Name: In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 8 s
Description: Impara a tracciare cloni ematopoietici in vivo con marcatura fluorescente a cinque colori utilizzando microscopia confocale e multiphoton. Questo metodo consente di studiare l'evoluzione clonale nel midollo osseo.

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Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Ricerca Intramurale del National Heart, Lung, Blood Institute del National Institutes of Health. Ringraziamo Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Amburgo, Germania) per aver fornito i cinque plasmidi vettori LeGO; Christian A. Combs e Neal S. Young (NHLBI, NIH) per le discussioni, il supporto e l'incoraggiamento durante questo studio, e Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) per l'assistenza con le iniezioni della vena caudale.

Tutti i topi sono stati alloggiati e trattati in conformità con la guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health, e iscritti in un protocollo di cura e uso degli animali NHLBI Comitato approvato. Femmina B6.SJL-Ptprc (d) Pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) e C57BL / 6 topi, 6-12 settimane di vita, sono stati utilizzati come donatore e del ricevente, rispettivamente. Un elenco di materiali, reagenti e attrezzature sono fornite nella tabella 1. 1 Lego trasduzione del mouse HSPCs e Trapianto di Midollo Osseo Eseguire le procedure descritte di seguito in un livello di biosicurezza certificata 2 (BSL-2) Armadio (cappa di coltura di tessuti). <ol><li> Produzione di lego vettori di codifica 5 fps <ol><li> Utilizzare il lentivirali &quot;Gene Ontology&quot; (Lego) plasmidi vettori, ognuno che codifica per una diversa FP di un forte promotore SFFV costitutivo, tra cui lego-CER2 (Cerulean), lego-G2 (EGFP), lego-V2 (Venere), lego-T2 (tdTomato), e lego-C2 (mCherry) gentilmente fornito dal Dr. Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Amburgo, Germania); ora disponibili anche da Addgene 5-7. </li><li> Per produrre vettori LEGO, semi di 5 x 10 6 cellule 293T in 10 piatti cm (utilizzare 12 piatti per ogni vettore) 24 ore prima della trasfezione in 8 ml di I10 supporti (IMDM supplementato con 10% FCS e glutammina / penicillina / streptomicina). </li><li> Trasfezione le cellule con fosfato di calcio con le raccomandazioni del kit CAPHOS leggermente modificati: <ol><li> Per ogni mix piatto 15 mg Lego vettore, 12 mg pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 mg PREV-TAT, e 1 mg plasmidi pMD2.G-VSV-G in presenza di 50 microlitri 2,5 M CaCl 2, e aggiungere acqua per produrre un volume totale di 500 microlitri. </li><li> Plasmidi di DNA precipitato con 500 ml di 2x HeBS (HEPES-Buffered Saline) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente prima di aggiungere ad ogni piatto di cellule 293T. </li><li> Incubare le cellule per6 ore a 37 ° C 5% di CO 2 incubatore; rimuovere il supporto e aggiungere fresco cultura mediatica 6 ore dopo la trasfezione. </li></ol></li><li> Raccogliere surnatanti di coltura contenente particelle lentivirali da ogni piatto, ogni giorno, per 3 giorni. Ogni collezione surnatante giorno successivo aggiungere media I10 fresco a ogni piatto. <ol><li> Filtrare 0,22 micron pori, piscina e concentrarsi surnatanti di ultracentrifugazione su un rotore SW28 per 2 ore a 71.900 xg e 4 ° C. </li><li> Risospendere il surnatante in 1 ml di StemSpan media. Aliquota le scorte lentivirali in 200 ml e conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Titolazione di particelle lentivirali Determinare il titolo di particelle vettoriali Lego in surnatanti raccolti attraverso la quantificazione di trasduzione unità / ml utilizzando cellule NIH3T3. I titoli permettono di calcolare il volume di ciascun supernatante vettoriale necessaria per provocare la molteplicità relativa desiderata di infezione (MOI) per porta sperimentalecellule. <ol><li> Tavola 5 x 10 4 NIH3T3 cellule per pozzetto (12-pozzetti) in 2 ml di mezzi I10 un giorno prima della titolazione. </li><li> Preparare diluizioni seriali 5-fold di surnatanti vettoriali in mezzi I10 integrato con solfato di protamina (4 mg / ml è 1,000x). </li><li> Rimuovere il supporto dalle cellule, e sostituirlo con 500 ml di diluizioni surnatante contenente l&#39;equivalente di 2, 0,8, 0,32 e 0,128 ml di virus concentrati. </li><li> Determinare il numero (n) di cellule per pozzetto presenti al momento della trasduzione, contando pure un controllo. </li><li> 6 ore dopo la trasduzione, aggiungere 2 ml di media I10 e incubare per 3 giorni a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Raccogliere le cellule da ogni pozzetto usando tripsina-EDTA, e determinare la percentuale di cellule fluorescenti (% FP) mediante citometria a flusso. </li><li> Calcolare il titolo come segue, la media dei titoli ottenuti per ciascun bene (diluizione) con una conseguente FP% tra il 1 e il 50%: titolo (particelle vettore / ml) = nx% FP / volume di surnatante vettore (ml). Calcolare la media dei titoli ottenuti per ciascuna diluizione se la FP% è compreso tra 1 e 50%. </li></ol></li><li> Raccolta delle cellule del mouse, Purificazione, trasduzione, e Trapianti (schematicamente illustrato in