Generazione e Purificazione di umani INO80 rimodellamento della cromatina Complessi e Sottocomplessi

Lo scopo di questa procedura è generare e purificare le versioni wild type e mutanti della multi subunità nel complesso di rimodellamento della cromatina oh 80. Ciò si ottiene isolando prima i nuclei dalle cellule che esprimono l'epitopo bandiera marcato nelle proteine O 80 Nella seconda fase, vengono preparati estratti nucleari, quindi l'umano selvatico o mutante nei complessi di rimodellamento della cromatina O 80 viene purificato mediante cromatografia aros Anti-Flag. In definitiva, le composizioni delle subunità dei complessi di NO 80 purificati possono essere analizzate mediante western blot o colorazione con argento.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come le subunità dei complessi di rimodellamento della cromatina MultiPro contribuiscono alla loro attività complessiva. Questo metodo è progettato specificamente per lo studio delle versioni wild type e mutanti del complesso di rimodellamento della cromatina NO 80, ma può essere utilizzato anche per studiare altri complessi nucleari multi-subunità. Come il mediatore.

La fase più critica della procedura è la fase di estrazione nucleare. Le persone di solito incontrano problemi perché durante la fase di estrazione del sale, le persone tendono ad aggiungere sale troppo velocemente o troppo energicamente Dopo la coltura In bottiglie a rullo, trasferire le cellule HEC 2 9 3 in una provetta conica graduata di dimensioni adeguate e farle girare per 10 minuti a 1000 volte G e quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il supinato, misurare il volume del pellet di cellule impaccate, quindi sospendere nuovamente il pellet in cinque volumi di celle di tampone A con un pipettaggio delicato e incubare le cellule sul ghiaccio per esattamente 10 minuti.

Dopo aver fatto girare di nuovo le celle, misurare il pellet della cella una seconda volta, dovrebbe essere aumentato fino a raddoppiare le dimensioni. Questa volta, risospendere le cellule in due volumi di celle del tampone A, quindi trasferire la sospensione cellulare in un omogeneizzatore di tessuti di dimensioni adeguate e omogeneizzare la sospensione cellulare con il pestello di vetro sciolto fino a quando il 90% delle cellule si colora positivamente con la centrifuga trian blue, le cellule omogeneizzate in una provetta da centrifuga ad alta velocità da 45 millilitri per 20 minuti a 25, 000 volte G e quattro gradi Celsius in un rotore ad angolo fisso. Quindi rimuovere il natante SUP contenente le proteine citosoliche dal pellet nucleare per estrarre i nuclei con il sale.

Ora aggiungi 2,5 millilitri di tampone C, ma ogni tre millilitri di volume iniziale di celle impacchettate al pellet. Quindi, utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere il pellet dalla parete del tubo e trasferire l'intera miscela in un omogeneizzatore a piuma di dimensioni adeguate. Omogeneizzare la miscela con due colpi di pestello sciolto per sospendere nuovamente i nuclei e quindi trasferire la frazione nucleare nu risospesa in un becher raffreddato di dimensioni tali che la sospensione riempirà il becher fino ad almeno 0,5 centimetri di profondità.

Successivamente, calcolare il volume di cinque molari di cloruro di sodio necessario per portare la soluzione a una concentrazione finale di 0,42 molari di cloruro di sodio secondo la seguente formula. Ora aggiungi gradualmente la soluzione salina calcolata goccia a goccia, fissando delicatamente la sospensione con una bacchetta di vetro sul ghiaccio per aumentare la concentrazione salina della sospensione fino a quando tutto il cloruro di sodio è stato aggiunto e la soluzione diventa molto viscosa. Quindi trasferire con cura la sospensione viscosa in provette di policarbonato da 70 millilitri in un rotore Tipo 45 TI con tappo e utilizzare un mutatore per far oscillare lentamente le provette sigillate a quattro gradi Celsius Dopo 30 minuti, ultracentrifugare i campioni in un rotore TI 45 per 30 minuti a 40, 000 volte G e quattro gradi Celsius, e raccogli l'estratto nucleare contenente surnatanti in un unico contenitore di plastica.

