Saggi biochimici per le attività di analisi ATP-dipendente rimodellamento della cromatina Enzimi

Lo scopo della seguente procedura è quello di misurare le varie attività biochimiche di un complesso di rimodellamento della cromatina TP dipendente. Ciò si ottiene misurando uno scorrimento dipendente dal TP di un nucleosoma di posizione da un'estremità di una molecola di DNA a una posizione più centrale sul DNA utilizzando un saggio di spostamento della mobilità elettroforetica o emsa. Un metodo simile basato su EMSA può essere utilizzato per monitorare la formazione di zone mononucleo legate a complessi di rimodellamento per valutare l'attività di legame dei nucleosomi dei complessi di rimodellamento della cromatina.

Inoltre, la cromatografia su strato sottile può essere utilizzata per misurare l'attività degli APA di un complesso di rimodellamento della cromatina TP dipendente. In definitiva, questi metodi possono essere utilizzati per misurare il rimodellamento della cromatina TP dipendente dell'uomo nei complessi O 80. In questo video, dimostreremo saggi biochimici che studiano i complessi di rimodellamento della cromatina NO 80.

Un metodo simile può essere applicato anche per studiare altri complessi di rimodellamento della cromatina per eseguire il saggio di rimodellamento del nucleosoma TP dipendente. Per prima cosa preparare i substrati nucleosomici dopo aver impostato una reazione PCR da 100 microlitri come descritto nella tabella. Eseguire le reazioni di PCR in un termociclatore e quindi far passare i prodotti di reazione due volte attraverso colonne di spin prive di nucleasi per rimuovere eventuali nucleotidi non incorporati.

Successivamente, mescola due ole di P 32 marcati 6 0 1 frammenti di DNA con sei microgrammi di nucleosomi ilari in 50 microlitri di tampone e incuba la miscela a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi diluire in sequenza la miscela a 0,8 molari, 0,6 molari e 0,4 molari di cloruro di sodio con l'aggiunta di 12,5 microlitri, 20,8 microlitri e 41,6 microlitri rispettivamente di soluzione tampone tris HCL integrata con E-D-T-A-P-M-S-F e DTT incubare per 30 minuti a 30 gradi Celsius dopo ogni aggiunta, dopo l'ultima incubazione a 125 e poi 250 microlitri del tampone tris cloridrato. Ulteriormente integrato con P 40 glicerolo e PSA non indebitati in altre due diluizioni di 30 minuti, 30 gradi Celsius rispettivamente a 0,2 molari e 0,1 molari di cloruro di sodio.

Quindi conservare il substrato mononucleosomiale a quattro gradi Celsius per un massimo di tre mesi prima di impostare i saggi su gel di poliacrilammide nativi. Quindi, per ogni reazione da eseguire, combinare circa 20 nanomolari in oh 80 con la quantità appropriata di tampone EB 100 sufficiente a dare un volume di 4,75 microlitri in un siliconato pre raffreddato. La provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri ricongela immediatamente le frazioni residue di NO 80, ghiaccio secco in polvere.

Quindi, erogare 5,25 microlitri di master cocktail appena preparato in ciascuna provetta di reazione, mescolando bene pipettando su e giù. Quindi incubare le reazioni in un blocco di calore a 30 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aggiungere 1,5 microlitri di miscela di rimozione appena preparata a ciascuna provetta per terminare le reazioni, quindi miscelare ciascuna provetta di reazione.

Bene, girali verso il basso e incubali a 30 gradi Celsius per altri 30 minuti. Nel frattempo, pre-eseguire il gel nativo di poliacrilammide in un'unità di elettroforesi verticale a 100 volt per 30 minuti a quattro gradi Celsius, utilizzando 0,5 XTBE come tampone di corsa con una barra di agitazione magnetica all'interno della camera inferiore per mantenere una circolazione costante del tampone alla fine dell'incubazione con la miscela di rimozione, mescolare 2,5 microlitri di matrice di caricamento con ogni reazione. E dopo una breve centrifuga, utilizzare le punte di caricamento per caricare i campioni sul gel.

Far funzionare il gel a 200 volt per 4,5 ore a quattro gradi Celsius con circolazione tampone. Quindi trasferisci il gel in una pila di due fogli di carta da filtro e lascia cadere i filtri di carta con il gel sopra usando un involucro di plastica trasparente per rilevare il segnale. Esporre il gel a uno schermo fosfofarico di stoccaggio a quattro gradi Celsius per il tempo desiderato, quindi scansionare lo schermo con un sistema di scansione per immagini isotopiche e analizzare i dati utilizzando il software appropriato per eseguire i saggi APA dipendenti dal DNA e dal nucleosoma.