Figura 1A adattato da Malide et al. 4). <ol><li> Sacrifica topi donatori da una procedura approvata. Raccolta di midollo osseo da anteriore e posteriore degli arti: sezionare omeri, trovarsi femori e tibie, rimuovere completamente tutto muscoli, legamenti e tessuto in eccesso da ossa, tagliare tutta la fine di ogni osso il più vicino possibile al giunto, e lavare il midollo osseo di l&#39;osso utilizzando un ago G 27-0 su una siringa contenente supporti I10. </li><li> Agglomerare le intere cellule di midollo osseo per 10 min a 500 xg, a 4 ° C e lisare i globuli rossi due volte con 50 ml di tampone ACK. Risospendere le cellule in 10 ml di mezzi I10. </li><li> Purificare (Lin-) cellule progenitrici lignaggio negativi con il kit di lignaggio esaurimento MACS secondo un kit Protoco modificatol: <ol><li> Utilizzare 30 ml di microsfere anti-biotina invece di 10 ml / 10 7 cellule; completare le fasi di lavaggio con i media I2 (IMDM integrato con il 2% FCS) al posto del tampone. </li><li> Inserire una fase di lavaggio tra l&#39;incubazione con Cocktail biotina-anticorpo e l&#39;incubazione con anti-biotina microsfere; ed equilibrare la colonna con I10 posto del tampone. </li></ol></li><li> Culture cellule LIN- per 48 ore ad una densità iniziale di 5 x 10 5 cellule / ml in mezzi StemSpan supplementato con 10 ng / ml di IL-3 murino, 100 ng / ml di IL-11 murina, 100 ng / ml umano Flt-3 ligando, e 50 ng / ml fattore delle cellule staminali murine. </li><li> Trasferimento da 1 a 4 x 10 5 cellule a 12 pozzetti piastre rivestite con RetroNectin e trasdurre con surnatanti Lego, ciascuna ad una molteplicità di infezione (MOI) di 6-7 per ottenere il 50% di efficienza di espressione per ogni FP, in presenza di StemSpan media e citochine dettagliati sopra e 4 mg / ml di solfato di protamina. </li><li> Trasdurre cellulecon ogni vettore Lego singolarmente come descritto al punto 1.3.5 e mescolare le cellule dopo trasduzione (chiamato Mix) o co-trasdurre cellule con tutti i surnatanti 5 Lego vettoriali contemporaneamente (chiamato Co). Rimuovere le cellule 24 ore più tardi, lavare una volta con StemSpan media senza citochine, e risospendere in mezzi StemSpan senza citochine per il trapianto, o trasferirli su supporti fresco con citochine, e di cultura per ulteriori 96 ore prima di microscopia confocale e citometria a flusso. <ol><li> Eseguire trapianto di midollo osseo infondendo trasdotte Lin- HSPCs tramite iniezione in vena della coda 11 monodose Gy destinatari pre-irradiati (6-18 ore prima del trapianto) i destinatari, in un volume di 100 l, ad una dose di cellule per topo corrispondente a 1 cellule -4 x 10 5 Lin- originariamente placcato per la trasduzione. In ogni esperimento, trapianto di un&#39;intera coorte di animali con la stessa popolazione di cellule del midollo osseo del donatore trasdotte. </li><li> Per la caratterizzazione in vitro di trasdotte HSPC, la cultura le cellule per ulteriori 4-5 giorni in StemSpan completato con citochine e analizzare mediante citometria a flusso per efficienza di trasduzione, e al microscopio per la diversità di colore. <ol><li> Sacrificio singoli topi e recuperare tessuti e organi per l&#39;imaging, a vari tempo indica fino a 120 giorni post-trapianto. <ol><li> Spruzzare con etanolo la pelliccia del mouse e incidere la pelle sul lato ventrale evitando capelli diffusione. </li><li> Sezionare e accise secondo le procedure standard della milza, linfonodi poplitei, polmoni, cuore, pelle, tessuto adiposo, muscolo scheletrico, rene, fegato, così come la testa di accesso ai calvaria. </li><li> In alternativa, utilizzare calvaria o impostare una finestra ossea per l&#39;imaging dal vivo più volte nel corso del tempo 2,8,9 o immagine organi superficiali come i nodi della pelle e linfonodi in animale vivo. </li></ol></li><li> Mettere singoli organi in 35 millimetri piastre di coltura numero 0 copertura in vetro a 50-10056, l PBS per l&#39;imaging intatti, senza sezionamento, fissazione o ulteriore lavorazione come descritto al punto 2.5. </li><li> Per l&#39;imaging volumetrico, mantenere gli organi in in PBS freddo fino al momento dell&#39;uso. Per time-lapse imaging procedere immediatamente al di imaging di organi in DMEM, 10% FBS contenenti 20 HEPES mM a 37 ° C </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2 confocale e microscopia a due fotoni e Image Analysis <ol><li> Eseguire immagini di microscopia utilizzando un sistema a cinque canali confocale e multiphoton Leica SP5 dotato di multi-linea Argon, diodo 561 nm, 594 nm HeNe, e HeNe 633 nm laser visibili. Utilizzare in modalità 2-fotone, un femtosecondi pulsata Ti: zaffiro (Ti-Sa) laser, sintonizzabile per l&#39;eccitazione da 680 a 1.080 nm con correzione dispersione. Utilizzare in esperimenti che coinvolgono rosso-spostato PQ (tdTomato e mCherry), un oscillatore parametrico ottico (OPO) laser per estendere la gamma di lunghezze d&#39;onda di uscita fino a 1,030-1,300 nm, in sequenza o simultaneamente con tegli Ti-Sa laser. </li><li> Immagine vari tessuti utilizzando una HCX-IRAPO-L 25X / 0,95 NA obiettivo immersione acqua (WD = 2,5 mm), a-PLAPO CS HC-20X / 0,70 obiettivo NA secco (WD = 0.6 mm), o HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA obiettivo di immersione in acqua (WD = 0.6 mm). </li><li> Ottenere confocale spettri di fluorescenza di raccolta pile lambda (xyλ) della luce emessa in 5 nm-larghezze di banda dello spettro visibile dalle cellule BM trasdotte con un singolo FP Lego vettore, nonché di controllo, non-trapiantato BM. <ol><li> Immagini di processo con il software Leica LAS v2.4.1-AF per creare spettri di riferimento di tutti i 5 fps, nonché di autofluorescenza (Figura 2A). Utilizzando l&#39;individuo spettri FP e la differenza di luminosità fluorescenza (espressa in% di EGFP) di Cerulean (79%), Venere (156%), tdTomato (283%) e mCherry (47%) impostato 5 canali di imaging in sequenza come segue: Cerulean (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venere (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm), e mCherry (594 / 618-670 nm) ( <strong&gt; Figura 2B). </li><li> Convalidare separazione accurata PQ, come le cellule trasdotte con ogni singolo FP sono visibili solo nel canale corrispondente e assente dal resto (Figura 2C). Inoltre, questo approccio multi-canale definito crea un &quot;colorprint&quot; uniche a 5 canali che consente la successiva analisi del colore e il monitoraggio clonale e ha il vantaggio di ridurre i tempi di acquisizione rispetto alle immagini spettrali. </li></ol></li><li> Emissione di fluorescenza separato, in modalità 2-fotone, da alta efficienza specchi dicroici personalizzato e raccogliere con un quattro canali non descanned rivelatore (NDD) come segue: uno specchio dicroico a 568 nm seguito da uno specchio dicroico a 465 nm, seguita da un filtro di emissione 452/45 nm per SHG o autofluorescenza e cerulea, un filtro 525/40 nm di emissione per EGFP o Venere, e uno specchio dicroico 648 nm e 620/60 nm filtro delle emissioni per tdTomato o mCherry. <ol><li> Rivelare informazioni strutturali da microscopia a due fotoni isegnale (SHG) da ossa e del collagene fibrillare (eccitato a 920 nm o 860 nm raccolti in una dispersa posteriore imaging contrasto ntrinsic (come descritto sopra) di autofluorescenza dei tessuti da elastina, NADH, (eccitato a 780 nm), e la seconda armonica generati direzione) 10,11. </li></ol></li><li> Per volume rendering 3D, raccogliere le serie di immagini xyz (tipicamente 1 x 1 x 4 micron 3 dimensioni voxel) lungo l&#39;asse z a 5 micron intervalli su una gamma di profondità (150-300 micron) in tutto il midollo osseo e altri tessuti, su vaste regioni utilizzando la funzione piastrella del software per generare automaticamente i volumi cuciti comprendente un intero fossa sterno, circa 2,5 x 1,2 mm 2 (xy) e 300 micron (z) (figure 2D-2E) e Movie 1. <ol><li> Immagine cranica il midollo direttamente attraverso il cranio, senza sezionamento 2, 8. </li><li> Sezione sterno lungo il piano sagittale (bisezione) e poitrasversalmente al giunto tra 2 sternale fossato e immagine attraverso il taglio faccia 3,4,12 (Panoramica Figura 1B adattato da Takaku et al 3). </li></ol></li><li> Per 4D time-lapse imaging, posizionare asportati recentemente poplitea linfonodi, milza, polmone, o campioni calvaria non tagliata da 35 mm piatti della cultura numero 0 coprioggetti, in 50-100 ml DMEM 10% FBS contenente 20 HEPES mM a 37 ° C e utilizzare 2-fotone Ti-Sa di eccitazione (860 nm) combinata con l&#39;eccitazione confocale (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) e Leica scanner di risonanza (8000 Hz / sec), prendendo z-stack (~ 80 micron) ad intervalli di 20 sec per un massimo di 1 ora. <ol><li> Per simultaneo a tre colori impiego di imaging 2P Ti-Sa sintonizzati a 860 nm contemporaneamente con il laser OPO (sintonizzato a 1.130 nm per tdTomato, o 1.140 nm mCherry) (Movie 2). </li></ol></li><li> Ricostruzione e analisi dei volumi 3D e sequenze temporali 4D <ol><li> Utilizzare Imaris x64 softwsono dati di cellule fluorescenti all&#39;interno del midollo osseo e diversi tessuti e di esportarle come filmati 3D-rotazione versione 7.6, o pacchetti software alternativi per trasformare i-pile di tegole di immagini grezzi in volume rendering (3D), come descritto in precedenza 3,4 (Film 1) step-by-step esempio: <ol><li> In Imaris, Aprite l&#39;immagine z-stack; Selezionare &quot;Superare&quot; per visualizzare la visualizzazione volume 3D. </li><li> Utilizzare &quot;navigare&quot; per alzare il volume intorno a 360 °. </li><li> Selezionare &quot;Animazione&quot; per creare un&#39;animazione; utilizzare fotogrammi chiave per aggiungere viste selezionate, zoom, rotazioni del volume; Visualizzare in anteprima il filmato, modificare come necessario e salvare il file in un formato filmato desiderato (es: avi, mov). </li></ol></li><li> Per la valutazione quantitativa delle cellule e di clone di frequenza 3D, posizioni, dimensioni e distribuzione, ulteriore processo gli z-stack utilizzando i moduli Imaris XT che integrano applicazioni MATLAB spettacolo meas distanzamisurazio- (utilizzando un algoritmo di trasformazione distanza) e cluster analisi, come descritto in precedenza 3,4. Trasforma le sequenze di pile di immagini nel corso del tempo in quattro dimensioni (4D) film volumi rendering con il software x64 Imaris, e utilizzare spot e analisi di superficie per il monitoraggio