Un alto dosaggio Imaging contenuti per l'identificazione di neurotossina botulinica inibitori

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di sviluppare un test di screening fenotipico che IES botulinum abbia mediato la scissione del suo substrato SNAP 25 con l'obiettivo di identificare piccole molecole che inibiscono la funzione delle tossine durante la normale segnalazione nervosa. Il potenziale d'azione fa sì che SNAP 25 leghi la vescicola sinaptica alla membrana plasmatica del terminale del motoneurone, con conseguente rilascio di neurotrasmettitore. Tuttavia, quando la neurotossina botulinica è presente, viene assorbita dall'endocitosi e rilasciata nel butone sinaptico dove scinde SNAP 25 e quindi interferisce con il rilascio del neurotrasmettitore causando la paralisi.

Questo test identifica le molecole che possono inibire l'attività della tossina botulinica e quindi prevenire la scissione di SNAP 25 in presenza di tossina botulinica e quindi ripristinare il rilascio di neurotrasmettitori nella giunzione neuromuscolare. Un saggio di imaging ad alto contenuto eseguito con motoneuroni di topo è stato utilizzato per dimostrare la conservazione di SNAP 25 con conseguente identificazione di piccole molecole in grado di inibire l'attività della metalloproteasi della neurotossina botulinica. Il vantaggio principale di questa tecnologia o dei metodi esistenti, come il saggio biochimico senza cellule, è che più endpoint fenotipici possono essere catturati contemporaneamente da un singolo pozzetto contenente motoneuroni trattati con composti di screening e tossine.

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave che si incontrano durante lo screening delle librerie, come la quantificazione dell'attività cellulare e della citotossicità. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia per l'intossicazione da botulino perché può identificare inibitori che agiscono direttamente bloccando la sua attività di proteasi metallica o indirettamente attraverso la prevenzione del processo di assorbimento della tossina, o eventualmente altri meccanismi. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché l'ottimizzazione delle condizioni di immunocolorazione necessarie per il rilevamento di SNAP 25 può essere impegnativa.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la fase di immunocolorazione è difficile da perfezionare in quanto un motore intorno a sé è piuttosto delicato. Le fasi di posizionamento e lavaggio sono la chiave per sviluppare immagini di alta qualità necessarie per l'analisi a valle. Tutti gli studi che utilizzano cellule vive e tossina attiva sono eseguiti in condizioni di livello di biosicurezza due, decontaminare le aree di lavoro sia prima che dopo questi esperimenti con un detergente disinfettante al 5%, come la soluzione micro chimica.

Dopo aver differenziato le cellule staminali embrionali di topo in motoneuroni come descritto nel protocollo di testo, utilizzare una pipetta manuale a 12 canali per sostituire i vecchi terreni. Nelle piastre a 96 pozzetti con 80 microlitri di terreno di differenziazione terminale fresco, le fasi di aspirazione e dispensazione eseguono le fasi di aspirazione e dispensazione fila per fila per ridurre al minimo l'esposizione delle cellule all'aria ambiente. Successivamente, utilizzando una pipetta a 12 canali, aggiungere 10 microlitri di 10 x dei composti in esame dalla piastra di origine, quindi aspirare due volte per miscelare x.

Trattare due colonne di sei pozzetti con 10 X-D-M-S-O diluiti nel mezzo per fungere da controlli ad alto e basso segnale. Incubare le cellule con i composti per 30 minuti a sette gradi Celsius e 6% di anidride carbonica. Successivamente, diluire la neurotossina botulinica A nel PBS con il mezzo di differenziazione terminale per ottenere un residuo di lavoro finale di 10 volte utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 10 microlitri di 10 volte la neurotossina botulinica un brodo ai pozzetti designati per il trattamento e anche ai pozzetti di controllo a basso segnale.

Trattare i pozzetti designati come ad alto controllo con i soli terreni, decontaminare tutta l'usura in plastica e altri prodotti monouso che entrano in contatto con la neurotossina botulinica. A per immersione in soluzione di ipoclorito allo 0,825% in acqua per almeno 20 minuti. Etichettare chiaramente le piastre per indicare l'uso di tossine e incubare le piastre per quattro ore a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica dopo l'incubazione.

Utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere il terreno contenente la tossina e i composti da ciascun pozzetto e gettarlo in una soluzione di candeggina al 10%. Quindi aggiungere 100 microlitri di metanolo ghiacciato direttamente in ogni pozzetto per fermare la neurotossina botulinica. Una scissione proteolitica.

Successivamente, incubare le piastre per 15 minuti a temperatura ambiente per consentire la fissazione. Dopo la fissazione, maneggiare i reagenti neutralizzati scartati con protocolli di biosicurezza di livello uno e scartare di conseguenza. Dopo aver scartato il metanolo, lavare le cellule tre volte con 100 microlitri di PBS per reidratarle prima della colorazione immunologica.

La colorazione immunologica eseguita in una cabina di biosicurezza di classe due viene eseguita utilizzando una stazione di lavoro automatizzata predisposta per consentire l'accesso ai reagenti secondo necessità e senza l'intervento umano. Caricare le piastre contenenti le celle fisse nel magazzino PLATE e trasferirle sul ponte secondo necessità per le operazioni di movimentazione dei liquidi. Utilizzando la testa della pipetta 96 dotata di puntali da 250 microlitri, la workstation aspira il PBS dai pozzetti fino a 10 microlitri.

La workstation eroga 100 microlitri di tampone bloccante contenente l'1% di siero di cavallo e lo 0,1% di 20 in PBS in tutte le micropiastre. Quindi rimettere le piastre nel magazzino piastre per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone bloccante e dosare 50 microlitri di quattro microgrammi per millilitro di anticorpo BS e 0,5 microgrammi per millilitro di beta tre tubulina in tampone bloccante in tutte le piastre.