Iniziare combinando da 10 a 50 nanomolari dei sottocomplessi immunopurificati con una quantità di tampone eeb 100 sufficiente a fornire un volume di 2,2 microlitri in una provetta da microcentrifuga lubrificata pre-refrigerata da 1,5 millilitri per ogni reazione, quindi ricongelare immediatamente qualsiasi frazione contenente NO 80 in ghiaccio secco in polvere. Quindi mescolare delicatamente 2,8 microlitri di sottococktail appena preparato contenente nucleosomi di DNA o nessuno dei due con le provette di reazione contenenti l'enzima con pipettaggio su e giù e trasferire le provette in un blocco termico a 30 gradi Celsius. Successivamente, usa una matita per tracciare una linea molto leggera ad almeno 1,5 centimetri dal bordo inferiore di un polietilene 20 per 10.

Intendo cromatografia su strato sottile o lastra TLC. Quindi, posizionare 0,5 microlitri di ciascuna miscela di reazione sulla linea a 5, 15, 30 e 60 minuti dopo l'incubazione, riportando immediatamente ogni campione nel blocco termico, in modo da poter prelevare più punti temporali da una singola provetta. Dopo aver applicato l'ultimo campione, utilizzare un asciugacapelli per asciugare la piastra e quindi trasferire la piastra in una camera di vetro contenente una quantità sufficiente.

0,375 molari di fosfato di potassio per consentire l'immersione nella soluzione degli 0,5 centimetri inferiori della piastra TLC. Coprire la camera e sviluppare la reazione fino a quando la parte anteriore della fase liquida raggiunge la parte superiore della piastra TLC, a quel punto la piastra deve essere immediatamente asciugata con il phon ed esposta a uno schermo di fosfo di stoccaggio a temperatura ambiente. Infine, eseguire la scansione dello schermo con un sistema di scansione isotopica per determinare la quantità di radioattivo di un substrato TP e di un prodotto DP.

Questo primo esperimento dimostra che il complesso è purificato attraverso il flag IES due flag, N-O-A-T-E e flag NO 80 delta N hanno attività di scorrimento del nucleosoma simili, indicando che il terminale NO 80 N e/o le sue subunità associate sono superflue per il rimodellamento del nucleosoma da parte del complesso NO 80. Al contrario, il complesso viene purificato attraverso il flag NO 80 delta n delta HSA sono inattivi in questo saggio, indicando che l'attività di rimodellamento dipende dal dominio HSA degli APA NO 80 e/o delle sue subunità associate. Utilizzando una modifica della procedura del saggio di scorrimento del nucleosoma, è possibile misurare l'attività di legame dei nucleosomi dei complessi di rimodellamento della cromatina.

In questo esperimento, l'incubazione dei nucleosomi con quantità crescenti di complessi NO 80 intatti purificati attraverso la subunità NO 80 E ha portato ad una scomparsa dose-dipendente della banda corrispondente alle zone libere del mononucleo e alla comparsa di una nuova specie spostata che è migrata vicino alla parte superiore del gel. Al contrario, mentre i nucleosomi sono stati incubati con complessi più piccoli che sono stati purificati attraverso NO 80 delta N e che mancavano di un sottoinsieme di subunità NO 80, le specie spostate sono migrate più rapidamente, suggerendo che la mobilità relativa della banda super spostata è determinata dalla dimensione del saggio dei complessi. In questo esperimento finale, vengono mostrati i risultati di un saggio che confronta le attività degli APA attivati dal DNA e dal NUCLEOSOMA di due diversi sottocomplessi di NO 80.

Le macchie che migrano più lentamente corrispondono all'alfa 32 P iniziale etichettato come TP, e le specie che migrano più rapidamente sono i prodotti di reazione A DP con le aree che indicano la direzione della migrazione del solvente. Durante l'utilizzo di queste procedure, è importante ricordare di eseguire saggi che variano in termini di durata e contengono diverse concentrazioni di enzima. In questo modo si garantisce che le misurazioni vengano effettuate quando le curve del tempo di prodotto e dose-risposta sono lineari.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare le attività di legame del nucleosoma at TPAs e di scorrimento del nucleosoma dei complessi di rimodellamento della cromatina purificata. Non dimenticare che lavorare con materiali radioattivi può essere pericoloso. Si dovrebbero prendere precauzioni come indossare un camice da laboratorio e proteggere gli occhi, monitorare la contaminazione radioattiva e smaltire correttamente i rifiuti radioattivi.