Stab Ferita Lesione del Zebrafish adulti Telencefalo: Un metodo per Indagare vertebrati cervello neurogenesi e rigenerazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare la risposta cellulare e i meccanismi molecolari coinvolti nella neurogenesi adulta e nella rigenerazione e riparazione del sistema nervoso centrale. Nel pesce zebra, questo si ottiene prima generando manualmente una lesione perforando l'emisfero cefalico destro di un pesce zebra adulto. Successivamente, cinque giorni dopo l'infortunio, il pesce viene sacrificato e il suo cervello viene sezionato e incorporato in aros per il sezionamento in un ome.

Quindi le sezioni cerebrali vengono colorate mediante immunoistochimica o ibridazione in C 2 con marcatori appropriati. Al fine di osservare la proliferazione cellulare, il glio, l'agenesia e la neurogenesi si ottengono risultati che mostrano una sovraregolazione del marcatore di proliferazione, PCNA, del marcatore radiogliale S 100 beta e oli due cellule precursori degli oligodendrociti marcate con EGFP marcate nella zona ventricolare dopo la coltellata. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente tocca l'approccio transgenico per produrre ablazione specifica per tipo di tessuto o cellula è la sua semplicità, velocità ed efficienza della causa, che consente la produzione di molti cervelli danneggiati in breve tempo.

Dopo aver anestetizzato il pesce zebra adulto, secondo il protocollo di testo, posizionare i singoli pesci in una fessura in un blocco di carta velina imbevuta di trica sotto un microscopio da dissezione con luce dall'alto. Tenere delicatamente il pesce con una mano e orientarlo in modo da consentire l'accesso alla testa dall'alto con una siringa dotata di ago calibro 30. Nell'altra mano, spingere l'ago verticalmente attraverso il cranio, non più in profondità di due millimetri nella regione mediale di un emisfero cefalico.

Dopo aver introdotto la lesione cefalica, mettere il pesce in acqua fresca. Al termine, trasferire nuovamente il pesce nel sistema di flusso dell'acqua. Dopo aver lasciato che i pesci si riprendessero per il periodo di tempo desiderato e averli soppressi secondo il protocollo del testo, sacrificali sul ghiaccio e usa una forbice affilata per tagliare dietro le branchie per separare la testa dal corpo.

Incubare le teste in un XPBS per cinque minuti per consentire il sanguinamento. Quindi trasferire le teste in 4% di para formaldeide in PBS e incubare per una notte a quattro gradi Celsius o per quattro ore a temperatura ambiente Dopo la fissazione. Usa un XPBS in una capsula di Petri per lavare le teste due volte.

Quindi, sotto un microscopio da dissezione, sezionare attentamente i cervelli in PBS. Scartare qualsiasi cervello senza una lesione visibile. Trasferisci i cervelli in provette di reazione da due millilitri riempite con 1,5 millilitri di metanolo al 100% e capovolgi le provette cinque volte prima di incubarle a meno 20 gradi Celsius per almeno 16 ore.

Per reidratare il tessuto per l'immunoistochimica, incubare il cervello per cinque minuti ciascuno in una serie discendente di metanolo prima di utilizzare PBS tween 20 o PTW per lavare il cervello cinque volte. Per cinque minuti ciascuno. Successivamente, per incorporare i cervelli, utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionarli nelle cavità di un vassoio per tazze da stampaggio in polietilene, sciogliere il 2%agros in un XPBS riscaldandolo in un forno a microonde a 600 watt.

Lasciare raffreddare gli agro per tre minuti prima dell'uso. Quindi rimuovere con cura il PTW da un cervello prima di utilizzare aros per riempire completamente lo stampo. Usa l'ago di dissezione per far roteare il cervello nell'aros per lavare via il PTW e orientare il cervello con il lato ventrale verso il basso, il lato dorsale verso l'alto e posizionarlo dritto prima di lasciare raffreddare l'agros.

