Name: Saggi Reporter massicciamente parallelo in cellule di mammifero in coltura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Scopri come eseguire saggi reporter massicciamente parallelo in cellule di mammifero per analizzare migliaia di sequenze regolatorie. Questo metodo ad alto rendimento consente di studiare l'attività genica con sequenziamento profondo.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Human Genome Research Institute dei National Institutes of Health sotto Award Numero R01HG006785.

1 Progettazione Sequenza e Sintesi <ol><li> Inizia MPRA con la progettazione e la sintesi di sequenze da dosare per attività di regolamentazione. Per la compatibilità con la serie vettore pMPRA, progettare ogni sequenza utilizzando la seguente configurazione: 5&#39;-ACTGGCCGCTTCACTG- var -GGTACCTCTAGA- tag -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 &#39;, dove var indica la sequenza da dosare e tag denota uno o più tag di identificazione. </li><li> Le due regioni variabili (var e tag) sono separate da una coppia di KpnI (GGTACC) e XbaI (TCTAGA) siti di restrizione per facilitare la legatura direzionale di un frammento di gene reporter tra loro. Inoltre, due SFII (GGCCNNNNNGGCC) siti distinti saranno aggiunti mediante PCR per permettere la legatura direzionale nella spina dorsale pMPRA. Le regioni variabili non devono contenere ulteriori copie di qualsiasi di questi siti di restrizione. Se necessario, uno o più di questi enzimi di restrizione possono essere sostituiti, Fino a quando le sostituzioni 1) consentire il taglio efficiente vicino alle estremità di molecole di DNA, e 2) non tagliare altrove nella sequenza vettoriale. Vedi di discussione per ulteriori dettagli. </li><li> Ottenere i primer richiesti elencati nella tabella 1 da un fornitore commerciale. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="381"><tbody><tr><td> MPRA_SfiI_F </td><td> GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_R </td><td> GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC </td></tr><tr><td> TAGseq_P1 </td><td> AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT </td></tr><tr><td> TAGseq_P2 </td><td> CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [index] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG </td></tr></tbody></table> Tabella 1. sequenze di primer. [Indice] denota una sequenza indice 6-8 nt utilizzato per il sequenziamento multiplex. Ottenere almeno 8 primer TagSeq-P2 con indici differenti. Tuttodei primer deve essere purificata mediante HPLC o PAGE. <ol start="4"><li> Librerie oligonucleotide possono essere ottenuti da un fornitore o nucleo struttura commerciale, o generati utilizzando un programmabile basato microarray-oligonucleotide sintetizzatore come descritto dal produttore. Risospendere i prodotti OLS in 100 microlitri di buffer TE 0.1. </li><li> Eseguire le librerie oligonucleotidiche su un TBE-Urea 10% denaturazione gel di poliacrilamide. Caricare circa 1 pmol per corsia e macchia con macchia fluorescente ssDNA-sensibile per valutare la qualità (Figura 2A). </li><li> Se una band discreta corrispondente alle oligonucleotidi full-length può essere visualizzato (Figura 2A, corsie 1 e 2), asportare il corrispondente fetta gel di acrilammide ed eluire oligonucleotidi in 100 microlitri TE 0.1 notte a temperatura ambiente con agitazione. In caso contrario, procedere con l&#39;OLS sospensione crudo. </li><li> Amplifica e aggiungere le code SFII alla libreria oligonucleotide con emulsione PCR 9 </<html> sup&gt;. </li><li> Impostare 50 microlitri di miscele di reazione PCR come descritto nella Tabella 2. Poi si combinano con 300 ml di olio e miscela di tensioattivo dal DNA emulsione Micellula e kit di purificazione e vortex per 5 minuti a 4 ° C. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="368"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> 1x Volume (ml) </td></tr><tr><td> Herculase II Fusion DNA polimerasi </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Tampone di reazione 5x Herculase II </td><td> 10 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mm ciascuno) </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> BSA (20 mg / ml) </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_F Primer (25 micron) </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_R Primer (25 micron) </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> Modello OLS (1-10 attomol) </td><td> varia </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 50 </td></tr></tbody></table>ve_content &quot;&gt; Tabella 2 Emulsion PCR mix di reazione (fase acquosa). <ol start="9"><li> Utilizzare la concentrazione che dà la resa massima di prodotti di amplificazione senza la comparsa di artefatti (vedi sezione 1.12). </li><li> Versare l&#39;emulsione risultante in provette per PCR ed eseguire 20 cicli di PCR (2 min a 95 ° C, 20 x [20 sec a 95 ° C, 20 sec a 55 ° C, 30 sec a 72 ° C], 3 min a 95 ° C). </li><li> Piscina e rompere ogni 350 ml di emulsione reazione di PCR con l&#39;aggiunta di 1 ml di isobutanolo e brevemente vortex, e poi purificare il prodotto di amplificazione utilizzando una colonna di purificazione del DNA. </li><li> Eseguire una aliquota su un gel di agarosio al 2% o 4% per verificare privo di artefatti di amplificazione (Figura 2B). