Name: Imaging intracellulare Ca 2+ Segnali di striatale astrociti da topi adulti utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Scopri l'imaging del calcio intracellulare negli astrociti striatali di topi adulti utilizzando indicatori geneticamente codificati. Questo metodo consente di visualizzare la dinamica del calcio con imaging confocale.

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La maggior parte del lavoro e del personale coinvolto sono stati sostenuti dal NIH concedere NS060677 e in parte dal NIH concede MH099559 e MH104069 (a BSK). Una parte del lavoro è stato anche sostenuto dalla Fondazione CHDI.

Tutti i protocolli di animali erano in accordo con la US National Institutes of Health Guide per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso la UCLA. 1.1) Preparare Micropipette e AAV2 / 5 Virus Loading <ol><li> Utilizzare sottili micropipette di vetro borosilicato per l&#39;iniezione del virus. Tirare la micropipetta utilizzando un programma che tira in due fasi con un estrattore verticale. Smusso la pipetta con un angolo di 40 ° utilizzando una smerigliatrice pipetta. La pipetta che è ideale per uso avrà un diametro di punta di 20 - 40 micron e una lunghezza gambo 6 - 7 mm. Autoclave la pipetta e strumenti chirurgici. Il trapano è sterilizzato strofinando con etanolo al 70%. </li><li> Conservare il virus AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml), a -80 ° C in 10 aliquote microlitri. Poco prima di un intervento chirurgico, prendere le aliquote fuori dal freezer e conservare in ghiaccio fino usato per il riempimento the micropipetta. </li><li> Riempire la micropipetta con il virus utilizzando una pompa a siringa. Collegare strettamente una estremità di un pezzo di tubo, attraverso una compressione tubo di dimensioni appropriate raccordo, ad una siringa di vetro con uno stantuffo rinforzato. Fissare la micropipetta autoclavato all&#39;altra estremità del pezzo di tubo attraverso una dimensione appropriata compressione ago asportabile raccordo. </li><li> Prima di caricare il vettore virale, rimuovere le bolle d&#39;aria dal sistema di pompaggio compresa tubazione, siringa e micropipetta dal riempimento del circuito con olio minerale colorato con Sudan IV rosso (~ 1 mg / 50 ml) in una siringa da 1 ml con un ago (27 G ). </li><li> Posizionare un pezzo di parafilm pulita sotto la micropipetta di vetro, e dispensare 5-10 ml di vettore virale sul parafilm. </li><li> Aspirare il vettore virale spostando lo stantuffo della siringa all&#39;indietro a 0.5 ml / min, e marcare il confine tra il vettore e l&#39;olio sulla pipetta di vetro. </li></ol> 1.2) Anestesia, taglio dei capelli, Head fissaggio e preparazione per craniotomia <ol><li> Mettere un mouse (P49-63, C57BL / 6) nella camera riempita con N 2 O e O 2 e 5% isoflurano. Valutare la profondità dell&#39;anestesia dalla perdita di movimento intenzionale e una frequenza respiratoria rallentato (~ 60-90 / min). Tagli capelli sulla testa quando il mouse è anestetizzato. </li><li> Montare il mouse nel telaio stereotassico, con la testa protetta da orecchio bar smussati e il naso inseriti in un sistema di anestesia e ventilazione. Mantenere isoflurano continuo a 2 - 3%. Applicare lacrime artificiali unguento per entrambi gli occhi in quanto i topi perdono la loro istintiva chiusura delle palpebre in anestesia. </li><li> Somministrare 0,05 ml di buprenorfina (0,1 mg / ml) per via sottocutanea per alleviare il dolore. </li><li> Area chirurgica pulita con il 10% di iodio povidone e il 70% di alcol tre volte, alternando tra le due soluzioni e iniziando con iodio povidone. Inizia dal fronte e pulire verso il retro per rimuovere i peli già tagliati. </li><li> Fare un incisione cutanea sulla parte superiore of testa che inizia tra gli occhi e termina tra le orecchie. </li></ol> 1.3) Craniotomia e microiniezioni <ol><li> Rimuovere il periostio facendo scorrere con un batuffolo di cotone e poi asciugare la