semiautomatico della motilità cellulare in tre dimensioni utilizzando algoritmi di movimento autoregressivi. </li><li> Eseguire l&#39;analisi multispettrale delle cellule come segue: estrarre il multi-colore spot etichettati con l&#39;aggiunta di tutti i 5 canali attraverso il canale aritmetica dei Imaris XT in un nuovo canale; determinare per tutti i punti (celle) l&#39;intensità di fluorescenza media in ciascuno dei canali dei componenti 5. Esportare i valori nel software Excel per tracciare i grafici che mostrano il &quot;colorprint&quot; unico ovvero la relativa% di ogni FP a singola cellula (Figura 2E grafico). Correggere i set di dati per la deriva dei tessuti, e calcolare la velocità delle cellule e lo spostamento nel tempo, le lunghezze delle tracce, percorsi e distanze; I valori di esportazione in Excel software per tracciare grafici. Montare figure composite con Adobe Photoshop software CSS 5. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Descriviamo qui i dettagli di una potente metodologia recentemente messo a punto per il monitoraggio cellulare clonale, che unisce la grande diversità generata contrassegnando con-5FP codifica vettori Lego e l&#39;imaging confocale con tandem e microscopia a 2 fotoni per ottenere volumetrico e l&#39;imaging dinamico in tessuti vivi combinatorio. Questo ha esteso l&#39;uso della marcatura registrando confocale identità spettrale in 5 &quot;distinti&quot; canali a 8-bit di colore a base di FP. Così il relativo rapporto di...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

La produzione di cellule del sangue, ematopoiesi definito, è gestito da una piccola popolazione di staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs). Queste cellule risiedono nel midollo osseo (BM) in una nicchia microambientali complesso costituito da osteoblasti, cellule stromali, tessuto adiposo, e le strutture vascolari, tutti implicati nel controllo di auto-rinnovamento e differenziazione 1,2. Come intatto BM è tradizionalmente inaccessibile alle osservazioni dirette, le interazioni tra HSPC e il loro microambiente rimane in gran parte indefinita in vivo. In precedenza, abbiamo stabilito una metodologia per visualizzare l&#39;architettura 3D della BM intatta utilizzando confocale a fluorescenza e riflessione microscopia a 3. Abbiamo caratterizzato l&#39;espansione di EGFP-marcati HSPCs nel BM, ma l&#39;uso di una sola FP escludessimo analisi di rigenerazione a livello clonale. Molto di recente abbiamo approfittato della lentivirali Gene Ontology (Lego) i vettori che esprimono costitutivamente flproteine ​​uorescenti (FPS) per contrassegnare in modo efficiente le cellule 4,5. Co-trasduzione del HSPC con 3 o 5 vettori genera una tavolozza variegata di colori combinatorie, consentendo il monitoraggio di molteplici singoli cloni HSPC. Contrassegnato HSPC combinato con nuova tecnologia di imaging permesso di tracciare individuale homing HSPC e attecchimento nel BM di topi irradiati. Vettori lego sono stati usati per marcare HSPC con 3 o 5 diversi fps (da Cerulean, eGFP, Venere, tdTomato, e mCherry) e seguire il loro attecchimento nel tempo nel BM mediante microscopia confocale e 2-fotone, consentendo la visualizzazione chiara delle ossa e di altri strutture a matrice, e la relazione di cloni HSPC ai componenti del loro microambiente. HSPC sono stati purificati come le cellule negative lignaggio da C57Bl / 6 topi BM, trasdotte con vettori lego, e reinfuse tramite iniezione vena della coda in topi congenici mielo-ablato. Monitorando grandi volumi del tessuto sterno BM abbiamo visualizzato attecchimento endostale si verificano primaRigenerazione BM. Gruppi di cellule con spettri di colore diversi apparso inizialmente in prossimità all&#39;osso e progredito a livello centrale nel corso del tempo. È interessante notare che, dopo più di 3 settimane il midollo costituito da ammassi clonali macroscopici, suggerendo diffusione della emopoiesi derivati ​​dalle singole HSPCs contiguo nel midollo, invece di ampia diffusione HSPCs attraverso il flusso sanguigno. C&#39;era meno diversità di colore in momenti in ritardo, suggerendo difficoltà di trasduzione a lungo termine ripopolare le cellule con più vettori. Inoltre, HSPCs formata cluster nella milza, un organo responsabile anche per emopoiesi nei topi. Singole celle HPSC-derivati ​​potrebbero essere risolti nel timo, linfonodi, milza, fegato, polmoni, cuore, pelle, muscolo scheletrico, tessuto adiposo, e reni pure. Le immagini 3D possono essere valutati qualitativamente e quantitativamente per apprezzare la distribuzione di cellule con perturbazioni minime dei tessuti. Infine, illustriamod la fattibilità di studi dinamici live in 4D, combinando multifotonica scansione di risonanza e confocale time-lapse imaging. Questa metodologia consente non invasiva alta risoluzione, multidimensionale cellula-destino tracciato di spettralmente contrassegnati cellule popolazioni nella loro architettura 3D intatta, fornendo un potente strumento per lo studio della rigenerazione dei tessuti e della patologia.