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig2highres.jpg" /> Figura 2 Preparazione di librerie di sintesi di oligonucleotidi. A) </sTrong&gt; Tre diverse biblioteche di sintesi di oligonucleotidi prime (OLS) eseguito su denaturazione del 10% TBE-urea gel di poliacrilammide. Bande corrispondenti a oligonucleotidi di lunghezza completa (*) possono essere visualizzati e asportati dalle librerie 1 e 2 Libreria 3 contiene contaminanti che interferiscono con la purificazione PAGE. Se questo è il caso, procedere direttamente al B amplificazione PCR.) Prodotti di aperto ed emulsione amplificazione PCR della stessa seduta biblioteca oligonucleotidi su un gel di agarosio. Amplificazione PCR di librerie di oligonucleotidi complessi crea frequentemente prodotti chimerici e altri artefatti che possono apparire come bande superiori e inferiori. Emulsione PCR può minimizzare questi manufatti. 2. Costruzione Biblioteca <ol><li> Preparare una spina dorsale plasmide linearizzato da digerire vettore pMPRA1 con Street Fighter II a 50 ° C per 2 ore, eseguito su un gel di agarosio 1%, asportare la fascia dorsale (in questo caso, 2,5 kb) e purificarlo utilizzando una colonna di spin di gel-purificazione. </li><li> Digerirei prodotti di PCR emulsione dal punto 1.4 con Street Fighter II a 50 ° C per 2 ore e purificano utilizzando le colonne di purificazione del DNA. </li><li> Per legare la libreria promotore tag nella spina dorsale vettore linearizzato, istituito reazioni contenenti 100 ng del prodotto della PCR digerito, 50 ng del vettore backbone linearizzato e DNA ligasi T4. Incubare per una notte a 16 ° C e poi il calore a 65 ° C per 20 minuti per inattivare la ligasi. </li><li> Trasforma E. coli con la reazione legatura. Per preservare la complessità biblioteca, mirano a ottenere almeno 10x più cfu che ci sono distinte combinazioni promotore-tag nella libreria progettata. </li><li> Quando il numero totale di tag è di circa 100.000, il cfu bersaglio può tipicamente essere ottenuto eseguendo 6-8 trasformazioni parallele per libreria. </li><li> Per ogni trasformazione, unire 50 ml electrocompetent E. coli con 2 ml di mix legatura su ghiaccio. Trasformazione mediante elettroporazione, recuperare le cellule in 800 microlitri SOCsupporto con agitazione a 37 ° C per 1 ora, e poi unire celle dalle trasformazioni parallele. </li><li> Per valutare l&#39;efficienza di trasformazione, piastra diluizioni seriali da un alinquot di cellule recuperate su piastre di agar LB con 50-100 mg / ml carbenicillina e incubare una notte a 37 ° C. Stimare cfu totale come (cfu osservato) × (fattore di diluizione) × (V - v) / v, dove V è il volume totale delle cellule recuperati e v è il volume dell&#39;aliquota prelevata per le diluizioni seriali. </li><li> Al tempo stesso, utilizzare il resto delle cellule recuperate per inoculare 200 ml di LB integrato con 100 mg / ml carbenicillina. Crescere le cellule a 37 ° C per una notte in un incubatore shaker e poi isolare il DNA plasmidico secondo procedure standard. </li><li> Digest un&#39;aliquota della biblioteca isolata plasmide con SFII a 50 ° C per 2 ore e correre su un gel di agarosio 1% per confermare la presenza di inserti. </li><li> Linearizzare la libreria plasmide da cUtting tra le varianti del promotore e tag utilizzando KpnI e XbaI. Per massimizzare l&#39;efficienza di digestione, eseguire digestioni di serie: </li><li> In primo luogo, digerire con KpnI a 37 ° C per 1 ora e purificare mediante biglie magnetiche. In secondo luogo, digerire con XbaI con l&#39;aggiunta di 1 U Gambero fosfatasi alcalina a 37 ° C per 2 ore, il calore inattivare a 65 ° C per 5 minuti, e poi purificare con biglie magnetiche. </li><li> Eseguire una aliquota su un gel di agarosio 1% per verificare completa linearizzazione. Se plasmide uncut è visibile, il frammento linearizzato va gel purificato. </li><li> Per generare una libreria MPRA adatto per trasfezione in cellule di mammifero, legare un ORF con KpnI / XbaI estremità compatibili nella biblioteca intermedio linearizzato. </li><li> Per preparare un luc2 ORF frammento compatibile da pMPRAdonor1, digerire il plasmide con KpnI e XbaI a 37 ° C per 1 ora e correre su un gel di agarosio 1%. Accise il frammento ORF (1,7 kb in questo caso) e la purificazione mediante colonna di gel di depurazione centrifuga. </li><li> Clonare il frammento ORF nella libreria intermedio linearizzato come descritto nei passaggi 2,3-2,8. </li><li> Digest un&#39;aliquota (corrispondente a 1-2 mg) della biblioteca MPRA con KpnI a 37 ° C per 1 ora e correre su un gel di agarosio all&#39;1%. Se la libreria digerito viene eseguito come una singola banda, passare alla sezione 3 Se si osservano bande addizionali (tipicamente corrispondente al riporto di costrutti intermedi), la libreria può essere ulteriormente purificato come segue: </li><li> Digest 3-5 mg di biblioteca contaminato con KpnI a 37 ° C per 1 ora e correre su un gel di agarosio 0,8% per una notte a 4 ° C. </li><li> Accise banda libreria corretta, purificare il DNA usando una colonna di spin purificazione gel ed eseguire auto-ligazione con alta concentrazione di T4 DNA ligasi a 37 ° C per 1 ora. Quindi ripetere la trasformazione e la biblioteca ultima estrazione del DNA come descritto al punto 2.8. </li></ol> 3 Transfection, Perturbazione, e RNA Isolation <ol><li> Per ogni trasfezione indipendente, la cultura il numero di cellule (come determinato dalla complessità biblioteca MPRA, vedi Discussione) in mezzo appropriato. Ad esempio, la cultura HEK293T / 17 cellule in DMEM supplementato