivo sulla superficie di acciaio tiolati (1 ora). Questa tecnica ha ampia applicabilità potenziale oltre stent,facilitando ingegneria delle superfici di dispositivi bioprotesi per migliorare la loro biocompatibilità attraverso la consegna del gene substrato mediata alle cellule di interfacciamento del materiale estraneo impiantato.

Esperimenti di vettore di uscita Tethering di vettori adenovirali alla superficie degli impianti, compresi i dispositivi interventistici, come gli stent endovascolari, approssima il vettore al sito di malattia, in parte ovviando alla mancanza di mirati fisica vettori. Tuttavia, per poter ottenere effetti terapeutici attraverso la trasduzione del tessuto bersaglio, il vettore deve essere rilasciato dalla superficie (Figura 2). L&#39;uso di idrolizzabili retic...

Questi studi riportano l'attaccamento reversibile di vettori genici adenovirali a superfici metalliche senza rivestimento di stent e dischi a rete modello. Il rilascio prolungato di particelle virali competenti per la trasduzione, subordinato all'idrolisi dei reticolanti utilizzati per l'immobilizzazione del vettore, determina un'espressione transgenica sito-specifica duratura nelle cellule vascolari e nelle arterie con stent.

Trasferimento Gene vascolare da stent metallico superfici utilizzando Adenoviral Vettori Tethered tramite idrolizzabili Cross-linker