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Produzione di virus</td></tr><tr><td>LeGO-Cer2</td><td>Addgene</td><td>27338</td><td>Espressione di Ceruleo</td></tr><tr><td>LeGO-G2</td><td>Addgene</td><td>25917</td><td>Espressione di eGFP</td></tr><tr><td>LeGO-V2</td><td>Addgene</td><td>27340</td><td>Espressione di Venus</td></tr><tr><td>LeGO-T2</td><td>Addgene</td><td>27342</td><td>Espressione di tdTomato</td></tr><tr><td>LeGO-C2</td><td>Addgene</td><td>27339</td><td>Espressione di mCherry</td></tr><tr><td>Calciumm Kit di trasfezione del fosfato</td><td>Sigma</td><td>CAPHOS-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura tissutale</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Life Technology</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino inattivato al calore</td><td>Sigma</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutammina</td><td>Gibco, Life Tecnologia</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Provette per centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>L60</td><td></td></tr><tr><td>Millex Filtro guidato da siringa Unite (0,22 & micro; m)</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Raccolta, purificazione, trasduzione e trapianto di cellule di topo</td></tr><tr><td>ACK tampone di lisi</td><td>Quality Biologicals Inc.</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Kit di deplezione cellulare di derivazione (topo)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>Colonne LS + tubi</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>Filtri di pre-separazione (30 &; micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Terreno senza siero StemSpan SFEM per la coltura e l'espansione di cellule ematopoietiche (500 ml)</td><td>StemCell Technologies Inc&nbsp;</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-11 CF</td><td>R & D Systems Inc</td><td>418-ML-025/CF</td><td>100 &micro; g/ml è 1.000x</td></tr><tr><td>Divisione RDI SCF murino ricombinante</td><td>di Fitzgerald Industries Intl&nbsp;</td><td>RDI-2503</td><td>100 &; g/ml è 2.000x</td></tr><tr><td>IL-3 murino ricombinante</td><td>R & D Systems Inc</td><td>403-ML-050</td><td>20 &micro; g/ml è 2.000x</td></tr><tr><td>FLT-3 Ligando</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-096-480</td><td>100 &micro; g/ml è 1.000x</td></tr><tr><td>piastre a 12 pozzetti, Costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A/B</td><td>Risospensione a 50 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Protamina Solfato</td><td>Sigma</td><td>P-4020</td><td>4 &micro; g/ml è 1.000x</td></tr><tr><td colspan="4">Microscopia confocale e a due fotoni</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro, Mediatech Inc.</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura con fondo in vetro P35G-0-20-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura con fondo in vetro P35G-0-14-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Vetro di copertura in borosilicato; 4 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 22 mm No 2</td><td>Thomas Scientific</td><td>6662-Q55</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 AOBS microscopio confocale e multifotone a cinque canali</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision II -TiSaph portata laser 680-1.080 nm</td><td>Camaleonte coerente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gamma laser OPO compatta 1.030-1.350 nm</td><td></td> HCX-IRAPO-L <td></td><td></td></tr><tr><td>25X/0,95 NA obiettivo a immersione in acqua coerente (WD=2,5 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo a secco HC-PLAPO-CS 20X/0,70 NA (WD=0,6 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo a immersione in acqua HC-PL-IRAPO 40X/1,1 NA (WD=0,6 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris versione software 7.6</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo clonale monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia multiphoton

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Abbiamo sviluppato e convalidato un marchio metodologia per il monitoraggio clonale di staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs) con alta risoluzione spaziale e temporale per studiare in vivo ematopoiesi con il trapianto di midollo osseo modello sperimentale murino fluorescente. Marcatura utilizzando vettori lentivirali codificanti per proteine ​​fluorescenti (PQ) combinatoria genetica ha permesso la mappatura destino cellulare attraverso avanzate di imaging microscopia. Vettori codificano cinque diversi PQ: Cerulean, EGFP, Venere, tdTomato, e mCherry sono stati usati per trasdurre HSPCs contemporaneamente, creando una tavolozza variegata di cellule di colore marcato. Imaging utilizzando confocale / microscopia a due fotoni ibrido consente la valutazione simultanea alta risoluzione delle cellule marcate in modo univoco e la loro progenie in combinazione con componenti strutturali dei tessuti. Volumetrica analisi su grandi aree rivelano che le cellule HSPC-derivate spettralmente codificati possono essere rilevati in modo non invasivo in vari tessuti intatti, tra cui il midollo osseo (BM), Per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto. Studi in diretta conciliano multiphoton di video-rate e confocale time-lapse imaging in 4D dimostrano la possibilità di tracciamento cellulare e clonale dinamica in maniera quantitativa.