Incubare le piastre per un'ora a temperatura ambiente e poi rimuovere gli anticorpi primari e lavare tre volte con 100 microlitri di PBST. Preparare due microgrammi per millilitro, diluizioni di anticorpi secondari marcati con diversi fluoro quattro come descritto nel protocollo di testo. Erogare 50 microlitri della miscela in ciascun pozzetto e incubare per un'ora a temperatura ambiente Dopo l'incubazione, aspirare gli anticorpi secondari e lavare tre volte con 100 microlitri di PBST.

Successivamente, a 100 microlitri di PBS contenente 32 uncini micromolari, colorante per colorare il DNA per il rilevamento dei nuclei. Infine sigillare le piastre con una pellicola impermeabile alla luce per proteggere i quattro fluoro dal fotosbiancamento. Le piastre possono essere conservate a quattro gradi Celsius per settimane senza una significativa perdita di segnale.

Nel sistema di acquisizione delle immagini, specificare il tipo di piastra come smerigliatrice u. Deselezionare il layout come 96. Formatta bene il numero di campi come 16 e l'obiettivo come 20 x acqua.

Quindi selezionare i canali per l'eccitazione del nucleo di 405 nanometri. Selezionare il canale quattro per l'eccitazione del citoplasma di 640 nanometri. Selezionare il canale due per l'eccitazione del canale anticorpale antigene specifico di 561 nanometri, selezionare il canale tre.

Quindi, imposta la potenza di eccitazione di ciascun laser. L'esperimento avrà due esposizioni, un'eccitazione a uno a 640 nanometri e un'esposizione a due eccitazioni a 405 nanometri e 561 nanometri. Selezionare Benning come contenitore due.

Utilizzare i pozzetti di controllo alti per l'ottimizzazione dell'esposizione con l'intensità massima come canale SNAP 25 e utilizzare i pozzetti di controllo bassi per un'intensità minima. Regolare l'esposizione in modo che l'intensità di ciascun canale sia circa la metà del livello di saturazione o circa 2000 a 2.500 unità relative. Quindi, identifica il piano Z ottimale sul canale della maschera cellulare utilizzando lo script di correzione delta.

Nel software di analisi delle immagini, selezionare l'algoritmo neurite per segmentare i neuriti. Identificare le regioni neuritiche in base agli oggetti secondari, i neuriti, utilizzando un'espansione di meno tre pixel del canale della tubulina beta tre come maschera. Calcola l'intensità dei canali del segnale per la regione neurite e il canale della tubulina beta tre.

Selezionare i parametri desiderati per l'esportazione, come la lunghezza dei neuriti, le intensità medie di SNAP 25 beta tre, il numero di nuclei di tubulina e il numero di segmenti di neuriti. Al termine della configurazione. Trasferite le lastre dagli impilatori di lastre utilizzando il robot, caricatele nell'imager ad alto contenuto e iniziate l'acquisizione delle immagini.

Di seguito è mostrata l'analisi del box plot della percentuale di scissione calcolata dai pozzetti di controllo. Il rosa rappresenta l'alto controllo del segnale che è il pozzetto con solo fluido e senza tossine. In questi pozzi si osserva pochissima scissione.

Il blu rappresenta il controllo a basso segnale che è costituito dai pozzetti con solo tossina e nessun composto campione. Questi pozzi hanno registrato una significativa scissione. Queste distribuzioni istografiche dei valori di controllo dimostrano la distanza tra le due popolazioni di controllo.

L'obiettivo del processo di screening è quello di trovare composti all'interno della popolazione campione con valori più vicini alla popolazione di controllo positiva. La distribuzione di 192 campioni trattati con composto, che contenevano anche neurotossina botulinica A, è mostrata qui in verde. La maggior parte di questi pozzi mostrava una significativa scissione.

Tuttavia, c'erano alcuni valori anomali statisticamente significativi che non mostravano alcuna scissione significativa rispetto ai controlli. I valori di controllo sono nuovamente indicati dalle barre rosa e blu in questa distribuzione dell'istogramma. Le barre verdi mostravano la sovrapposizione dei valori del campione con i valori di controllo.

I valori del campione considerati come hit sono stati selezionati dai valori anomali che hanno valori percentuali di clivaggio inferiori a tre deviazioni standard dalla mediana della popolazione campione. Questi quattro colpi hanno valori simili al controllo ad alto segnale e rappresentano lo stesso composto, che è una nota neurotossina botulinica, un inibitore della sinanone che blocca la scissione di SNAP 25. Questo inibitore ha dimostrato una robusta protezione SNAP 25 contro la neurotossina botulinica A sia con la tossina che con la tossina e questo inibitore si è comportato in modo simile ai pozzetti senza tossina e in modo dissimile ai pozzetti con tossina, ma senza l'inibitore Una volta padroneggiato.

Questa tecnica può essere eseguita in quattro o sei ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di includere più controlli per calcolare le prestazioni statistiche del saggio e consentire una decisione di superamento per ogni singola piastra di screening Seguendo questa procedura. Altri metodi, come i saggi proteolitici biochimici, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, come una valutazione dei risultati dello screening come inibitori diretti o indiretti di Bot.

Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona idea di come automatizzare un test di screening fenotipico che utilizza la quantificazione di SNAP 25 tramite immunocolorazione come endpoint primario. Non dimenticare che lavorare con le neurotossine botuliniche può essere estremamente pericoloso e precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale e l'attuazione delle procedure di decontaminazione e smaltimento appropriate per la botina. La neurotossina deve essere sempre assunta durante l'esecuzione di questa procedura.