con 10% FBS e L-glutammina / penicillina / streptomicina. Cellule di coltura per almeno due transfezioni indipendenti per ogni libreria e condizione sperimentale. </li><li> Trasfezione le cellule in coltura con plasmidi MPRA. Il metodo e le condizioni di trasfezione devono essere ottimizzati per ogni tipo cellulare. Per ogni campione transfettate, mantenere una aliquota (50-100 ng) di DNA plasmide come controllo abbinato. </li><li> Ad esempio, transfettare 0,5 x 10 7 HEK293T / 17 cellule cresciute al ~ 50% di confluenza in un piatto di cultura 10 centimetri con 10 mg DNA plasmidico in 1 ml di Opti-MEM ho ridotto siero Media utilizzando 30 microlitri Lipofectamine LTX e 10 ml più reagente. Rimuovere la miscela di trasfezione dopo 5 ore e permettere l&#39;cellule di recuperare per 24-48 ore. </li><li> Facoltativamente, eseguire qualsiasi perturbazione necessaria ad attivare sequenze regolatrici contestuali o segnale-dipendente nella libreria progettata. </li><li> Raccogliere le cellule e isolare poli (A) + mRNA utilizzando colonne di cellulosa oligo (dT) standard o perline usando le istruzioni del loro produttore. </li><li> Assicurarsi che la capacità massima di legame delle colonne o perline superare l&#39;importo totale di mRNA previsto dalle cellule raccolte. Ad esempio, il rendimento atteso dalla sezione 3.3 è di circa 0,5-2,5 mg mRNA. </li></ol> 4. Tag-Seq <ol><li> Per eliminare i residui di vettore DNA dai lisati cellulari trasfettate, trattare ogni campione di mRNA 20 microlitri con 1 ml Turbo DNasi (2 U) e 2,3 microlitri di buffer 10x Turbo DNasi a 37 ° C per 1 ora, aggiungere 2,4 microlitri DNasi Turbo Inattivazione reagente a RT per 5 min con miscelazione, centrifugare a 10.000 g per 90 secondi, e poi trasferire la soluzione in una nuova provetta. </li><li> Verificare<html> purezza eseguendo PCR come descritto nel capitolo 4.6 da 60-100 ng di ciascun campione di mRNA, e quindi eseguendo i prodotti su un gel di agarosio. Se ampliconi specifici sono visibili (0,25 kb se si utilizza pMPRA1 con luc2), colonna purificare l&#39;mRNA trattata e poi ripetere il trattamento DNasi. </li><li> Per generare librerie di sequenziamento Tag-Seq, convertire giornalista mRNA in cDNA e aggiungere schede di sequenziamento mediante PCR. </li><li> Impostare miscele di primer mRNA / RT come descritto nella Tabella 3. Incubare a 65 ° C per 5 minuti, poi disporli sul ghiaccio. In parallelo, impostare reazioni di sintesi di cDNA, come descritto nella Tabella 4. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> 1x Volume (ml) </td></tr><tr><td> campione di mRNA (400-700 ng totale) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Oligo-0DT (50 micron) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mm ciascuno) </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>ove_content &quot;&gt; Tabella 3 RNA / trascrizione inversa miscela di primer per la sintesi del DNA. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> 1x Volume (ml) </td></tr><tr><td> 10x SuperScript III RT Buffer </td><td> 2 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mm) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0.1 M) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> RNaseOut (40 U / ml) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> SuperScript III (200 U / ml) </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabella 4 cDNA mix di reazione di sintesi. <ol start="5"><li> Unire delicatamente mRNA / RT Primer mescola con miscele di sintesi cDNA. Incubare a 50 ° C per 50 min, 85 ° C per 5 minuti e poi posto su ghiaccio. Infine, incubare con 2 U di ribonucleasi H a 37 ° C per 20 min. </li><li> Impostare reazioni PCR, come descritto nella Tabella 5 con 4-6 microlitricDNA miscela di reazione o 50 ng plasmide giornalista come modelli. Quindi eseguire amplificazione PCR (95 ° C per 2 min, 26 x [95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec, 72 ° C per 30 sec], 72 ° C per 3 min). </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> 1x Volume (ml) </td></tr><tr><td> 2x PfuUltra II HotStart PCR Master Mix </td><td> 25 </td></tr><tr><td> TagSeq_P1 Primer (25 micron) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> TagSeq_P2 Primer (25 micron) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Template (mRNA, cDNA mix o plasmide DNA) </td><td> varia </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 50 </td></tr></tbody></table> Tabella 5 Tag-Seq Miscela di reazione PCR. <ol start="7"><li> Eseguire i prodotti di PCR attraverso un gel di agarosio al 2%, bande di accisa corrispondenti alle ampliconi libreria di tag-Seq (0,25 kb se si utilizzapMPRA1 con luc2) e purificare queste utilizzano colonne di spin purificazione gel. </li><li> Piscina, denaturare e sequenziare i ampliconi Tag-Seq purificate direttamente con uno strumento di sequenziamento Illumina. </li><li> Filtro di bassa qualità si legge eliminando tutto ciò che a) contenere uno o più posizione con una qualità Phred punteggio inferiore a 30 all&#39;interno del tag in sequenza o b) non corrisponde esattamente un tag progettato. Contare il numero di volte che ogni tag rimanente appare in ogni libreria. Normalizzare i conteggi tag di TPM (tag per milione tag sequenziati) e quindi calcolare il rapporto tra i conteggi tag mRNA derivati ​​over-plasmide derivato tag conteggi per ogni coppia di librerie di sequenziamento. Se più tag diversi sono stati collegati per ogni variante di sequenza, utilizzare i loro rapporti mediani per l&#39;analisi a valle. </li></ol>

