Name: Misurazione del tasso metabolico in Drosophila Utilizzando respirometria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 31 s
Description: Impara a misurare il tasso metabolico in Drosophila melanogaster utilizzando respirometria per analizzare la produzione di CO2. Questo metodo permette di confrontare i tassi metabolici tra gruppi sperimentali e di controllo.

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Vorremmo ringraziare Max-Planck Society per finanziare la nostra ricerca.

1. Preparazione di Respirometri <ol><li> Tagliare la punta della pipetta 1.000 microlitri con una lametta per consentire l&#39;inserimento del capillare micropipetta 50 pl, cercare di ottenere il puntale più diritta possibile. </li><li> Posizionare un pezzo di schiuma nella pipetta e spingerla verso il basso nella punta della pipetta. </li><li> Aggiungere una piccola quantità di CO 2 assorbente e contenere entro un secondo pezzo di schiuma. </li><li> Applicare la colla nel luogo in cui la micropipetta viene inserito nella punta della pipetta. </li><li> Lasciare il respirometro durante la notte per permettere la colla si asciughi. Uno schema di un respirometro è mostrato nella Figura 1A. </li></ol> 2. Preparazione della camera di misura <ol><li> Preparare la soluzione da camera di miscelazione acqua con eosina in un rapporto che si tradurrà in colorazione visibile. </li><li> Versare la soluzione eosina / acqua nella camera. </li><li> Etichettare uno dei lati della camera con una scala centimetro. </li></ol><ol><li> Etichettare le singole respirometri con un pennarello. </li><li> Anestetizzare mosche utilizzando un metodo alternativo di CO 2 e posizionare 3-5 mosche del genotipo desiderato all&#39;interno di ogni respirometro. </li><li> Sigillare le respirometri saldamente in cima utilizzando plastilina stucco. </li><li> Consentire mosche per recuperare da anestesia per circa 15 min. </li><li> Preparare una respirometro senza linea, che sarà utilizzato come controllo atmosferica. </li></ol> 4. Esecuzione dell&#39;esperimento <ol><li> Appendere le respirometri nella camera collegando un titolare Eppendorf da 1,5 ml tubo che è aperto nella parte superiore e la parte inferiore alla parte superiore della camera. </li><li> Inserire respirometri con la punta micropipetta giù nella camera che la punta di immergersi nella soluzione colorata. </li><li> Aggiungere vaselina tra il coperchio coperchio e camera per fornire l&#39;isolamento forte dalla temperatura e pressione fluctuations. </li><li> Chiudere il coperchio e lasciare il sistema si stabilizzi per 15 min. </li><li> Prendere una fotografia della camera di fare in modo che il livello di liquido all&#39;interno di ciascuna micropipetta è visibile e quindi è la scala (vedi esempio illustrato nella Figura 1B). </li><li> Dopo 1-2 ore, scattare un&#39;altra foto. </li><li> Quando esperimento è finito, rimuovere le mosche dal respirometri e pesare se desiderato o il trasferimento di nuovo al flaconcino, se necessario ulteriormente. </li></ol> 5. Analisi dei risultati <ol><li> Apri immagini acquisite utilizzando il software ImageJ 11. </li><li> Utilizzando la scala in ogni immagine, impostare la scalatura pixel nel software. </li><li> Misurare la distanza (Δd) che il liquido ha viaggiato da un punto di riferimento determinato in immagini scattate all&#39;inizio (d1) e alla fine dell&#39;esperimento (d2). Un esempio schematico è mostrato nella Figura 1C. </li><li> Calcolare la quantità di CO 2 prodotta (ml / h / volo) con la formula: </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51681/51681eq1.jpg" /> R = raggio del tubo micropipetta in centimetri Δd = distanza il liquido è spostato nella micropipetta di campioni di prova misurata in centimetri Δc = distanza il liquido è spostato nella micropipetta del campione di controllo negativo (senza linea) n = numero di mosche utilizzati h = ore