Utilizzando un ago da dissezione, rimuovere il blocco agros dallo stampo. Quindi, con la lama affilata del rasoio, tagliare l'agros parallelamente al cefalo dell'artiglio all'estremità posteriore del cervello. Ora taglia l'agros all'estremità anteriore del cervello prima di capovolgere il blocco in modo che si trovi sul piano posteriore.

Rimuovere l'agros in eccesso praticando tagli paralleli ai lati dorsale e ventrale del cervello. Quindi capovolgi il cervello all'indietro in modo che si trovi sul lato ventrale. Infine, taglia il blocco in un triangolo tronco in cui il cephalon si trova sul piano più piccolo.

Dopo aver preparato il viome secondo le istruzioni del produttore, utilizzare un XPBS per riempire il bagno tampone in modo che raggiunga appena la parte inferiore della lama. Quindi posiziona un piccolo punto di supercolla sulla parte superiore del disco del campione del vibratore. Quindi posizionare con cura il piano del blocco che si trova posteriormente al cervello sulla supercolla.

Utilizzare il manipolatore a microtomo per inserire il disco del campione nel vassoio del tampone e ruotare il disco del campione nella posizione desiderata. Quindi utilizzare una chiave a brugola da tre millimetri per serrare la vite e rimuovere il manipolatore. Posizionare il blocco nel bagno tampone in modo che il cephalon si trovi appena sotto la superficie con il lato dorsale del cervello rivolto verso la lama per sezionare il cervello.

Preparare una piastra a 24 pozzetti per raccogliere le sezioni aggiungendo un millilitro di tampone bloccante per cervello nei pozzetti della piastra con il microtomo vibrante. Iniziare il sezionamento a 50 micrometri di spessore, una velocità di un millimetro al secondo e una frequenza di 70 hertz. Usando un pennello sintetico, raccogli le fette sottili di aros mentre si staccano dalla lama e raccoglile nella piastra a 24 pozzetti.

Per eseguire l'immunoistochimica, bloccare i siti aspecifici per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone e aggiungere 250 microlitri di anticorpo diluito nel tampone bloccante, incubare per una notte a quattro gradi Celsius o per due ore a temperatura ambiente prima di utilizzare PTW per lavare i campioni tre volte per un minuto ciascuno. Dopo l'incubazione e gli anticorpi secondari per due ore a temperatura ambiente.

Lavare le sezioni tre volte. Utilizzare un mezzo di montaggio non fluorescente solubile in acqua per montare le sezioni. Quindi analizzare i campioni con un microscopio composto o confocale.

Se eseguita correttamente, una ferita porta a un canale della lesione che si estende dalla dorsale alla ventrale attraverso il palam del tale cephalon che guarirà dopo 35 giorni. In precedenza è stato dimostrato utilizzando l'immunoistochimica. Questa ferita innesca una sovraregolazione di PCNA e S 100 beta e un pattern di sovrapposizione da tre a sette giorni dopo la lesione, indicando la proliferazione di cellule gliali radiali.

Questa figura dimostra un accumulo transitorio di cellule precursori degli oligodendrociti o OPC in prossimità di una coltellata indotta in olig transgenico due pesci EEG FP che non è più osservata entro il giorno 35 dopo la lesione. Se la lesione non viene introdotta correttamente, il canale della lesione non sarà visibile. Una sovraregolazione di PCNA e S 100 beta o l'accumulo di OPC non è rilevabile.

Come presentato qui, uno screening di espressione sistemica che confronta i regolatori della trascrizione nel cervello dei pesci con lesioni rispetto ai cervelli di tipo selvatico ha identificato una serie di fattori che sono espressi nel telecefalo e che sono sovraregolati in risposta a lesioni. Il metodo della ferita a gradini combinato, ad esempio, con il sequenziamento profondo dell'RNA e/o l'ibridazione in situ, può aiutare a identificare nuovi geni coinvolti nella neurogenesi, rigenerazione e riparazione adulta del pesce zebra.