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

L'obiettivo generale di questa procedura è impiantare uno stent eluente un gene nell'arteria carotide comune di un ratto da laboratorio e determinare l'entità e la localizzazione dell'espressione del transgene risultante nel tempo. A tale scopo, si pratica un'arteriotomia nel ramo della carotide esterna per ottenere l'accesso vascolare all'arteria carotide comune. Un catetere Fogarty di due French gonfiato viene introdotto attraverso l'arteria carotide comune per denudare l'endotelio e danneggiare il strato mediale.Un ulteriore stent eludente geni viene quindi montato su un catetere per angioplastica inserito nel segmento medio dell'arteria carotide comune danneggiata dal palloncino e successivamente posizionato per determinare l'espressione della luciferasi arteriosa. La luciferina formulata insieme al gel onic viene applicata alla regione perivascolare ed eseguita l'immagine di bioluminescenza. Alla fine, si possono ottenere risultati che permettono di confrontare diverse formulazioni di stent eludenti geni in relazione all'entità e alla durata della trasduzione del tessuto vascolare.Il vantaggio di prevenire il restringimento immediato e la trombosi dello stent mediante terapia genica consiste nel fatto che rappresenta il modo più diretto per monitorare l'espressione genica esogena da vettori virali e arterie con stent. Mentre la nostra strategia di ancoraggio dei vettori adenovirali agli stent è del tutto comprensibile, la descrizione testuale delle sfumature della procedura chirurgica per l'implantazione di stent nei ratti è chiara. Quando dimostrato visivamente, preparare e aggiungere gli stent eludenti come descritto nel documento scritto allegato.Conservare le stent derivati dal virus in PBS sterile a quattro gradi Celsius per non più di 24 ore prima dell'uso. Dopo aver anestetizzato i ratti maschi Sprague Dolly, determinare la profondità dell'anestesia mediante la risposta alla compressione della zampa, depilare la regione del collo e del torace superiore. Applicare un unguento oftalmico veterinario per prevenire l'essiccazione della sclera, somministrare antibiotico, analgesico e soluzione salina.Successivamente, cateterizzare la vena della coda con un catetere da 24 gauge ed eseguire l'amministrazione asettica di eparina. Preparare la regione del collo e del torace superiore con povidone ed etanolo. Quindi posizionare l'animale in posizione supina con la testa rivolta verso l'operatore.Quindi posizionare i campi sterili utilizzando un bisturi. Eseguire un'incisione mediana attraverso la cute e la fascia del collo. Utilizzare tecniche di dissecazione ottusa per isolare l'arteria carotide esterna sinistra.L'aspetto più critico di questa procedura è la preparazione dell'arteria per la nostra ectomia. Per fare ciò, isolare l'arteria carotide esterna e pulirla da ogni connettivo. Legare l'arteria carotide esterna nel punto più distale accessibile.Quindi applicare una ligatura temporanea scorrevole in seta 4-0 all'origine dell'arteria carotide interna. Successivamente, utilizzando forbici a molla, praticare un'incisione arteriosa di due millimetri nell'arteria carotide esterna sinistra attraverso l'incisione. Inserire un catetere Fogarty da due French nell'arteria carotide comune.Insufflare la punta del catetere con soluzione fisiologica. Quindi, per eliminare l'endotelio, passare il palloncino gonfiato tre volte dall'arco aortico alla biforcazione carotidea. Far scivolare un pezzo di tubo sopra il catetere Fogarty e all'interno dell'arteria carotide comune.Rimuovere il catetere Fogarty e chiudere a crimpare, quindi aggiungere lo stent Luke Derivate sul palloncino di un catetere da angioplastica di diametro 1,5 millimetri. Inserire lo stent attraverso il tubo in teflon e avanzarlo fino al segmento medio dell'arteria carotide comune. Evitare di strofinare lo stent contro la parete del tubo o del vaso.Per posizionare lo stent, collegare il catetere angioplastico a un manometro gonfiatore e applicare una pressione di 12 atmosfere per 30 secondi. Rimuovere il catetere angioplastico. Successivamente, legare l'arteria carotide esterna a monte del sito di arteriotomia e rimuovere il legame temporaneo sull'arteria carotide interna.Riparare la ferita operatoria per strati con punti di sutura in Vicryl 4-0 continui e applicare graffe sulla cute. Posizionare l'animale su un tappetino riscaldante per il recupero finché non sarà in grado di deambulare, quindi restituirlo alla sua gabbia isolata.Sebbene gli animali postoperatori non mostrino tipicamente segni di dolore o disagio oltre le prime 12 ore successive all'intervento, si consiglia di estendere la terapia con meloxicam per un periodo di 72 ore. Punti temporali compresi tra un giorno e tre settimane dopo il posizionamento dello stent. Prepararsi all'immagine bioluminescente aprendo il software Living Image versione 4.2 o successiva per l'apparato IVIS Spectrum.L'inizializzazione dell'hardware di imaging richiede circa 10 minuti. Successivamente, preparare una miscela di 50 milligrammi per millilitro di Lucifer in PBS e F1 27 al 25% in PBS, uno a quattro, volume su volume, e conservarla sul ghiaccio. La soluzione deve essere