<ol><li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+%26%2334%3Brate+of+living%26%2334%3B+model%3A+further+evidence+that+longevity+and+metabolic+rate+are+not+inversely+correlated+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Testing the &#34;rate of living&#34; model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster.</a> J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).</li>
<li>Ross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-specific+decrease+in+aerobic+efficiency+associated+with+increase+in+oxygen+free+radical+production+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).</li>
<li>van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+contribution%3A+long-lived+Drosophila+melanogaster.+lines+exhibit+normal+metabolic+rates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates.</a> J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).</li>
<li>Hulbert, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin%2FIGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).</li>
<li>Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+modulates+metabolic+rate+and+temperature+sensitivity+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dopamine modulates metabolic rate and temperature sensitivity in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Takeuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+temperature+preferences+and+energy+homeostasis+in+dystroglycan+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Changes in temperature preferences and energy homeostasis in dystroglycan mutants.</a> Science. 323, 1740-1743 (2009).</li>
<li>Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+muscular+dystrophy%3A+a+genetic+screen+for+dystroglycan+and+dystrophin+interactors+in+Drosophila.+identifies+cellular+stress+response+components%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components.</a> Developmental Biology. 352, 228-242 (2011).</li>
<li>Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperthermic+seizures+and+aberrant+cellular+homeostasis+in+Drosophila+dystrophic.+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles.</a> Scientific Reports. 1, 47 (2011).</li>
<li>Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+and+metabolism+in+Drosophila+melanogaster%3A+genetic+correlations+between+life+span+and+age-specific+metabolic+rate+in+populations+artificially+selected+for+long+life%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life.</a> Genetics. 169, 231-242 (2005).</li>
<li>Elia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+equivalents+of+CO2+and+their+importance+in+assessing+energy+expenditure+when+using+tracer+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Energy equivalents of CO2 and their importance in assessing energy expenditure when using tracer techniques.</a> The American Journal of Physiology. 260, (1991).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Bharucha, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicurean+fly%3A+using+Drosophila+melanogaster.+to+study+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism.</a> Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).</li>
<li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+flies+and+men%3A+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biology. 11, 38 (2013).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

In questo protocollo, si descrive un metodo poco costoso ed affidabile per misurare la produzione di CO 2 in mosche. Abbiamo trovato che questo esperimento è facile, rapida da condurre e genera dati riproducibile che è in accordo con altri studi 1, 6, 9. Il protocollo qui descritto può essere facilmente modificato per adattarsi bilancio e disponibili materiali di qualsiasi laboratorio. La costruzione di ogni singolo respirometro può essere adattato finché la camera rimane chiuso ermeticamente. Tutt...

Il ciclo di Krebs biochimico genera ATP attraverso l&#39;ossidazione di acetato derivata dai carboidrati, grassi e proteine ​​che producono CO 2. In Drosophila, O 2 ingresso è direttamente correlata con CO 2 uscita e riflette il livello di metabolismo 1. Così, la misurazione di CO 2 in uscita è stato usato con successo in studi legati all&#39;invecchiamento e metabolismo 2-5. Qui il nostro laboratorio ha modificato apparati sperimentali progettati in precedenza, consente la misurazione della produzione di CO 2 fino a diciotto campioni senza bisogno di attrezzature specializzate. Altri e abbiamo già utilizzato questo metodo per mostrare le differenze nei tassi metabolici in linea che sono carenti nella distrofia muscolare proteina associata, distroglicano (DG) 6-8. O 2 utilizzati per il metabolismo ossidativo è convertito in CO 2, che viene espulso come rifiuti respiratorio. La costruzionezione respirometri fatti a mano viene descritto che permette la determinazione del tasso di O 2 consumato. Mosche sono posti in un contenitore sigillato con una sostanza che assorbe espulso CO 2, eliminando efficacemente dalla fase gassosa. La variazione di volume di gas (diminuzione della pressione) è misurata dallo spostamento di liquido in un capillare di vetro attaccato alla respirometro chiuso. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri è il costo. Precedenti studi hanno misurato produzione di CO 2 da Drosophila utilizzando analizzatori di gas e sistemi di RESPIROMETRICO tecnicamente avanzati 1,9. Nonostante l&#39;apparecchiatura più complessa, la sensibilità del metodo qui descritto è simile ai valori riportati (Tabella 1). Inoltre, diversi altri gruppi hanno utilizzato varianti di questa tecnica per determinare i tassi metabolici relativi in Drosophila 4-6. Pertanto, questo test può essere utilizzato per generare attendibilile, i dati riproducibili relativi al metabolismo Drosophila, senza l&#39;acquisto di attrezzature specializzate che può essere installato in qualsiasi laboratorio e può essere utilizzato per scopi didattici. In generale, le tecniche riconosciute per determinare il metabolismo di un organismo è misurare la CO 2 prodotta, l&#39;O 2 consumato, o entrambi 3,4,9. Anche se, si può presumere che un equivalente di O 2 genera un equivalente di CO 2, il rapporto precisa del CO 2 generata dipende sul substrato metabolico utilizzato 10. Così, per determinare con precisione il tasso metabolico in energia è necessario misurare sia O 2 consumato e CO 2 prodotta. A causa di questo, il metodo qui descritto è specificamente rilevante per confrontare le differenze fra CO 2 produzione tra gli animali e non il valore assoluto. La nostra tecnica si integra aerei animale produzione di CO 2 per un periodo di time (1-2 ore) e quindi restituisce una media di attività degli animali. Se non vi è motivo di ritenere che gli animali sperimentali sono meno attivi rispetto agli animali di controllo la misura potrebbe riflettere i diversi livelli di attività e non necessariamente il metabolismo.