superficie del cranio con batuffoli di cotone dentale. Fare un segno intorno al sito di iniezione, e forare intorno al bordo del segno usando una piccola bava acciaio alimentato da un trapano ad alta velocità. </li><li> Rimuovere l&#39;osso e pulire la superficie con soluzione salina. </li><li> Posizionare la pipetta nel dorsale laterale sinistro striatum con le seguenti coordinate (mm): antero-posteriore 0,8, mediale-laterale: +2.0, dorso-ventrale dalla superficie piale: -2.4 13. Si noti che queste coordinate significano che la punta dell&#39;ago microiniezione si trova appena sopra striato dorsolaterale (Figura 1A, B), nel senso che penetra leggermente all&#39;interno di questo nucleo. Evitare di danneggiare i vasi sanguigni. Se la pipetta sembra essere proprio su un vaso sanguigno, leggermente regolare lacoordinate da ~ 0,1 - 0,2 mm. </li><li> Inizia iniezione con velocità di iniezione fissato a 0,2 ml / min, e in genere iniettare 1 a 1,5 ml di virus. </li><li> Lasciare la pipetta in posizione dopo l&#39;iniezione per 10 minuti, e quindi estrarre la pipetta lentamente. </li><li> Termina con la chiusura della ferita chirurgica con sutura continua in nylon esterna sutura. </li></ol> 1.4) Recupero <ol><li> Posizionare il mouse in una gabbia pulita su una piastra elettrica per 24 ore. Non restituire un mouse che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. Non lasciare incustodito il mouse fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. </li><li> Aggiungere Trimetoprim Sulfamethoxiazole (5 ml per acqua 500 ml, contenenti 40 mg di trimetoprim e 200 mg sulfamethoxiazole) in acqua per una settimana. Somministrare Buprenorfina due volte al giorno per un massimo di 3 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Mantenere il mouse su una luce-buio ciclo di 12 ore, nutriti e abbeverati ogni giorno, unND è ponderato una volta al giorno fino a 3 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. In questi 3 giorni, qualsiasi mouse con una perdita di oltre il 10% del peso corporeo è considerato compromessa, e sarà eutanasia invece di essere sottoposto a sperimentazione. </li><li> Separatamente, cambiare la gabbia del mouse due volte alla settimana, e il monitoraggio per la salute generale, almeno una volta al giorno. In genere, il mouse viene utilizzato entro 2 - 3 settimane dopo le microiniezioni stereotassica. </li></ol> 2. acuta del cervello Fetta Preparazione per confocale Ca 2+ Imaging 2.1) Preparazione di Taglio e Soluzioni di registrazione. <ol><li> Preparare soluzione comprendente (mM) di taglio: 194 saccarosio, 30 NaCl, KCl 4,5, 10 D-glucosio, 1 MgCl2, 1,2 NaH 2 PO 4, e 26 NaHCO3, saturata con 95% O 2 e 5% di CO 2. </li><li> Preparare la soluzione di registrazione che comprende (mm): 124 NaCl, KCl 4,5, 1 MgCl 2, 10 D-glucosio, 2 CaCl 2, 1.2 NaH 2 PO 4 </sub&gt;, e 26 NaHCO 3; pH 7,3-7,4, 290-295 mOsm, saturata con 95% O 2 e 5% di CO 2. Riempire il bicchiere fetta cervello che tiene con soluzione di registrazione, e la tiene a 34 ° C. </li></ol> 2.2) Affettare <ol><li> Due o tre settimane dopo microiniezioni stereotassica, profondamente e terminali anestetizzare il mouse, e poi decapitarlo. </li><li> Estrarre il cervello, e usare una lama per rimuovere il uninjected emisfero destro, e montare il sinistro sul vassoio vibratome con colla super. Riempire il vassoio vibratome con tampone di ghiaccio taglio a freddo, e continuare a saturare con il 95% O 2 e il 5% di CO 2. </li><li> Tagliare fettine di cervello striatali coronali o sagittali a 300 micron di spessore. Di solito, 4-5 coronale, o 6-7 fette striatali sagittali possono essere raccolti. </li><li> Trasferire le fette al bicchiere con fetta riscaldato a 34 ° C, e tenerli lì per 30 minuti prima di riporli a temperatura ambiente per la successiva recording. </li><li> Incubare le sezioni di cervello di buffer di registrazione ossigenata a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima del [Ca 2+] i