<ol><li>Kinney, J., Murugan, A., Callan, C. G., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+deep+sequencing+to+characterize+the+biophysical+mechanism+of+a+transcriptional+regulatory+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Using deep sequencing to characterize the biophysical mechanism of a transcriptional regulatory sequence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (20), 9158-9163 (2010).</li>
<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
<li>Patwardhan, R. P., Lee, C., Litvin, O., Young, D. L., Pe’er, D., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+of+DNA+regulatory+elements+by+synthetic+saturation+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis.</a> Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Arnold, C. D., Gerlach, D., Stelzer, C., Boryń, ŁM., Rath, M., Stark, A. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArnold%2C+CD+%22Science+%28New+York%2C+N.+Y.%29%22">Science (New York, N. Y.)</a>. 339 (6123), 1074-1077 (2013).</li>
<li>Kheradpour, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+of+regulatory+motifs+in+2000+predicted+human+enhancers+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection of regulatory motifs in 2000 predicted human enhancers using a massively parallel reporter assay.</a> Genome Research. 23 (5), 800-811 (2013).</li>
<li>White, M. A., Myers, C. A., Corbo, J. C., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+in+vivo+enhancer+assay+reveals+that+highly+local+features+determine+the+cis+-regulatory+function+of+ChIP-seq+peaks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Massively parallel in vivo enhancer assay reveals that highly local features determine the cis -regulatory function of ChIP-seq peaks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (29), 11952-11957 (2013).</li>
<li>Mogno, I., Kwasnieski, J. C., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+synthetic+promoter+assays+reveal+the+in+vivo+effects+of+binding+site+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Massively parallel synthetic promoter assays reveal the in vivo effects of binding site variants.</a> Genome Research. 23 (11), 1908-1915 (2013).</li>
<li>Schütze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410 (1), 155-157 (2011).</li>
<li>Panne, D., Maniatis, T., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+model+of+the+interferon-beta+enhanceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An atomic model of the interferon-beta enhanceosome.</a> Cell. 129 (6), 1111-1123 (2007).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

L'MPRA è uno strumento flessibile e potente per la dissezione delle relazioni sequenza-attività negli elementi regolatori genici. Il successo degli esperimenti MPRA dipende da almeno tre fattori: 1) un'attenta progettazione della libreria di sequenze, 2) la minimizzazione degli artefatti durante l'amplificazione e il clonaggio e 3) un'elevata efficienza di trasfezione. 
Le possibili lunghezze delle regioni variabili nei costrutti reporter sono in gran parte determinate dalla tecnologia di sintesi o clonazione utilizzata. L'OLS standard è generalmente limitato a circa 200 nt, ma questo protocollo è compatibile con inserti fino ad almeno 1.000 nt. Si noti che le regioni variabili che sono altamente ripetitive o contengono forti strutture secondarie possono finire per essere sottorappresentate a causa di distorsioni di PCR e clonazione. La lunghezza dei tag che identificano ciascuna delle regioni variabili dovrebbe essere di 10-20 nt e la raccolta di tag dovrebbe idealmente essere progettata in modo tale che ci siano almeno due differenze nucleotidiche tra ogni coppia. Quando possibile, dovrebbero essere evitati anche i tag che contengono le sequenze seme di microRNA noti o altri fattori che potrebbero influenzare la stabilità dell'mRNA.
Un parametro chiave nella progettazione degli esperimenti MPRA è il numero totale di costrutti reporter distinti da includere nella libreria (la complessità del progetto, indicata con CD). In pratica, il CD è limitato dal numero di cellule in coltura che possono essere trasfettate. Come regola generale, il numero totale di cellule trasfettate dovrebbe essere almeno 50-100 volte maggiore di CD. Ad esempio, se 20 milioni di cellule possono essere trasfettate con un'efficienza di trasfezione del 50%, allora CD non dovrebbe essere superiore a ~ 200.000. Si noti che CD è uguale al numero di varianti di sequenza regolatorie distinte moltiplicato per il numero di tag distinti per sequenza. Più tag distinti sono collegati a ciascuna sequenza regolatoria, più accurata è la stima dell'attività di quella sequenza (perché le misurazioni da tag distinti possono essere mediate), ma meno varianti distinte possono essere analizzate in un esperimento. La scelta ottimale dipende dal disegno sperimentale. In un semplice esperimento di "Promoter bashing", in cui un modello matematico verrà adattato alle misurazioni aggregate, un singolo tag per variante è solitamente sufficiente. In uno screening per polimorfismi a singolo nucleotide che causano cambiamenti nelle attività regolatorie, potrebbe essere necessario utilizzare 20 o più tag per allele per ottenere risultati statisticamente robusti, perché il confronto di ciascuna coppia di alleli richiede un test di ipotesi separato. 