<table><tbody><tr><td>BlauBrand IntraMark 50 &micro; l micropipette</td><td>VWR</td><td>612-1413</td><td></td></tr><tr><td>Soda Lime</td><td>Wako</td><td>CDN6847</td><td></td></tr><tr><td>Eosina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>031M4359</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi colorante in grado di creare una colorazione visibile del liquido Camera di</td></tr><tr><td>sviluppo per cromatografia su strato sottile (TLC)</td><td>VWR</td><td>21432-761</td><td>Qualsiasi camera in vetro trasparente che può essere chiusa con il coperchio</td></tr><tr><td>Anestesizzatore, Lull-A-Fly Kit</td><td>Flinn</td><td>FB1438</td><td></td></tr><tr><td>Power Gel Glue</td><td>Pritt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml puntali per pipetta</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schiuma</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stucco Plaesticine</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione del tasso metabolico in<em&gt; drosophila</em&gt; utilizzando respirometria

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Disturbi metabolici sono un problema frequente che colpisce la salute umana. Pertanto, la comprensione dei meccanismi che regolano il metabolismo è un compito scientifico fondamentale. Molti geni che causano malattie negli esseri umani hanno un omologo mosca, rendendo Drosophila un buon modello per studiare vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo di malattie diverse. Inoltre, la trattabilità di Drosophila semplifica schermi genetici per aiutare a identificare nuovi bersagli terapeutici che possono regolare il metabolismo. Per eseguire tale schermata è necessario un metodo semplice e veloce per identificare le variazioni dello stato metabolico di mosche. In generale, la produzione di anidride carbonica è un buon indicatore di ossidazione del substrato ed il dispendio energetico fornire informazioni sullo stato metabolico. In questo protocollo si introduce un metodo semplice per misurare la CO 2 in uscita dalle mosche. Questa tecnica può potenzialmente aiutare nell&#39;identificazione di perturbazioni genetiche che colpiscono tasso metabolico.

Al fine di dimostrare che il metodo è sensibile abbiamo misurato la produzione di CO 2 da wild type (Oregon R) maschile vola a 18, 25, e 29 ° C e vola mutante per Dg. Mosche sono state sollevate a 25 ° C e poi spostato alla temperatura sperimentale per 5 giorni prima della misura. Come previsto per questa specie ectotermi, la quantità di CO 2 prodotta aumentata con la temperatura (Figura 2). Abbiamo in passato dimostrato che una dieta priva di zucchero riduce il t...

Disturbi metabolici sono tra una delle malattie più comuni negli esseri umani. Il modello di organismo geneticamente trattabili D. melanogaster può essere utilizzato per identificare nuovi geni che regolano il metabolismo. Questo documento descrive un metodo relativamente semplice, che permette lo studio del metabolismo in linea misurando la produzione di CO 2.

Misurazione del tasso metabolico in<em&gt; Drosophila</em&gt; Utilizzando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