di imaging. </li></ol> 3. L&#39;immunoistochimica (IHC) <ol><li> Due settimane dopo l&#39;iniezione del virus, defluire in mouse transcardially con PBS seguita da 10% di formalina in PBS. </li><li> Rimuovere, post-correzione durante la notte, e cryoprotect il cervello in tamponata 30% di saccarosio per almeno 2 giorni. </li><li> Preparare 40 micron sezioni utilizzando un microtomo criostato. </li><li> Lavare le sezioni 3 volte con PBS a 10 min di intervallo. </li><li> Incubare le sezioni per 1 ora in PBS con siero normale di capra 10% e 0,5% Triton X-100. </li><li> Incubare sezioni notte a 4 ° C in anticorpo primario preparato in PBS con 0,5% Triton X-100. Gli anticorpi primari utilizzati sono i seguenti: pollo anti-GFP 1: 1.000, topo anti-S100β 1: 400, topo anti-NeuN 1: 600, topo anti-glutammina sintetasi 1: 300. </li><li> Lavare le sezioni 3 volte con PBS a 10 min intervalli. </li><li> Incubare le sezioni con anticorpi secondari preparati in PBS con siero normale di capra 10% per 2 ore a temperatura ambiente. Il secondo anticorpi sono stati i seguenti: capra anti-topo Alexa546 1: 500, capra anti-pollo Alexa488 1: 500. </li><li> Montare le sezioni su vetrini, asciutto ed applicare alcune gocce di mezzo di montaggio antifade, quindi coprire lentamente le sezioni con un coprioggetto di vetro. Conservare i vetrini a 4 ° C. </li><li> Prendete le immagini su un microscopio confocale con un obiettivo ad immersione in olio 40X con una apertura numerica di 1,3. </li></ol> 4. confocale [Ca 2+] i Imaging NOTA: [Ca 2+] i di imaging è stato fatto utilizzando un microscopio confocale con un 40X acqua ad immersione lente dell&#39;obiettivo con una apertura numerica di 0,8. <ol><li> Tra 1 e 5 ore dopo il taglio, fetta posto nella camera di registrazione e superfuse con buffer di registrazione ossigenata a temperatura ambiente con una portata di 1 - 2 ml permin. Poi posto un&#39;arpa platino con corde di nylon sulla parte superiore della fetta di ridurre al minimo il movimento durante l&#39;esperimento. </li><li> Visualizza e individuare striato dorsale con campo chiaro luminescenza con un obiettivo 10X immersione in acqua. </li><li> Passare alla lente obiettivo 40X immersione in acqua, e accendere la linea 488 nm del laser Argon. Modificando il piano focale, trovare cellule situate a circa 20 micron sotto la superficie fetta, la visualizzazione di fluorescenza basale a Soma, rami e ramoscelli. Da segnalare, le cellule compromesse solito mostrano il livello di fluorescenza di sopra della media, che dovrebbe essere evitato. </li><li> Utilizzare la modalità di &#39;scansione intermittente&#39; per avviare la scansione. Generalmente, l&#39;intensità del laser regolata a 0,5 - 5% della potenza massima è sufficiente image [Ca 2+] i con cito-GCaMP3. Per il monitoraggio [Ca 2+] i dinamiche in tutto il territorio degli astrociti, la &#39;scansione intermittente&#39;, con una velocità di scansione di 1 secondo per fotogramma o più veloce è raccnded, ma questo deve essere deciso a seconda dell&#39;esperimento in questione. </li><li> Se necessario, per l&#39;immagine [Ca 2+] i nei processi, usare lo zoom digitale di 2 - 3 volte a monitorare 1 - 2 astrociti in tutto il campo visivo. </li><li> Per evitare i pixel saturi durante la registrazione, utilizzare la modalità di ricerca &#39;HiLo&#39; per PseudoColor le cellule. Iniziare sempre con una &quot;registrazione pilota&quot; per circa 5 minuti, per verificare se il colore rosso appare come l&#39;indicazione di saturazione. In tal caso, abbassare la potenza di uscita del laser, o abbassare il PMT / guadagno / valori di offset e di effettuare un&#39;altra registrazione pilota per testare i valori dei pixel sono nell&#39;intervallo non saturo. In genere, i parametri utilizzati per l&#39;imaging combinate astrociti [Ca 2+] i nello striato sono i seguenti: potenza del laser in uscita 0,5-5% (10 mW), PMT 550-650 Volt, Guadagno 2.0 - 3.5X, e offset 0 - 5%. </li></ol>