Se non si prevede che le sequenze da analizzare contengano siti di inizio della trascrizione, è possibile aggiungere anche un promotore costante nello stesso frammento. Ad esempio, pMPRAdonor2 (Addgene ID 49353) include un promotore TATA-box minimo che è utile quando si prevede che la regione variabile a monte abbia un'attività di potenziamento significativa, mentre pMPRAdonor3 (Addgene ID 49354) include un promotore virale SV40 forte e modificato che è utile quando si prevede che la regione variabile contenga attività del silenziatore o altri elementi regolatori negativi. 
I prodotti OLS grezzi contengono spesso una frazione significativa di oligonucleotidi troncati. Questi possono interferire con l'accurata amplificazione PCR delle sequenze progettate, in particolare quando c'è un'omologia significativa tra di loro. L'utilizzo della purificazione PAGE per rimuovere i prodotti di sintesi troncati e la PCR in emulsione per ridurre al minimo gli artefatti di amplificazione sono tecniche efficaci per garantire un'elevata qualità della libreria. Se uno dei due passaggi non è pratico, è imperativo ridurre al minimo il numero di cicli di PCR utilizzati in ogni fase di amplificazione. La selezione e l'espansione della libreria clonata in coltura liquida è generalmente sufficiente per mantenere la complessità del progetto, ma se si devono utilizzare vettori inclini alla ricombinazione o si osserva una significativa distorsione di rappresentazione, le cellule recuperate possono invece essere piastrate direttamente su grandi piastre di agar LB, espanse come singole colonie e quindi raschiate via per l'isolamento del DNA. È anche importante considerare il potenziale impatto degli errori di sintesi, che si riscontrano tipicamente a una velocità di 1:100-500 nell'OLS. Si raccomanda la sequenziazione completa dei costrutti reporter prima della trasfezione per identificare e correggere tali errori.
Non è necessario introdurre costrutti reporter in ogni cellula della coltura trasfettata, ma efficienze di trasfezione inferiori a ~50% possono portare a scarsi rapporti segnale/rumore. Si consiglia di ottimizzare le condizioni di trasfezione prima di eseguire esperimenti MPRA in un nuovo tipo di cellula. Quando si lavora con tipi di cellule difficili da trasfettare, i segnali MPRA possono essere potenziati preselezionando le cellule trasfettate. La serie di vettori pMPRA include varianti che esprimono costitutivamente un marcatore di superficie cellulare troncata che può essere utilizzato per arricchire fisicamente le cellule trasfettate prima dell'isolamento dell'RNA (ad esempio, Addgene IDs 49350 e 49351).

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Erratum: Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Saggi Reporter Massively Parallel (MPRA) consentono la misurazione multiplex delle attività di regolamentazione trascrizionali di migliaia a centinaia di migliaia di sequenze di DNA 1- 7. Nella sua implementazione più comune, multiplazione è ottenuta accoppiando ogni sequenza di interesse ad un gene reporter sintetico che contiene un tag di sequenza che identifica a valle di un open reading frame (ORF; la figura 1). A seguito di trasfezione, l&#39;isolamento di RNA e profondo sequenziamento dei fini del 3 &#39;dei trascritti del gene reporter, le relative attività delle sequenze accoppiati possono essere dedotte dalla relativa abbondanza di loro tag di identificazione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig1highres.jpg" /> Figura 1 Panoramica di MPRA. Una libreria di MPRA giornalista costruisce è costruito accoppiando putative sequenze di regolamentazione sinteticogeni reporter che consistono di un &quot;inerte&quot; ORF (come GFP o luciferasi) seguito da una sequenza di tag di identificazione. La biblioteca è transfettato in massa in una popolazione di cellule in coltura e trascritto mRNA giornalista viene successivamente recuperata. Sequenziamento profondo viene utilizzato per contare il numero di occorrenze di ogni tag tra i mRNA giornalista e plasmidi trasfettate. Il rapporto tra mRNA risiedono su conti plasmid possono essere usate per dedurre l&#39;attività della corrispondente sequenza regolatrice. Adattato con il permesso di Melnikov, et al 2. MPRA può essere adattato a una vasta gamma di disegni sperimentali, di cui 1) la mutagenesi completa dei geni dell&#39;individuo elementi regolatori, 2) la scansione di elementi regolatori nuovi attraverso un luogo di interesse, 3) testare l&#39;effetto della variazione genetica naturale in un insieme di putative promotori, enhancer o silenziatori, e 4) ingegneria semi-razionale di elementi regolatori sintetici. Libraries di varianti di sequenza possono essere generati utilizzando una varietà di metodi, tra cui la sintesi biblioteca oligonucleotidi (OLS) su microarray programmabili 2,3,6,7, assemblaggio di oligonucleotidi degenerati 1,4, legatura combinatoria 8 e frammentazione del DNA genomico 5. Questo protocollo descrive la costruzione di una libreria di promotore varianti con OLS e vettori pMPRA1 e pMPRAdonor1 (Addgene ID 49349 e 49352, rispettivamente; http://www.addgene.org), trasfezione transiente di questa biblioteca in cellule di mammifero in coltura e la successiva quantificazione delle attività di promotore di sequenziamento profondo dei relativi tag (Tag-Seq). Le versioni precedenti di questo protocollo sono stati utilizzati nella ricerca riportata nel Melnikov et al. Nature Biotechnology 30, 271-277 (2012) e in Kheradpour et al. Genome Research 23, 800-811 (2013).