viscosa.Dopo aver anestetizzato il ratto con isoflurano e aver verificato la profondità dell'anestesia, rimuovere in modo asettico le graffette chirurgiche. Preparare la sede e riaprire la ferita operatoria. Somministrare tre milligrammi per chilogrammo di meloxicam per via sottocutanea utilizzando una dissezione ottusa, riaccedere all'arteria carotide comune sinistra e separarla dal nervo vago e dal tessuto connettivo adiacente.Utilizzando una pipetta, applicare 200 microlitri della miscela fredda di luciferina direttamente sul segmento esposto dell'arteria carotide comune. A contatto con il tessuto a 37 gradi Celsius, la soluzione dovrebbe gelificare. Successivamente, posizionare l'animale in posizione supina nella camera di imaging dell'apparato ivus spectrum e applicare una maschera facciale per mantenere l'anestesia con isoflurano.Quindi nella finestra del pannello di controllo di acquisizione del software, selezionare la posizione B, che corrisponde a una distanza tra la telecamera e l'oggetto di 6,6 centimetri, dal menu a tendina selezionare il binning e impostare il fattore di binning su medio. Quindi nella casella dell'altezza del soggetto, inserire 2,5 centimetri nella casella del tempo di esposizione. Scegliere minuti come unità di tempo e selezionare un valore numerico di due.Regolare la posizione dell'animale nella camera in modo che il collo e la parte superiore del torace del ratto siano completamente contenuti nel quadrato proiettato sul fondo della camera. Tre minuti dopo l'applicazione del gel luciferinico, fare clic sul pulsante di acquisizione sullo schermo per iniziare l'acquisizione delle immagini. Il tempo di acquisizione può variare da uno a sei minuti a seconda dell'intensità del segnale prevista.Dopo aver acquisito l'immagine, utilizzare una siringa per lavare via il gel con soluzione salina e tamponare lo spazio periarterioso con garza sterile e applicatori di cotone. Chiudere la ferita con punti di sutura in Vicryl e applicare punti metallici sulla cute. Quindi permettere all'animale di riprendersi e riportarlo nella sua gabbia.Come in precedenza, ripetere la procedura di imaging in un momento successivo. Punti per studiare l'andamento temporale dell'espressione arteriosa indotto dai vettori adenovirali immobilizzati sullo stent per somministrazione sistemica. Preparare una soluzione di 50 milligrammi per millilitro di Lucifer in PBS dopo aver anestetizzato e preparato l'animale.Come in precedenza, cateterizzare la vena della coda con un catetere da 24 gauge e fissarlo posizionando un pezzo di nastro chirurgico tra la coda e il catetere. Quindi sollevare i bordi del nastro e avvolgerli più volte attorno alla coda. Iniettare un millilitro della soluzione attraverso il catetere in un intervallo di dieci secondi, un minuto dopo l'iniezione.Avviare l'acquisizione delle immagini. Come in precedenza, si noti che una velocità di iniezione superiore ai 10 secondi può provocare attività epilettica e arresto respiratorio per esaminare gli effetti potenziali legati all'uso di diversi cross linker idrolizzati. Sulla trasduzione arteriosa, gli animali sono stati impiantati con stent Luke eludenti e sottoposti a imaging a uno e otto giorni dall'impianto dello stent.Come si può osservare qui a un giorno dall'impianto dello stent, gli animali trattati con lo stent add, Luke formulato con crosslinker ad idrolisi rapida mostrano tipicamente il segnale di luminescenza più elevato; i ratti che hanno ricevuto lo stent con crosslinker ad idrolisi intermedia presentano il successivo segnale di luminescenza più alto, seguiti dagli stent formulati con crosslinker ad idrolisi lenta. Nessun segnale percettibile è stato osservato nel gruppo di ratti impiantati con stent preparati utilizzando crosslinker non idrolizzato ancorato ad add, Luke. Questo sottolinea l'importanza di un rilascio ininterrotto del vettore dallo stent per una efficace trasduzione del tessuto vascolare.All'ottavo giorno, l'intensità media dell'espressione della luciferasi con stent formulati con RHC è diminuita di diversi ordini di grandezza. Quando le intensità del primo e dell'ottavo giorno sono state rappresentate singolarmente su scala logaritmica, si è osservato un aumento di 1,4 volte con stent formulati con crosslinker idrolizzato in modo intermedio e un aumento di 1,8 volte con stent formulati con crosslinker idrolizzato lentamente. Questo risultato è coerente con l'ipotesi di una trasduzione vascolare più duratura mediante stent eluenti geni che mostrano una cinetica più lenta di rilascio del vettore dalla superficie dello stent.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come impiantare uno stent add Luke alluding nell'arteria carotidea posteriore e di come effettuare l'immagine dell'espressione vascolare conseguente della luciferasi una volta padroneggiata l'impiantazione dello stent. L'intervento chirurgico di posizionamento può richiedere da 20 a 25 minuti, mentre la procedura di imaging può richiedere da 10 a 15 minuti. Utilizziamo la stessa tecnica per studiare gli effetti antiotici di formulazioni di terapia genica e farmaci non genetici determinando il grado di ostruzione arteriosa.Due settimane dopo il posizionamento dello stent.