<ol><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromodulation+by+extracellular+ATP+and+P2X+receptors+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS.</a> Neuron. 76, 51-69 (2012).</li>
<li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li>
<li>Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-derived+adenosine+and+A1+receptor+activity+contribute+to+sleep+loss-induced+deficits+in+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice.</a> J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).</li>
<li>Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+channels+are+regulators+of+astrocyte+basal+calcium+levels+and+long-term+potentiation+via+constitutive+D-serine+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release.</a> J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).</li>
<li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li>
<li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li>
<li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).</li>
<li>Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+near+plasma+membrane+and+global+intracellular+calcium+dynamics+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes.</a> J Vis Exp. 26, (2009).</li>
<li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology%3A+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).</li>
<li>Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+investigating+astrocyte-to-neuron+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li>
<li>Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+molecular+approaches+to+understanding+astrocyte+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo.</a> Front Cell Neurosci. 7, 272(2013).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. Waltham, MA. (2012).</li>
<li>Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+astrocyte+activation+modulates+response+selectivity+of+visual+cortex+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo.</a> Nat Commun. 5, 3262(2014).</li>
<li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).</li>
<li>Eid, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+glutamine+synthetase+in+the+human+epileptogenic+hippocampus%3A+possible+mechanism+for+raised+extracellular+glutamate+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Lancet. 363, 28-37 (2004).</li>
<li>Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+astrocytes--key+players+in+human+mesial+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).</li>
<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity%3A+an+underappreciated+topic+in+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li>
<li>Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+transgene+expression+after+intrastriatal+pseudotyped+rAAV2%2F1%2C+rAAV2%2F2%2C+rAAV2%2F5%2C+and+rAAV2%2F8+transduction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat.</a> Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi qui descritti hanno permesso di esprimere cito-GCaMP3 negli astrociti striatali in vivo per la successiva [Ca 2+] i di imaging in situ. Questo metodo presenta vantaggi rispetto utilizzando transgenici o topi knock-in, compreso robusta espressione della proteina bersaglio, rapidità e flessibilità di implementazione sperimentale e specificità anatomica. L&#39;espressione di GCaMP3 utilizzando AAV2 / 5 è risultato essere specifico e robusto. La combinazione di GFAP GfaABC <s...