Quindi dividere la soluzione di estratto nucleare in aliquote di dimensioni convenienti, congelarle in azoto liquido e conservarle a meno 80 gradi Celsius. Per preparare gli aros Anti-Flag per l'immunopurificazione, iniziare utilizzando una pipetta da 200 microlitri con il cutoff del puntale per trasferire 200 microlitri su un impasto di perle di aros Anti-Flag al 50% in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Trasferire le perle prelavate in una provetta conica contenente 10 millilitri di estratto nucleare appena scongelato prima di ore di quattro gradi Celsius con rotazione lenta su un rotatore da laboratorio, quindi raccogliere la bandiera per centrifugazione per cinque minuti di 1000 volte G e quattro gradi Celsius.

Successivamente, lavare l'estratto di perle P in 10 millilitri di pidocchi, quattro tampone 50 per cinque minuti di quattro gradi Celsius con un leggero dondolio su un mutatore. Quindi, dopo aver centrifugato la miscela di estratto di perline, riutilizzare ancora una volta. Sospendere il pellet in 100-150 microlitri di pidocchi freschi quattro 50, trasferire le perle in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Continuando a sciacquare la provetta conica da 15 millilitri con quat da 100 a 150 microlitri di Lysol 50 fino a quando tutte le perle sono state trasferite nella provetta da microcentrifuga. Dopo aver centrifugato le perle in una microcentrifuga, lavarle tre volte con un millilitro di lys four 50 e una volta con un millilitro di EB 100.Buffer. Quindi, per eluire le proteine legate, aggiungere 200 microlitri di tampone EB 100 contenente peptide bandiera e incubare il campione a quattro gradi Celsius su una nutt.

Dopo mezz'ora, pellettare le perle nella microcentrifuga che si ottiene e quindi trasferire il natante SUP contenente il complesso C eluito in OAC in una nuova provetta da microcentrifuga. Dopo aver ripetuto l'eluciano altre quattro volte, passare l'eluato tirato attraverso una colonna di rotazione vuota per rimuovere eventuali perle aero a bandiera residue dalla frazione proteica. Infine, utilizzare un dispositivo di ultrafiltrazione centrifuga con un cutoff di 50.000 pesi molecolari per concentrare la frazione proteica allusa di circa 10 volte.

Come illustrato in questa figura, la purezza dei complessi NO 80 preparati utilizzando le subunità di contrassegno indicate, come appena dimostrato, può essere valutata utilizzando gel di poliacrilammide SDS colorati con argento. Tutte le proteine che appaiono in questa corsia di controllo sono contaminanti che si legano in modo non specifico agli aero di bandiera. Queste etichette indicano i divieti corrispondenti alle subunità NO 80 testate e indicano la mobilità dei marcatori di peso molecolare.

La posizione del tipo selvatico NO 80 è indicata dal quadrato nero e le posizioni dei mutanti NO 80 sono indicate dai cerchi aperti. Le corsie separate dalla linea nera provengono da gel separati. La composizione dei complessi può essere valutata mediante Western blott utilizzando anticorpi contro varie subunità di NO 80.

Per esempio. Di seguito sono state valutate le sottounità del modulo del dominio terminale terminale, del modulo associato al centro Helicase e del modulo SNF due. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in un giorno, iniziando con la raccolta delle cellule e terminando con la purificazione dei complessi.

Questa tecnica consentirà ai ricercatori di purificare complessi multi subunità e sottocomplessi per cellule di mammifero al fine di studiarne le funzioni. Dopo aver visto questo video, avrai una migliore comprensione di come purificare il rimodellamento della cromatina e altri complessi proteici multi-subunità da cellule umane o altre linee cellulari di quantità di moto.