Generazione di Enterobacter Sp. YSU auxotrofi Utilizzando Transposon Mutagenesi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di produrre TRO di un ceppo batterico di tipo selvatico che cresce in sali minimi integrati con glucosio. Ciò si ottiene trasformando una zona transpo nel ceppo ospite di tipo selvatico per ottenere una popolazione di batteri resistente alla micina di canna con trasposizione casuale su inserti. I trasformanti successivi vengono schermati mediante placcatura di replica, che identifica i TRO che crescono su un terreno ricco, ma non riescono a crescere su sali minimi, terreno integrato con glucosio.

Successivamente, genomica, il DNA del mutante viene digerito, legato e trasformato in e coli al fine di ottenere un plasmide contenente il trasposone, fiancheggiato su ciascuna estremità da segmenti del gene interrotto. Si ottengono risultati che mostrano l'identità putativa del gene interrotto sulla base del sequenziamento del DNA e dell'analisi di base dello strumento di ricerca dell'allineamento locale. Il trasposone utilizzato in questa tecnica ha un'origine di replicazione, un gene resistente alla kanamicina e estremità a mosaico.

Per trasporre il legame proteico. Manca il gene della proteina trasposta e quindi dobbiamo aggiungere questo gene traspone con il frammento di DNA del trasposone, e quindi il complesso tra il DNA trasposivo e la proteina viene elettroporato nell'ospite. I principali vantaggi dell'elettroporazione sono l'eliminazione della necessità di trasduzione o coniugazione.

La mancanza di un gene trasposto di solito produce inserti stabili e la presenza di un'origine replicativa e di un gene di resistenza CIN consentono una facile identificazione del gene mutato, che viene recuperato come plasmide ricombinante. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia microbica, come l'identificazione dei geni necessari per la biosintesi di amminoacidi, acidi nucleici e vitamine. Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavo cercando geni di resistenza ai metalli nelle specie di enterobacter YSU e ho deciso di incorporarlo in un laboratorio di fisiologia microbica che stavo sviluppando per elettroporare cellule competenti utilizzando una coltura notturna di specie di enterobacter.

YSU preparare una diluizione da uno a 20 in terreno LB fresco e incubare a 30 gradi Celsius e 120 RPM a un OD 600 tra 0,4 e 0,6. Quando le cellule hanno raggiunto la giusta densità, raffreddarle sul ghiaccio per cinque minuti e poi centrifugare a quattro gradi Celsius e 7.000 g per cinque minuti. Scartare il surnatante e utilizzare un volume uguale di acqua ghiacciata per Resus.

Sospendere la centrifugazione delle celle a quattro gradi Celsius e 7.000 G per cinque minuti. Dopo aver ripetuto il lavaggio, scartare il surnatante e con acqua ghiacciata sospendere le cellule in un volume pari al volume del pellet cellulare. Quindi, aggiungere 0,5 microlitri della zona transpo a 40 microlitri di cellule.

Quindi posizionare la miscela di zone transpo delle celle in un veterinario per elettroporazione ghiacciato e picchiettare la miscela sul fondo del Q Vet per scuotere le cellule a 25 micro phs, 200 ohm e 2,5 kilovolt. Aggiungere immediatamente 960 microlitri di terreno SOC sterilizzato con filtro miscelato pipettando su e giù prima di trasferire le cellule in una provetta sterile da 1,5 millilitri. Incubare le cellule a 30 gradi Celsius e 120 giri/min per 45-60 minuti.

Quindi distribuire 100 microlitri di cellule su una piastra di agar LB can prima di incubare la piastra durante la notte a 30 gradi Celsius per grigliare i trasformanti. Fissare una griglia al coperchio di una capsula di Petri vuota da 100 x 15 millimetri. Disegna una linea sul fondo di una piastra di agar LB can e usa un piccolo pezzo di nastro adesivo per ancorarla al coperchio a griglia in modo che la griglia sia visibile attraverso la coclea con uno stuzzicadenti sterile.

Scegli un singolo trasformante e posizionalo al centro di un quadrato nella griglia, individua un altro trasformante in un quadrato adiacente e continua fino a quando la piastra non è piena. Quindi incubarlo per una notte a 30 gradi Celsius. Questa è la piastra principale per ogni piastra che è stata grigliata.

Crea una pila di tre piastre a coclea fresche numerate da uno a tre. Il numero uno per LB può essere il numero due per M nove può. E il numero tre per LB può asciugare le piastre a testa in giù durante la notte a 37 gradi Celsius prima dell'uso.

Dopo aver tracciato una linea sulla parte superiore di ogni piastra come dimostrato in precedenza, utilizzare il 70% di etanolo per pulire lo strumento di placcatura replica e posizionare un quadrato di veltin sterile sopra di esso prima di bloccare il quadrato di veltin verso il basso. Quindi, allinea la linea sulla piastra principale con una linea tracciata sul morsetto e posiziona la piastra sopra il quadrato di veltin. Applicare una leggera pressione per trasferire i batteri dalla piastra al quadrato di veltin.

Quindi allinea la linea tracciata sulla piastra numero uno con la linea sul morsetto e posizionala sopra il quadrato di veltin. Applicare una leggera pressione per trasferire i batteri dal quadrato di velstagno alla piastra. Rimuovere la piastra numero uno.