<table><tbody><tr><td>Sintesi di librerie di oligonucleotidi</td><td>Agilent, CustomArray o altri fornitori di OLS</td><td>personalizzati</td><td>Se si utilizza il metodo di costruzione OLS</td></tr><tr><td>pMPRA1</td><td>Addgene</td><td>49349</td><td>MPRA plasmide backbone</td></tr><tr><td>pMPRAdonor1</td><td>Addgene</td><td>49352</td><td>luc2 ORF donatore plasmide</td></tr><tr><td>TE 0.1 Tampone (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)</td><td>Generico</td><td>n/a</td><td>tampone OLS</td></tr><tr><td>Novex TBE-Urea Gels, 10%</td><td>Life Technologies</td><td>EC6875BOX</td><td>PAGINA purificazione dei prodotti OLS</td></tr><tr><td>Novex TBA-Urea Sample Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6876</td><td>PAGINA purificazione dei prodotti OLS</td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td>PAGINA purificazione dei prodotti OLS</td></tr><tr><td>Micellula DNA Emulsione & Kit di purificazione</td><td>EURx/CHIMERx</td><td>3600-01</td><td>Amplificazione della libreria mediante PCR in emulsione</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td><td>Agilent</td><td>600675</td><td>Polimerasi per PCR in emulsione</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0123S</td><td>Clonaggio della libreria con vettori pMPRA</td></tr><tr><td>KpnI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142S</td><td>Clonaggio della libreria con vettori pMPRA</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Nuovo England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>Clonazione di librerie con vettori pMPRA</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligasi (2.000.000 unità/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>Clonazione di librerie con vettori pMPRA One</td></tr><tr><td>Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>C4040-50</td><td>Clonazione di librerie con vettori pMPRA</td></tr><tr><td>LB agar e terreni liquidi con carbenicllina</td><td>Generico</td><td>n/a</td><td>Terreni di crescita per clonazione</td></tr><tr><td>E-Gel EX Gels 1%</td><td>Life Technologies</td><td>G4010-01</td><td>Verifica e purificazione della libreria</td></tr><tr><td>E-Gel EX Gels, 2%</td><td>Life Technologies</td><td>G4010-02</td><td>Verifica e purificazione della libreria</td></tr><tr><td>MinElute Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>Purificazione della libreria e della dorsale</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Isolamento del DNA della libreria</td></tr><tr><td>Terreni di coltura cellulare</td><td>n/a</td><td>n/a Reagenti</td> di trasfezione <td>specifici per l'esperimento</td></tr><tr><td></td><td>n/a</td><td>n/a Kit</td> MicroPoly(A)Purist <td>specifico per l'esperimento</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies Isolamento</td><td></td><td>dell'mRNA</td></tr><tr><td>TURBO senza DNA</td><td>Tecnologie Life Kit</td><td>AM1907</td><td>Rimozione del DNA plasmidico</td></tr><tr><td>SuperScript III Vita del sistema di sintesi del primo filamento</td><td> Tecnologie</td><td>18080-051</td><td>Sintesi di cDNA</td></tr><tr><td>PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix</td><td>Agilent</td><td>600850</td><td>Polimerasi per Primer PCR Tag-Seq</td></tr><tr><td>(vedi testo)</td><td>IDT</td><td>custom</td><td>PAGE purify Primer Tag-Seq</td></tr></tbody></table>

saggi reporter massicciamente parallelo in cellule di mammifero in coltura

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Il test del reporter genetico è uno strumento consolidato e potente per sezionare la relazione tra le sequenze di DNA e le loro attività di regolazione genica. Il potenziale di questo test è stato, tuttavia, limitato dalla necessità di clonare e saggiare individualmente l'attività di ciascuna sequenza di interesse utilizzando la fluorescenza proteica o l'attività enzimatica come proxy per l'attività regolatoria. I progressi nelle tecnologie di sintesi e sequenziamento del DNA ad alto rendimento hanno recentemente reso possibile superare queste limitazioni multiplexando la costruzione e l'interrogazione di grandi librerie di costrutti reporter. Questo protocollo descrive l'implementazione di un saggio reporter massivamente parallelo (MPRA) che consente il confronto diretto di centinaia di migliaia di sequenze regolatorie putative in un singolo piatto di coltura cellulare.