Whole-mount 3D confocale / 2-fotoni microscopia ricostruzioni del corso sternale tempo il midollo osseo ha rivelato l&#39;attecchimento e l&#39;espansione dei trapiantati co-5fps in un modello con caratteristiche notevoli: cloni apparso chiaramente delineata, omogeneamente contrassegnati con ampia gamma di colori inizialmente e di progresso nel tempo per contenere preferenzialmente cellule principalmente un colore. Installazione di microscopia confocale ed esempi rappresentativi di immagini 5fps-segnato HSPC nel midollo...

Combinatorie 5 proteine ​​fluorescenti marcatura di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche consente il monitoraggio in vivo clonale tramite confocale e microscopia a due fotoni, fornendo approfondimenti midollo osseo emopoietico architettura durante la rigenerazione. Questo metodo permette di mappatura destino non invasiva di cellule HSPCs derivate spettralmente-codificati nei tessuti intatti per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è seguire cloni ematopoietici marcati con fluorescenza in tessuti vivi, inclusivo del midollo osseo, mediante una nuova strategia di microscopia confocale e a due fotoni. A tale scopo, progenitori ematopoietici e cellule staminali murine vengono isolati e co-trasdutti con vettori lentivirali di gene ontology o vettori Lego che codificano per cinque proteine fluorescenti: Ian, EGFP, Venus, TD tomato e mCherry. Le cellule trasdotte vengono quindi trapiantate in topi riceventi mieloablati e, dopo periodi di tempo fino a 120 giorni, il midollo osseo e gli organi vengono prelevati dai topi riceventi ed eseguita una microscopia confocale e a due fotoni combinata.Le immagini risultanti vengono ricostruite in 3D per tracciare la posizione di cloni e cellule trapiantati marcati con fluorescenza nel tempo. Ciò facilita lo studio dell'evoluzione clonale durante l'emopoiesi e il destino di cellule derivate dal midollo osseo in altri organi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alla sezione fisica dei tessuti è che combina i benefici dell'imaging ad alta risoluzione con la sezione ottica mediante microscopia confocale e la visualizzazione dei componenti strutturali mediante amplificazione doppia in microscopia.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ematonologia, come l'analisi spaziale e temporale della clonogenesi durante la rigenerazione del midollo osseo a partire dall'attecchimento iniziale, con il mantenimento geografico dei cloni in espansione nel tempo. È possibile esaminare volumi molto grandi di tessuto denso integro. Ad esempio, circa 3000 immagini sono state ricostruite computazionalmente per visualizzare i cloni marcati con colori nello sterno di un topo. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla architettura clonale nell'emopoiesi normale e alterata, può essere applicato anche allo studio della rigenerazione degli organi, delle risposte immunitarie o dei modelli di metastatizzazione tumorale.In questa procedura, i vettori lentivirali per l'ontologia genica o vettori Lego codificano cinque proteine fluorescenti: Ian EGFP, Venus, TD tomato e M Cherry. Ogni proteina fluorescente è espressa da un promotore costitutivo forte del virus della formazione di focolai splenici, o promotore SFFV. Dopo aver prodotto i vettori Lego che codificano le proteine fluorescenti e aver titolato le particelle virali, raccogliere il midollo osseo dagli arti anteriori e posteriori di topi donatori sacrificati mediante dissezione di femori e tibie.Utilizzare un bisturi per rimuovere accuratamente tutti i legamenti muscolari e i tessuti in eccesso dalle ossa. Successivamente, tagliare l'estremità di ciascun osso il più vicino possibile all'articolazione. Utilizzando un ago da 27 gauge montato su una siringa contenente mezzo I 10, espellere il midollo osseo in un tubo conico da 50 millilitri per centrifuga, quindi centrifugare a 500 G e a quattro gradi Celsius per ottenere il pellet cellulare.Dopo aver eliminato il soprannatante per lisi delle cellule rosse, aggiungere 50 millilitri di un tampone CK, centrifugare come in precedenza, quindi eliminare il soprannatante e ripetere l'operazione dopo aver scartato il secondo soprannatante. Ri-sospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo I 10. Successivamente, utilizzare un kit di deplezione della linea massima per purificare le cellule progenitrici negative per la linea secondo il protocollo modificato del kit dettagliato nel documento allegato.Una volta purificate le cellule negative per il lineage, piastrarle in una fiasca T75 a una densità di cinque volte 10 alla quinta cellule per millilitro in mezzo StemSpan supplementato con IL-3 murina, IL-11 murina, ligando FL umano e