Scartare il quadrato di velluto in un bicchiere d'acqua e posizionare un quadrato di velluto sterile pulito sullo strumento di placcatura replica. Come prima, allineate la linea sul piatto numero uno con la linea sul morsetto e posizionatela sopra il nuovo quadrato di velluto. Applicare una leggera pressione per trasferire i batteri dal piatto numero uno al quadrato di velluto.

Togliete la piastra numero uno, allineate la linea tracciata sulla piastra numero due con una linea sul morsetto e posizionatela sopra il quadrato di velluto. Applicare una leggera pressione per trasferire i batteri dal quadrato di velluto all'unità numero due, rimuovere la piastra numero due dopo aver ripetuto il processo per la piastra numero tre, incubare le piastre durante la notte a 30 gradi Celsius. Le colonie che crescono su entrambe le piastre LB can ma non riescono a crescere su M nove piastre sono considerate trove.

Scegli i TRO dalla piastra numero uno e strisciali su una nuova piastra per lattine LB. Dopo l'incubazione durante la notte, scegli tre colonie dalla piastra di striatura e striale su una nuova piastra per lattine LB il giorno successivo. Individua le colonie dalla piastra appena striata su una piastra a griglia LB e usa questa piastra per ripetere la placcatura di replica come appena dimostrato.

Effettuare il salvataggio genetico. Usa una colonia mutante isolata per far crescere una libbra di tre millilitri. Può fermentare durante la notte a 30 gradi Celsius.

Quindi utilizzare un kit di purificazione del DNA genomico disponibile in commercio per purificare il DNA da un millilitro di coltura a 0,025 unità di BFUC un'endonucleasi di restrizione a 14 microlitri di un microgrammo per microlitro di DNA genomico in una reazione di 20 microlitri su ghiaccio. Quindi incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 25 minuti prima di trasferirla a 80 gradi Celsius per 20 minuti. Per inattivare l'enzima, analizzare tre microlitri di DNA parzialmente digerito su un gel AROS allo 0,8%.

Successivamente, aggiungere 800 unità di T 4 DNA ligasi a 15 microlitri di DNA genomico parzialmente digerito in una reazione da 500 microlitri e incubare la reazione a quattro gradi Celsius durante la notte del giorno successivo. Precipitare il DNA legato aggiungendo 50 microlitri di acetato di sodio a tre molari pH 5,5 e un millilitro di etanolo al 95% incubare a 20 gradi Celsius negativi per 20 minuti. Micro fughe il DNA a quattro gradi Celsius e 13.500 Gs per 10 minuti.

Versare le sedi supernat, sette etanolo al 70% per lavare il pellet. Asciugarlo in un concentratore centrifugo sottovuoto e utilizzare 10 microlitri di acqua priva di nucleasi. Per risospendere il DNA Utilizzare quattro microlitri di DNA risospeso per trasformare per elettroporazione il ceppo di coli coli, ECD 100 DPIR o ECD 100 DPIR uno 16 inoculare cinque millilitri di LB può medio con una singola colonia.

Coltivala a 37 gradi Celsius e 120 giri/min durante la notte. Il giorno successivo, dopo aver purificato il DNA dall'intera coltura, usa Joe one per digerire 14 microlitri di plasmide. Analizzare 10 microlitri di plasmide non digerito e digerito su un gel allo 0,8% di agarro.

Dopo il sequenziamento del plasmide cerca la sequenza cinque primi GA, G-A-C-A-G tre primi, che sono le ultime sette coppie di basi della trasposizione e saranno seguite dalla sequenza per il gene interrotto. Utilizzare blast per determinare la possibile funzione del gene interrotto. Un'elettroporazione riuscita ha prodotto diverse migliaia di trasformanti, ciascuno con almeno una trasposizione sull'inserto in questa figura.

I quadrati neri mostrano due colonie che sono cresciute sulla piastra LB can, ma non sulla piastra media minima M nine. Questi TRO probabilmente contenevano interruzioni nei geni coinvolti nella sintesi di un amminoacido, di un acido nucleico o di una vitamina, che si trovano tutti in lb, ma non in M nove, mezzo minimo. Le altre 86 colonie non hanno avuto un'interruzione in un gene necessario per la crescita su M nove.

Mezzo minimo come si vede qui, il DNA genomico parzialmente digerito da un TRO isolato va da oltre 10 kilobasi a meno di 0,5 kilobasi di dimensioni. Il plasmide recuperato è costituito dal trasposone a due kilobasi più il DNA dell'ospite fiancheggiante. Questa figura mostra il risultato di un'esplosione per un plasmide che è stato isolato da un tro.

La sequenza interrotta è simile a un gene enterobacter cloy per la mutasi ata, che è coinvolto nella biosintesi di L-tirosina, L-fenilalanina e L-triptofano a causa di molteplici fasi di crescita notturne. Questa tecnica può essere completata in 10 o 11 giorni se eseguita correttamente. Mentre si replica il pla, è importante ricordare di non spalmare le piastre e si può evitare che ciò accada utilizzando piastre asciutte e non spostando le piastre una volta che sono state posizionate sul quadrato di vellino.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come esperimenti di clonazione o complementazione per verificare la funzione del gene identificato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare TRO utilizzando la mutagenesi del trasposone e di come identificare provvisoriamente i geni mutati.