MPRA facilita ad alta risoluzione, dissezione quantitativa delle relazioni sequenza-attività di elementi di regolazione trascrizionale. Un esperimento MPRA prescelto sarà tipicamente misurazioni risulteranno altamente riproducibili per la maggior parte delle sequenze nella libreria transfettate (Figura 3A). Se scarsa riproducibilità si osserva (Figura 3B), ciò è indicativo di una concentrazione troppo bassa di mRNA del reporter nei campioni di RNA recuperati, a causa sia 1) bassa attività assoluto tra le sequenze dosati, o 2) bassa efficienza di trasfezione. La Figura 4 mostra un rappresentante &quot;informazione impronta&quot; 1,2 generato analizzando ~ 37.000 varianti casuali di una sequenza di 145 bp a monte del gene IFNB umano in cellule HEK293 con o senza esposizione al virus Sendai. Il promotore TATA-box e noto esaltatore prossimale 10 possono essere chiaramente identificati come regi ricco di informazionions in maniera virus-dipendente. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig3highres.jpg" /> Figura 3 Tag-Seq riproducibilità. Diagrammi a dispersione mostrano esempi di dati Tag-Seq da due transfezioni replicati indipendenti con alta (A) e bassa (B) riproducibilità. Il secondo grafico mostra molti tag outlier con elevato numero di mRNA in una sola delle due repliche. Tali manufatti in genere indicano che le concentrazioni di mRNA giornalista erano troppo bassi per PCR quantitativa, sia a causa di bassa attività assoluti tra i costrutti reporter, o bassa efficienza di trasfezione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig4highres.jpg" /> Figura 4. Informazioni footprinting del sito di inizio della trascrizione IFNB umana e potenziatore prossimale. </strong&gt; Circa 37.000 varianti casuali di 145 nucleotidi (nt) regione a monte del gene IFNB umana sono stati analizzati utilizzando MPRA in cellule HEK293 con (A) e senza (B) esposizione al virus Sendai. Le barre blu indicano la reciproca informazione tra l&#39;uscita giornalista e il nucleotide in ogni posizione. Il potenziatore prossimale e TATA-box si distinguono come regioni ad alto contenuto informativo su infezione virale.

Il test del reporter genetico è uno strumento consolidato e potente per sezionare la relazione tra le sequenze di DNA e le loro attività di regolazione genica. L'accoppiamento di elementi regolatori candidati a geni reporter che trasportano tag di sequenza identificativi consente una massiccia parallelizzazione di questi saggi.

Saggi Reporter massicciamente parallelo in cellule di mammifero in coltura

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di analizzare le attività di regolazione genica di migliaia di sequenze di DNA in parallelo. Ciò si ottiene costruendo prima una libreria reporter in cui le sequenze di DNA di interesse sono collegate ai geni reporter con uno o più tag di sequenza identificativi nei loro tre primi Ur. Il secondo passo della procedura consiste nel trasfettare questa libreria reporter in una popolazione di cellule.Il passaggio finale consiste nel contare il numero di occorrenze di ciascuno dei tag di sequenza identificativi negli mRNA reporter e nella corrispondente libreria reporter mediante sequenziamento profondo. In definitiva, i risultati possono essere utilizzati per dedurre la relazione tra la sequenza del DNA e le attività degli elementi regolatori genici attraverso l'analisi computazionale dei conteggi dei tag di sequenza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la luciferasi o i saggi reporter basati sulla GFP, è che consente di analizzare migliaia di sequenze regolatorie in un unico piatto di cellule in coltura.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della regolazione genica, come ad esempio quali nucleotidi all'interno del promotore o dell'enhancer hanno un'attività basata essenziale. Questo metodo può essere utilizzato per un'ampia varietà di altri disegni di esperimenti, come lo screening di un'ampia libreria di elementi regolatori putativi per l'attività in uno specifico stato cellulare. A dimostrare la procedura di costruzione della libreria reporter sarà Peter Rugo, un ricercatore associato senior dei laboratori di biotecnologia, a dimostrare che il TRANSFECT della libreria reporter e il recupero dell'RNA saranno Lee Wang, un ricercatore associato senior del mio gruppo, i saggi reporter paralleli massivi d'ora in poi si riferiscono a NPRA, iniziano con la progettazione e la sintesi di sequenze da analizzare per l'attività regolatoria.E tag indica uno o più tag identificativi. I siti di restrizione KPN uno e XBA uno si trovano nel mezzo. Risospendere la libreria di oligonucleotidi sintetizzata in 100 microlitri di tampone TE 0.1.Esegui la libreria di oligonucleotidi su un gel di poliacrilammide denaturante dell'urea al 10% di TBE. Caricare circa un ole in ogni corsia e analizzare il gel con una colorazione fluorescente sensibile al DNA a singolo filamento. Se c'è un divieto discreto corrispondente agli oligonucleotidi a lunghezza intera, tagliarlo ed eluire gli oligo in 100 microlitri di TE 0,1 durante la notte a temperatura ambiente e agitando utilizzando la libreria di oligonucleotidi purificati in gel o grezzi.Imposta una PCR in emulsione per amplificare la libreria e aggiungere una coda SI. Impostare le reazioni da 50 microlitri come descritto nella tabella due. Quindi combinare la miscela di reazione da 50 microlitri con 300 microlitri di miscela di olio e tensioattivo dal kit di emulsione e purificazione my DNA per cinque minuti a vortici di quattro gradi Celsius in un'emulsione.Quindi distribuire l'emulsione in provette o piastre per PCR con reazioni da 50 microlitri ed eseguire 20 cicli di PCR dopo la PCR. Ricomporre le emulsioni da 350 microlitri. Quindi aggiungere un millilitro di isobutanolo e vorticare alla miscela.Purificare brevemente il prodotto di amplificazione utilizzando una colonna di purificazione del DNA ed eseguire un Eloqua su un gel agros al 2% o al 4% per valutarne la qualità. L'amplificazione del siero di una complessa libreria di oli può introdurre bias di rappresentazione, RIC