fattore di crescita delle cellule staminali murino; incubare a 37 gradi Celsius e 5% CO2 per 48 ore. Dopo due giorni, utilizzare una spatola per cellule per risospendere le cellule e trasferire da una a quattro volte 10 alla quinta cellule per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti; aggiungere i vettori a un MOI di sei-sette ciascuno in mezzo StemSpan con citochine e quattro microgrammi per millilitro di solfato di protamina alle cellule.Per portare il volume totale in ogni pozzetto a un millilitro, assicurarsi di preparare un controllo di colore singolo per ogni proteina fluorescente. Dopo 24 ore, risospendere le cellule utilizzando una spatola e trasferirle in un tubo da centrifuga da cinque millilitri. Quindi centrifugare e risospendere le cellule in mezzo stem span privo di citochine, centrifugare nuovamente e risospendere le cellule in 100 microlitri di mezzo stem span privo di citochine per iniezione o per microscopia confocale o citometria a flusso.Trasferirli in piastre a 12 pozzetti contenenti mezzo fresco con citochine e coltivare per ulteriori 96 ore. In preparazione al trapianto di midollo osseo, posizionare i topi riceventi irradiati in una gabbia sotto una luce riscaldante mentre i topi si riscaldano. Preparare siringhe per iniezione con da una a quattro volte 10 alla quinta cellule negative per la linea in 100 microlitri di stem span per topo.Preparare una siringa per ogni topo. Quando le vene della coda sono dilatate, i topi sono pronti per essere iniettati. Posizionare il topo da iniettare in un contenitore per topi e disinfettare la coda con un tampone imbevuto di etanolo al 70%.Questo passaggio consente anche una migliore visualizzazione della vena della coda. Quindi iniettare le cellule nella vena della coda. Trapiantare un intero gruppo di animali con la stessa popolazione di cellule del midollo osseo donatore transdotte in diversi momenti fino a 120 giorni dopo il trapianto.Recuperare i tessuti e gli organi per l'analisi in toto senza sezionamento. Posizionare organi singoli in piatti per colture con vetrino numero zero da 35 millimetri con 50-100 microlitri di PBS freddo per l'analisi con microscopia a tempo-lapse.Posizionare gli organi in DMEM con 10% FBS contenente 20 millimolari di heaps a 37 gradi Celsius e acquisire immediatamente le immagini. Qui la microscopia viene eseguita utilizzando un sistema confocale a cinque canali e multifotone Leica SP invertito, dotato di laser visibili multilinea al argon, diodo a 561 nanometri, elio-neon a 594 nanometri ed elio-neon a 633 nanometri. Posizionare uno dei campioni singoli transdotti con Lego sulla piastra del microscopio e mettere a fuoco.Acquisire pile di immagini lambda a intervalli di banda di cinque nanometri che coprono l'intero spettro luminoso. Successivamente, utilizzare il software per selezionare una regione di interesse nell'immagine e visualizzare l'istogramma dello spettro di riferimento. Salvare questi dati.Quindi ripetere questo processo per ogni proteina fluorescente nell'esperimento. Successivamente, utilizzare gli spettri raccolti dalle singole proteine fluorescenti per impostare le larghezze di banda nella modalità canale. Per fare ciò per ogni canale, fare clic sul cursore nero e inserire la larghezza di banda da utilizzare.La larghezza di banda scelta deve comprendere la regione di picco dello spettro di eccitazione di ciascuna proteina fluorescente, assicurando al contempo che non vi sia sovrapposizione tra i canali fluorescenti. Impostare il guadagno e l'offset per ciascun rilevatore in modo che la gamma dinamica del segnale del campione sia a un livello rilevabile, simile tra le diverse proteine fluorescenti e senza saturazione. Ad esempio, la proteina M cherry è circa la metà rispetto alla luminosità dell'EGFP, quindi il guadagno e l'offset devono essere regolati per ottenere una gamma dinamica simile per entrambe.Infine, in modalità canale, acquisire un'immagine di ciascun campione di controllo monocromatico utilizzando tutti e cinque i canali e verificare che ogni proteina fluorescente sia visibile esclusivamente nel canale corrispondente e assente negli altri. Una volta che gli spettri di tutti i canali sono stati convalidati, salvare le impostazioni. Tali impostazioni possono essere importate e utilizzate in esperimenti futuri che impiegano le stesse proteine fluorescenti e lo stesso tessuto campione.Qui viene dimostrato l'uso combinato della microscopia confocale e a due fotoni sul midollo osseo dello sterno, ottenuto mediante l'uso di un bisturi e pinzette per sezionare lo sterno lungo il piano sagittale. Successivamente effettuare un taglio trasversale all'articolazione tra due fosse sternali. Posizionare le