L'obiettivo di questa procedura è determinare i tassi metabolici relativi delle mosche misurando la loro produzione di anidride carbonica. Questo viene ottenuto posizionando innanzitutto le mosche all'interno di barometri respiratori appositamente preparati. Successivamente, i barometri respiratori contenenti le mosche vengono inseriti in una camera cromatografica, entrando in contatto con una soluzione acquosa colorata.Nel tempo, il liquido migra nel respirometro a causa della diminuzione della pressione provocata dalla rimozione dell'anidride carbonica espulsa dall'ambiente gassoso prima e dopo. Le immagini dell'esperimento vengono utilizzate per calcolare la quantità di anidride carbonica prodotta in base alle dimensioni del capillare del respirometro. Alla fine, i dati ottenuti in questo saggio permetteranno il confronto tra le velocità metaboliche relative delle mosche sottoposte a esperimento e quelle di controllo.Per iniziare, tagliare con una lametta il beccuccio di una pipetta da 1000 microlitri nel modo più dritto possibile e inserire la micropipetta nel beccuccio da 1000 microlitri. Successivamente, inserire un pezzo di schiuma nella pipetta e spingerlo verso il basso. Quindi aggiungere una piccola quantità di sodalime e fissarla con un secondo pezzo di schiuma.Applicare la colla nel punto in cui la micropipetta viene inserita nel puntale della pipetta e lasciare asciugare la colla tutta la notte. Preparare la soluzione per la camera mescolando acqua con eosina in un rapporto uno a cinque, il che produrrà una colorazione visibile. Successivamente, versare la soluzione di ees e acqua nella camera.Quindi etichettare il lato verticale della camera con la scala in centimetri e il lato orizzontale con le etichette dei respirometri. Preparare i barometri respiratori etichettandoli singolarmente con un pennarello. Se si stanno analizzando diversi genotipi, non dimenticare di annotare il numero del respirometro e il corrispondente genotipo.Successivamente, immobilizzare le mosche utilizzando una piastra metallica pre-raffreddata e posizionare da tre a cinque mosche del genotipo desiderato. All'interno di ciascun respirometro, sigillare ermeticamente i barometri respiratori nella parte superiore utilizzando argilla da modellare e lasciare che le mosche si riprendano dall'anestetizzazione per 15 minuti. Preparare un respirometro senza mosche da utilizzare come controllo atmosferico.Successivamente, collegare un supporto per provette da 1,5 millilitri. Aprire entrambi i lati nella parte superiore della camera e appendere i barometri respiratori all'interno della camera con le punte immerse nella soluzione colorata. Aggiungere vaselina tra il coperchio e la camera per garantire un'isolamento più efficace dalle fluttuazioni di temperatura e pressione.Successivamente, chiudere il coperchio e lasciare che il sistema raggiunga l'equilibrio per 15 minuti. Quindi scattare una fotografia della camera, assicurandosi che il livello del liquido all'interno di ciascuna micropipetta e la scala siano entrambi visibili. Dopo una o due ore, scattare un'altra immagine per iniziare l'analisi.Aprire le immagini acquisite utilizzando il software Image J. Successivamente, impostare la scala dei pixel nel software. Utilizzando ciascuna immagine come riferimento, misurare quindi la distanza o delta D percorsa dal liquido rispetto a un punto di riferimento predeterminato, confrontando le immagini acquisite all'inizio e alla fine dell'esperimento.Calcolare infine la quantità di anidride carbonica prodotta. Utilizzando questo metodo, si è osservato che la produzione di anidride carbonica delle mosche è positivamente correlata alla temperatura di allevamento. Questi risultati contrastano con quelli ottenuti con mutanti District Li Ccan o DG, le cui mosche mostrano un aumento significativo della produzione di anidride carbonica rispetto ai ceppi selvatici.Il metodo sopra descritto consente l'identificazione primaria di mutazioni genetiche nelle mosche che possono portare a cambiamenti nel metabolismo.

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Biologia

Questo articolo descrive un metodo per la misurazione dell'ossidazione del carburante in Drosophila melanogaster in cui tracce di specifici substrati metabolici radiomarcati vengono somministrati alle mosche. La CO2 radiomarcata espirata, prodotta dall'ossidazione del combustibile, viene raccolta e misurata.

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Misurazione del consumo di O2 in Drosophila melanogaster mediante microrespirometria coulometrica

Qui presentiamo un protocollo di respirometria ad alta risoluzione per analizzare la bioenergetica nei moscerini della frutta mutanti PINK1B9-null. Il metodo utilizza il protocollo SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

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In questo articolo il video, si descrive un metodo nuovo che consente la costruzione di gradienti di odorizzante con geometrie stabili e controllabili. Abbiamo brevemente illustrare come questi gradienti possono essere usati per lo screening dei difetti olfattivi (anosmia totale e parziale) e di studiare le caratteristiche più sottili del comportamento chemiotassi.

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Drosophila melanogaster è un organismo modello potente per esplorare le basi molecolari della regolazione longevità. Questo protocollo discuterà i passaggi necessari per generare una riproducibile, basato sulla popolazione, la misurazione della longevità e gli eventuali rischi potenziali e come evitarli.

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Misurazione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) è il gold standard per la valutazione della funzione renale. Qui si descrive un metodo ad alta produttività che permette la determinazione di GFR nei topi coscienti utilizzando una singola iniezione in bolo, determinazione della fluoresceina isotiocianato (FITC)-inulina nel plasma e calcolo di GFR da un modello di decadimento esponenziale a due fasi.

Un metodo ad alta velocità per la misura della velocità di filtrazione glomerulare in topi coscienti

Qui si descrive un metodo per la misurazione rapida e accurata delle prestazioni di volo in Drosophila, consentendo di screening high-throughput.

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