Gli astrociti sono cellule gliali onnipresenti e abbondanti del cervello. E &#39;ben noto che gli astrociti servono di sostegno vitale e ruoli omeostatici, tra cui il buffering di K + concentrazione nello spazio extracellulare, l&#39;assorbimento di neurotrasmettitori oltre a fornire le sostanze nutritive. Tuttavia, studi recenti dimostrano che anche la visualizzazione [Ca 2+] i segnali, che si verificano spontaneamente e sono aumentate di attività neuronale 1. L&#39;esistenza di astrociti [Ca 2+] i segnalazione è stata sempre più pensato per innescare la loro comunicazione con i neuroni, e come tale è stato interpretato come una forma di &quot;Ca 2+ eccitabilità&quot; all&#39;interno di astrociti. I dati disponibili nel corso degli ultimi due decenni suggeriscono due ambienti in cui gli astrociti e neuroni possono comunicare, forse in maniera bidirezionale. In primo luogo, gli astrociti spesso rispondono con un aumento della [Ca2 +] i, quando attivato da neurotrasmettitori eneuromodulatori rilasciati dai neuroni 2. In secondo luogo, [Ca 2+] i accresce in astrociti causare il rilascio di molecole di segnalazione da astrociti, che a loro volta possono influenzare i neuroni e vasi sanguigni. L&#39;evidenza suggerisce che molecole rilasciate dagli astrociti portano a cambiamenti nelle funzioni delle sinapsi, circuiti e in ultima analisi il comportamento 3-5 tramite segnalazione astrociti-to-neurone. Tuttavia, questo rimane un settore di ricerca in rapido sviluppo, e si è sostenuto che una migliore e dettagliata comprensione di astrociti [Ca 2+] i è necessaria per risolvere alcune delle attuali incertezze 6. Nel lavoro passato, è stato dimostrato che grosso carico di organici Ca 2 + indicatore coloranti in astrociti non riesce a rilevare in modo affidabile [Ca 2+] i segnali all&#39;interno intere astrociti in coltura e in situ 7-10. Questi risultati sono stati discussi da noi e altri 6,11,12. Il Emerging quadro è che [Ca 2+] i segnali all&#39;interno dei processi di astrociti (ad esempio, rami e ramoscelli), che sono i siti principali per le interazioni con i neuroni e vasi sanguigni, sono stati raramente esplorato in dettaglio. Recentemente, l&#39;uso di indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) come GCaMP3 citosolica, GCaMP5G e GCaMP6 e membrana plasmatica versioni tethered (ad esempio, Lck-GCaMP3) ha permesso lo studio di [Ca 2+] i segnali in piccoli scomparti di astrociti tali processi sottili, vicino alla membrana plasmatica ed entro interi territori 7,8. Tuttavia, GECIS hanno uno svantaggio negli organici Ca 2+ indicatore coloranti e che è il requisito per i metodi genetici per fornire i geni che codificano selettivamente ai astrociti in vivo per periodi di settimane per il GECIS di essere adeguatamente espresso. Espressione in vivo è tipicamente realizzato utilizzando topi transgenici, knock-in topi o con virus a base di consegna appscarafaggi. Nel presente articolo Giove riportiamo i metodi e le procedure utilizzate per fornire GECIS di astrociti striatali che utilizzano virus adeno-associati. Facciamo il cito-GCaMP3 come esempio, ma la stessa procedura di base funziona per qualsiasi altra GECI o fluorescenti giornalista base di proteine.