ossa con la superficie tagliata rivolta verso il basso in una piastra di coltura da 35 millimetri con vetrino numero zero, contenente da 50 a 100 microlitri di PBS freddo; l'acquisizione delle immagini avverrà attraverso la superficie tagliata.Verificare la posizione delle ossa al microscopio stereoscopico. Posizionare il campione sul piatto del microscopio. Impostare quindi il software di acquisizione immagini per catturare in sequenza il segnale a due fotoni con armonica secondaria generata.Quindi eccitazione confocale a cinque colori. Impostare i limiti dell'area di raccolta Zack con un passo di cinque micron su una distanza compresa tra 150 e 300 micron. Utilizzare la funzione tile per istruire il software a generare automaticamente volumi assemblati che comprendano l'intero sterno, fossa di circa 2,5 per 1,2 millimetri quadrati nella direzione XY.Avviare l'acquisizione per raccogliere in sequenza le immagini X, Y, Z in tutti e cinque i canali più la microscopia a due fotoni con segnale armonico secondario generato da osso e collagene fibrillare per l'acquisizione temporale 4D. Posizionare linfonodi poplitei, milza, polmone o campioni ossei calvarici freschi, non tagliati, su piatti colturali in vetro coprioggetto da 35 millimetri numero zero. Coprire i campioni con 50-100 microlitri di DMEM contenente 10% di FBS e 20 millimolari di HEPES a 37 gradi Celsius.Posizionare il campione sul piatto riscaldato del microscopio. Quindi, nel software, impostare i parametri di acquisizione per utilizzare l'eccitazione a due fotoni con laser al titanio-sapphire a 860 nanometri combinata con l'eccitazione confocale e lo scanner in risonanza Leica a 8.000 hertz al secondo. Acquisire stack Z di 80 micron a intervalli di 22° per un massimo di un'ora per l'immagineggiatura simultanea a tre colori con due fotoni, impostando il software per utilizzare il laser al titanio-sapphire regolato a 860 nanometri contemporaneamente al laser OPO regolato a 1.130 nanometri per TD tomato o a 1.140 nanometri per M cherry.Infine, avviare l'acquisizione per raccogliere quattro immagini in 4D. Come in precedenza, una volta raccolte tutte le immagini, eseguire la ricostruzione e l'analisi in 3D e 4D utilizzando il software Amer nella versione a 64 bit o un software simile. Aprire l'immagine Zack e selezionare surpass per visualizzare il visualizzatore del volume 3D.Quindi utilizzare Naviga per ruotare il volume di 360 gradi. Successivamente selezionare Animazione. Utilizzare fotogrammi chiave per aggiungere viste selezionate, zoom e rotazioni del volume.Anteprima del filmato e modifica secondo necessità. Infine, salvare il file in un formato video desiderato per tracciare la storia clonale delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici marcate con fluorescenza. Le cellule del donatore cotrasdotte con cinque diversi vettori Lego sono state trapiantate in un topo ricevente e il midollo osseo dello sterno è stato immaginato e analizzato come descritto in questo video.A quattro giorni dal trapianto, erano visibili gruppi di cellule marcate con una vasta gamma di colori in prossimità del margine osseo, mostrato in bianco. Al giorno 31, una grande clone di colore giallo-verde unico si era espansa fino a occupare l'intera Fosse, come illustrato nelle immagini sovrapposte e in quelle a singolo canale. L'analisi del contenuto FPS ha dimostrato una marcatura omogenea da parte delle due varianti FPS EGFP e Venus.Questo video di ricostruzione 3D illustra l'architettura spaziale delle linee cellulari marcate racchiuse nell'osso sternale. L'immagine mostra un esempio di cellule derivate dal midollo osseo nel linfonodo popliteo a 120 giorni dal trapianto. Le cellule sparse sono prevalentemente marcate in giallo e rosso e sono circondate perifericamente da fibre di collagene, mostrate in bianco, nel cuore visto dal lato epicardico.Molte cellule singole sono visibili disperse tra i cardiomiociti mostrati in bianco, visualizzati mediante la loro autofluorescenza a due fotoni a 780 nanometri una volta padroneggiata. Questa tecnica può essere eseguita in diversi giorni se effettuata correttamente dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della rigenerazione e dello sviluppo degli organi e a una maggiore esplorazione biologica degli arrangiamenti spazio-temporali di elementi cellulari e strutturali clonalmente complessi mediante etichettatura multicolore e imaging confocale e a due fotoni.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare una metodologia di marcatura fluorescente per tracciare il marcatore clonale delle cellule staminali ematopoietiche e delle cellule progenitrici in organi viventi.

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