Applicon e altri artefatti. È essenziale ridurre al minimo il numero di cicli di PCR utilizzati per un ulteriore controllo di qualità.Si consiglia di eseguire la libreria di sequenziamento completa prima di procedere con i passaggi successivi Per preparare la spina dorsale plasmidico linearizzata. Primo digestivo P pra un vettore con SFI uno a 50 gradi Celsius per due ore. Quindi far scorrere i prodotti digeriti su un gel all'1% e raccogliere il DNA dalla banda dorsale 2,5 KILOBASE utilizzando una colonna rotante di purificazione del gel.Successivamente, digerire allo stesso modo i prodotti della PCR in emulsione e raccogliere anche i prodotti con la colonna di purificazione del DNA. Ora impostate una reazione di legatura con 100 nanogrammi di PCR digerita e 50 nanogrammi di plasmide linearizzato. Utilizzare la T 4 ligasi ed eseguire la reazione durante la notte a 16 gradi Celsius il giorno successivo.Inattiva la reazione di legatura riscaldandola a 65 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi trasformare due aliquote da microlitro dei prodotti della reazione di legatura in aliquote da 50 microlitri di equalizzante elettrocompetente. Recuperare le cellule in 800 microlitri di terreno SOC a 37 gradi Celsius agitando per un'ora.Quindi raggruppare tutte le trasformazioni parallele e valutarle placcando diluizioni seriali su agar LB con 50-100 microgrammi di penicillina di carbonio per millilitro. Incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius e stimare il CFU totale il giorno successivo. Immediatamente dopo la trasformazione, utilizzare il resto delle cellule trasformate per inoculare 200 millilitri di LB integrati con 100 microgrammi di carbonio per millilitro.Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte e agitare il giorno successivo, isolare il DNA plasmatico seguendo le procedure standard per confermare la presenza di inserti. Digerire un'aliquota della libreria isolata con SFI one e far scorrere i prodotti su un gel all'1%aros Linearizzare la libreria plasmidica con digestioni seriali utilizzando KPN one e XBA one prima digerire con KPN one a 37 gradi Celsius per un'ora e purificare i prodotti utilizzando biglie magnetiche. In secondo luogo, digerire un prodotto con XBA one più un'unità di fosfatasi alcalina di gamberetti a 37 gradi Celsius per due ore dopo.Inattivare la reazione a 65 gradi Celsius per cinque minuti, quindi purificare i prodotti utilizzando perle magnetiche. Esegui un'aliquota su un gel all'1% e, se è visibile un plasmide non tagliato, purifica il frammento linearizzato per generare una libreria NPRA adatta alla trasfezione in cellule di mammifero. Innanzitutto, prepara una fortuna compatibile per aprire il frammento del telaio di lettura da quello donatore P-M-P-R-A.Digerire questo plasmide con KPN one e XBA one a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi stendere i prodotti su un gel 1%AGROS. In questo caso, asportare il frammento del telaio di lettura aperto a 1,7 kilobasi e purificarlo utilizzando una colonna di centrifuga per la purificazione in gel.Quindi collegare il frame di lettura aperto linearizzato nella libreria intermedia linearizzata come descritto per la legatura precedente. Trasformare i prodotti della legatura in cellule di e coli e isolare la libreria di plasmidi NPRA finale come descritto in precedenza. Se non stai attento, riporta.I plasmidi aggiustati e i prodotti sottoplaccati possono ridurre notevolmente la proporzione di costrutti corretti nel pool plasmidico finale. Assicurati di isolare la banda corretta e di controllare lo sfondo prima di procedere con i passaggi successivi. Come controllo digerire un Eloqua di uno o due microgrammi della libreria NPRA con KPN uno.Eseguilo su un gel all'1% e se funziona come una singola banda, procedi. In caso contrario, consultare il protocollo di testo su come gestire la contaminazione per trasfettare le cellule in coltura. Con l'NPRA.Le condizioni dei plasmidi devono essere ottimizzate per ogni tipo di cellula. Ad esempio, 5 milioni di cellule HK 2 93 T 17 cresciute a circa il 50% di confluenza in un piatto di coltura di 10 centimetri possono essere trasfettate con 10 microgrammi di DNA plasmidico in un millilitro di ofm, un terreno sierico ridotto utilizzando 30 microlitri di lipo LTX e 10 microlitri di reagente plus. In questo caso, rimuovere la miscela di trasfezione per circa cinque ore e lasciare che le cellule si riprendano per uno o due giorni dopo, raccogliere le cellule e utilizzare un kit per isolare l'mRNA poli positivo.Quindi crea un tag, cerca la libreria di sequenziamento e analizza i risultati. L'NPRA facilita la dissezione quantitativa ad alta risoluzione delle relazioni di attività di sequenza degli elementi regolatori trascrizionali. Un esperimento NPRA di successo produce in genere misure altamente riproducibili per la maggior parte delle sequenze nella libreria trasfettata.Se la riproducibilità è scarsa, la concentrazione di mRNA reporter nell'RNA recuperato è probabilmente troppo bassa. Ciò può verificarsi a causa della bassa attività assoluta tra le sequenze di saggio o a causa della bassa efficienza di trasfezione. In questi n PRA di successo, sono state analizzate 37.000 varianti di una sequenza di 1 45 coppie di basi a monte del gene dell'interferone beta umano con o senza esposizione al virus sendi.Il promotore Tata box e l'enhancer prossimale noto possono essere chiaramente identificati come regioni ricche di informazioni in modo dipendente dal virus. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa una settimana se viene eseguita correttamente Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'EMCE e la cattura dell'affinità del DNA proteico, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quale fattore di trascrizione si lega ai nucleotidi critici all'interno di una sequenza di DNA attiva.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le librerie reporter per analizzare le attività di regolazione genica di migliaia di sequenze di DNA in parallelo.

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