<table><tbody><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Harvard Apparecchio</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>capillari di vetro</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Macinatore per micropipette</td><td>Narishige</td><td>EG-40</td><td></td></tr><tr><td>pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3</td><td>Addgene</td><td>44331</td><td>un plasmide inviato a UPenn Vector Core per il confezionamento di virus</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>AAV2/5 Virus</td><td>UPenn Vector Core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sudan rosso IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67386</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>CVS Farmacia</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Strumento stereotassico</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900LS</td><td></td></tr><tr><td>Kit micromotore rotativo ad alta velocità</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Super colla</td><td>Krazy Colla</td><td>KG925</td><td></td></tr><tr><td>Microaffettatrice</td><td>Ted Pella</td><td>DTK-Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopi confocali</td><td>Olympus</td><td>FV300 e FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>pollo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>topo anti-s100&beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>topo anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>topo anti-glutammina sintetasi</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>capra anti-topo-Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>capra anti-pollo-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td></td></tr><tr><td>Montaggio Medio</td><td>Vettore</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging intracellulare ca 2+ segnali di striatale astrociti da topi adulti utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificate

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Gli astrociti mostrano fluttuazioni spontanee della concentrazione intracellulare di Ca2+ ([Ca2+]i) e in diversi contesti rispondono all'eccitazione neuronale con segnali [Ca2+]i potenziati. È stato proposto che gli astrociti a loro volta regolino i neuroni e i vasi sanguigni attraverso meccanismi calcio-dipendenti, come il rilascio di molecole di segnalazione. Tuttavia, l'imaging [Ca2+]i in interi astrociti è diventato fattibile solo di recente con indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) come la serie GCaMP. L'uso dei GECI negli astrociti offre ora l'opportunità di studiare in dettaglio i segnali [Ca2+]i degli astrociti all'interno di microcircuiti modello come lo striato, che è il nucleo più grande dei gangli della base. Nel presente rapporto, vengono descritti metodi chirurgici dettagliati per esprimere GECI negli astrociti in vivo e approcci di imaging confocale per registrare i segnali [Ca2+]i negli astrociti striatali in situ. Evidenziamo le precauzioni, i controlli necessari e i test per determinare se l'espressione di GECI è selettiva per gli astrociti e per valutare i segni di reattività annunciata degli astrociti. Descriviamo anche in dettaglio le condizioni di fetta cerebrale e di imaging che consentono un imaging affidabile di [Ca2+]i negli astrociti striatali in situ. L'uso di questi approcci ha rivelato l'intero territorio di singoli astrociti striatali e segnali spontanei [Ca2+]i all'interno dei loro somata, rami e ramicelli. L'ulteriore utilizzo ed espansione di questi approcci nello striato consentirà lo studio dettagliato dei segnali astrocitari [Ca2+]i nel microcircuito striatale.

Per astrociti espressione specifica del cito-GCaMP3 nello striato, abbiamo usato il virus adeno-associato (AAV) del sierotipo 5, e la GFAP GfaABC 1 D promotore (Figura 1A), che è stato precedentemente dimostrato da guidare robusta GCaMP3 e gene reporter espressione in ippocampo e astrociti corticali 8,14. Due settimane dopo microiniezione virus nello striato del mouse, il mouse (~ 10 settimane) è stato perfuso e IHC è stata eseguita su sezioni di cervello sottili per valutare l'esp...

Le proprietà e le funzioni dei segnali intracellulari Ca2+ degli astrociti nello striato rimangono inesplorate. Descriviamo i metodi per esprimere indicatori di calcio geneticamente codificati negli astrociti striatali utilizzando virus adeno-associati del sierotipo 2/5 (AAV2/5), nonché le procedure per visualizzare in modo affidabile i segnali Ca2+ all'interno degli astrociti striatali in situ.

Imaging intracellulare Ca 2+ Segnali di striatale astrociti da topi adulti utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificate

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare i segnali intracellulari di calcio negli astrociti stri AAL di topi adulti utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati come il cito G CAMP tre. Ciò si ottiene iniettando prima il virus nello striato del topo. Quindi il topo viene lasciato riprendersi per due o tre settimane dopo l'intervento chirurgico.Successivamente, il topo viene sacrificato e vengono preparate fette acute di cervello. Il passaggio finale consiste nell'eseguire l'imaging confocale del calcio delle fette cerebrali. In definitiva, l'immunoistochimica viene utilizzata per dimostrare che il campo G 3 di Cyto è espresso solo negli astrociti ma non nei neuroni, e che l'iniezione del virus non ha causato una reattività evidente degli astrociti.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il transgenico o il nochi M, è che consente un'espressione robusta della proteina bersaglio e l'implementazione sperimentale rapida e flessibile. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione del calcio degli osteociti, ad esempio come misurare in modo affidabile i segnali del calcio degl

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Noi descriviamo come misurare vicino a membrana e globale dinamiche di calcio intracellulare negli astrociti in coltura utilizzando riflessione interna totale e epifluorescenza.

Misura Vicino membrana plasmatica e Global Dynamics calcio intracellulare negli astrociti

Un metodo per caricare zona subventricolare (SVZ) cellule con coloranti di calcio indicatori per l'attività di registrazione di calcio è descritto. Il post-natale SVZ contiene cellule ravvicinate comprese le cellule progenitrici neurali e neuroblasti. Piuttosto che utilizzare loading bagno abbiamo iniettato il colorante dalla pressione all'interno del tessuto consentendo una migliore diffusione colorante.