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Un metodo di trasferimento genico per il trattamento dell'insufficienza cardiaca ischemica è descritta utilizzando un modello suino di infarto miocardico. Il nostro metodo semplice e riproducibile ci permette di valutare rapidamente l'efficacia dei trasferimenti di geni diversi, con un modo molto semplice e riproducibile.

Trasferimento Genico per insufficienza cardiaca ischemica in un modello preclinico

Descriviamo il metodo di cellule staminali programmazione di iperespressione fattori terapeutici per angiogenesi utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. Processi descritti includono sintesi dei polimeri, trasfezione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo in vitro, e convalida l'efficacia delle cellule staminali programmato per promuovere l'angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori murino.

Cellule staminali per la programmazione terapeutica angiogenesi Uso biodegradabili polimerico Nanoparticelle

Un esempio di terapia genica adenovirale nelle cornee umane in coltura di organi diabetici viene presentato verso la normalizzazione della guarigione ritardata delle ferite e l'espressione marcatamente ridotta dei marcatori delle cellule staminali epiteliali in queste cornee. Descrive anche l'ottimizzazione di questo processo in colture epiteliali limbari arricchite con cellule staminali.

Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal

Questo metodo è quello di introdurre un transgene nell'endotelio delle arterie carotiche coniglio. Introduzione del transgene permette di valutare il ruolo biologico del prodotto transgene in arterie normali o modelli di malattia. Il metodo è anche utile per misurare l'attività di sequenze regolatrici del DNA.

In Vivo Trasferimento del gene per l'endotelio dell'arteria carotica comune di coniglio

Questo metodo descrive il posizionamento degli innesti della vena di interposizione in conigli, la trasduzione degli innesti e il raggiungimento dell'espressione del transgene durevole. Questo permette l'indagine su ruoli fisiologici e patologici di transgeni e loro prodotti proteici nelle vene innestate e il test di terapie geniche per la malattia dell'innesto della vena.

Un modello del coniglio di espressione del Transgene durevole nella vena giugulare di innesti di interposizione dell'arteria carotica comune

Questo protocollo è destinato per descrivere la consegna di porcino dell'epatocita isolamento ed ex vivo del gene per curare modelli di malattie metaboliche tramite trapianto autologous della cellula. Anche se questo particolare modello gode di vantaggi unici che favoriscono la riuscita terapia, l'applicazione è una Fondazione pertinente all'indirizzo di indicazioni e altre malattie.

Lentivirali terapia genica mediata da vettore di epatociti Ex Vivo per trapianto autologo nei suini

Il protocollo descritto qui consente ai ricercatori di modificare specificamente capsidi adenovirus su siti selezionati dalla chimica semplice. Schermato adenovirus vettori particelle e gene bersagliamento trasferimento vettori possono essere generati, e interazioni ospite vettoriale possono essere studiati.

Combinate le modifiche genetiche e chimiche del Capsid di vettori basati su Adenovirus Gene Transfer per schermatura e Targeting

Vengono descritti metodi per la generazione di grandi quantità di adenovirus ricombinanti, che possono quindi essere utilizzati per trasdurre l'urotelio nativo dei roditori consentendo l'espressione di transgeni o la downregulation di prodotti genici endogeni.

Espressione di transgeni nell'urotelio vescicale nativo mediante trasduzione mediata da adenovirus

Questo protocollo descrive come l'iniezione intrasplenica di small hairpin RNA erogato da AAV8 raggiunga la stessa efficienza di knockdown genico nel fegato dell'iniezione della vena porta, rappresentando una procedura più semplice con mortalità e complicanze perioperatorie e postoperatorie molto più basse.

Knockdown genico efficiente nel fegato tramite iniezione intrasplenica di piccolo RNA a forcina veicolato dal virus adeno-associato sierotipo 8 (AAV8)

Qui, viene presentato un protocollo per l'impianto di un innesto vascolare di ingegneria tissutale nell'arteria carotide di topo utilizzando la tecnica della cuffia, fornendo un modello animale adatto per studiare i meccanismi di rigenerazione del tessuto vascolare.

Impianto di innesto vascolare di ingegneria tissutale nell'arteria carotide di topo tramite tecnica della cuffia

Impara a impiantare uno stent eluente geni nell'arteria carotide comune di ratti da laboratorio per valutare l'espressione del transgene luciferasi nel tempo. Questo metodo combina terapia genica e biologia vascolare.

Trasferimento Gene vascolare da stent metallico superfici utilizzando Adenoviral Vettori Tethered tramite idrolizzabili Cross-linker (Video) | JoVE Journal

Trasferimento Gene vascolare da stent metallico superfici utilizzando Adenoviral Vettori Tethered tramite idrolizzabili Cross-linker

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