Preparazione di acuta fette zona subventricolare for Imaging di calcio

Fonte: Bannai, H., et. al., Dissezione dei segnali locali di Ca2+ in cellule coltivate mediante indicatori di Ca2+ mirati alla membrana. J. Vis. Exp. (2019)Il video mostra l'imaging a fluorescenza per osservare la dinamica spontanea del calcio specifica del compartimento negli astrociti, monitorando in sequenza le proteine sensibili al calcio localizzate sulla membrana plasmatica e sul reticolo endoplasmatico.

Imaging spontaneo del calcio per la dinamica compartimentale specifica negli astrociti

Qui si descrive un adattamento dei protocolli usati per indurre plasticità omeostatica nei neuroni per lo studio della plasticità dei recettori accoppiati a proteina G astrociti. Utilizzati di recente per esaminare i cambiamenti nel gruppo astrociti I mGluRs nei topi giovani, il metodo può essere applicato per misurare il ridimensionamento di diversi GPCR astrocitiche, in tessuto dai topi adulti in situ e in vivo, e di ottenere un migliore apprezzamento della sensibilità dei recettori...

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Qui presentiamo un protocollo di segnalazione in popolazioni di tipi delle cellule individuali alla giunzione neuromuscolare murino di calcio di immagine.

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

Indicatori di codificato geneticamente Ca2 + (GECIs) hanno cambiato radicalmente come in situ Ca2 + imaging viene eseguita. Per massimizzare il recupero dei dati da tali registrazioni, analisi appropriata di Ca2 + segnali è necessaria. I protocolli in questa carta facilitano la quantificazione di Ca2 + segnali registrati in situ utilizzando spatiotemporal mappatura e analisi delle particelle.

Applicazioni di mappatura spazio-temporale e tecniche di analisi delle particelle per quantificare la segnalazione intracellulare Ca2 + In Situ

Questo proctocollo mira a fornire un metodo per l'imaging mitocondriale In vitro e in vivo Ca2+ in astrociti e neuroni.

Imaging Dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI)

Il presente protocollo descrive la realizzazione di una grande finestra cranica (6 x 3 mm2) utilizzando un involucro alimentare, silicone trasparente e vetro di copertura. Questa finestra cranica consente esperimenti di imaging di calcio a campo largo e a due fotoni in vivo nello stesso topo.

In vivo Imaging del calcio a campo largo e a due fotoni da un topo utilizzando una grande finestra cranica

Questo protocollo descrive l'esposizione chirurgica del ganglio della radice dorsale (DRG) seguito da GCaMP3 (indicatore Ca2+ codificato geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging degli insiemi neuronali utilizzando topi Pirt-GCaMP3 mentre si applica una varietà di stimoli alla zampa posteriore omolaterale.

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

Questo protocollo descrive l'imaging in vivo del calcio GCaMP di neuroni del ganglio trigemino (TG) intatti. Questa descrizione include la chirurgia dell'esposizione ai TG, l'imaging al microscopio confocale in vivo dei neuroni TG, l'applicazione di stimoli somatici durante l'imaging microscopico dei neuroni TG e l'analisi dei dati di imaging del calcio GCaMP in vivo .

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari in gangli trigeminali intatti

Questo protocollo fornisce una descrizione completa di un metodo per la registrazione simultanea dei segnali di calcio provenienti da neuroni e astrociti attraverso molteplici regioni cerebrali legate alla memoria e ne dimostra l'applicazione durante un paradigma di apprendimento e comportamento della memoria.

Un metodo di fotometria a fibre a doppio colore per registrare l'attività degli astrociti-neuroni in più regioni cerebrali durante l'apprendimento e i comportamenti di memoria

Scopri l'imaging del calcio intracellulare negli astrociti striatali di topi adulti utilizzando indicatori geneticamente codificati. Questo metodo consente di visualizzare la dinamica del calcio con imaging confocale.

Imaging intracellulare Ca 2+ Segnali di striatale astrociti da topi adulti utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificate (Video) | JoVE Journal

Imaging intracellulare Ca²⁺ Segnali di striatale astrociti da topi adulti utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificate

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