Una guida al moderno Quantitative Fluorescent Western Blotting con strategie di risoluzione dei problemi

L'obiettivo di questa procedura è quello di rilevare e quantificare con precisione l'abbondanza relativa di proteine specifiche all'interno di un campione biologico complesso utilizzando la torsione e il blotting quantitativi, fluorescenti. Ciò si ottiene con i primi estratti proteici separati in elettrofluorescenza utilizzando un gel a gradiente prefabbricato. Nella seconda fase, la carica proteica equivalente viene verificata su tutte le corsie di campionamento attraverso l'applicazione di una colorazione proteica totale, quindi viene utilizzato il sistema di trasferimento rapido semi-secco del blocco oculare per trasferire i campioni sulla membrana A-P-V-D-F.

Infine, le proteine vengono sondate con anticorpi primari specifici seguiti dall'anticorpo secondario marcato con fluorescenza appropriato per facilitarne la rilevazione sensibile, robusta e lineare a lunghezze d'onda infrarosse e rosse lontane. In definitiva, la fioritura occidentale fluorescente quantitativa può essere utilizzata per rilevare, visualizzare e quantificare con precisione in modo riproducibile un gran numero di proteine solubili e legate alla membrana in un'ampia gamma di campioni di tessuto. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'imaging basato su ECL, è che consente una maggiore sensibilità con una maggiore precisione su un'ampia scala lineare per una lettura veramente quantitativa. Iniziare con la macerazione manuale del campione di tessuto, seguita dall'omogeneizzazione in un tampone di estrazione appena preparato a circa uno - 10 peso di tessuto per volume di tampone fino a produrre un omogeneizzato liscio e coerente.

Quindi, centrifugare il lisato cellulare per 20 minuti a 20.000 volte G a quattro gradi Celsius. Quindi trasferire lo stato contenente le proteine solubilizzate in una provetta da microcentrifuga pulita e conservare sia il pellet che le frazioni del surnatante S a meno 80 gradi Celsius fino al momento del bisogno. Dopo aver determinato la concentrazione proteica del supinato, trasferire 15 microgrammi di proteine per campione in nuove provette per microcentrifuga.

Quindi portare il volume finale di ogni campione fino a 10 microlitri con acqua distillata e aggiungere cinque microlitri di tampone di caricamento Forex. Agitare accuratamente le soluzioni cellulari mediante vortex, quindi riscaldare i campioni a 98 gradi Celsius per due minuti per denaturare le proteine. Dopo la denaturazione, aggiungere tre microlitri di uno standard di peso molecolare appropriato nel primo pozzetto di ciascuno dei gel sperimentali e di controllo del carico.

Successivamente, caricare 10 microlitri di ciascun campione negli appositi pozzetti successivi dopo l'elettroforesi. Usa un coltello da gel per rilasciare i gel dalla cassetta e rimuovi i pozzetti e il piede del gel. Segna il gel per facilitare l'orientamento successivo.

Quindi, per determinare il carico proteico equivalente, decantare circa 30 millilitri di colorante proteico in una piastra di Petri quadrata di 12 x 12 centimetri e posizionare il gel di controllo del carico nella colorazione, assicurandosi che la soluzione copra l'intero gel. Agitare delicatamente il gel per almeno un'ora a temperatura ambiente, quindi scartare la macchia proteica e lavare il gel tre volte in acqua distillata prima della visualizzazione per il blocco oculare. Due trasferimenti di proteine veloci semi-asciutti Dopo l'elettroforesi, preparare la pila di trasferimento inferiore rimuovendo il coperchio di alluminio e pre-bagnando la membrana con il tampone di corsa direttamente dal serbatoio del gel.

Bagnare nuovamente la carta da filtro con acqua distillata anche in questo momento. Quindi, allaccia il gel sperimentale sulla pila di trasferimento inferiore preparata, quindi stende la carta da filtro pre-lavoro sopra il gel e arrotolali entrambi per assicurarti che non rimangano intrappolate bolle tra gli strati. Appoggiare la pila superiore sopra la carta da filtro e la pila inferiore.

Quindi arrotolare il sandwich della pila di trasferimento per eliminare eventuali bolle d'aria. Inserire la spugna del kit della pila di trasferimento sul tampone assorbente e posizionare il sandwich della pila di trasferimento nell'apposito spazio. Quindi chiudi bene il coperchio e avvia il blocco I due, trasferendo le proteine per sette minuti con il programma tre.

Al termine del programma, rimuovere la pila di trasferimento dalla macchina per il blocco oculare e staccare la pila di trasferimento superiore e gli strati di carta da filtro esponendo il gel sulla pila di trasferimento inferiore. Utilizzare un bisturi per tagliare intorno al gel avendo cura di fare un taglio triangolare a scopo di orientamento sulla membrana dopo il taglio della membrana per verificare l'efficienza di trasferimento della macchia proteica, il gel come appena dimostrato, e poi spostare rapidamente la membrana in un tubo pulito da 50 millilitri contenente cinque millilitri di PBS per il primo dei tre, Lavaggi di cinque minuti su un rullo meccanico. Dopo il terzo lavaggio, eliminare il tampone di lavaggio e incubare la membrana in tampone bloccante non diluito per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, incubare la membrana in un anticorpo primario diluito in cinque millilitri di tampone bloccante e 0,1 tra 20 durante la notte a quattro gradi Celsius con agitazione costante. La mattina successiva, dopo aver scartato la soluzione di anticorpi primari, lavare la membrana sei volte per cinque minuti in PBS, come appena dimostrato. Quindi incubare la membrana al buio con un anticorpo secondario marcato con fluorescenza, dilatato in cinque millilitri di tampone bloccante e 0,1% tra 20 con agitazione costante, seguito da sei lavaggi PBS di cinque minuti per tutto l'imaging.

Innanzitutto, accedi al computer e all'imager. Quindi apri il software di imaging per visualizzare il western blot. Per prima cosa, aprire il coperchio della termocamera e versare una piccola quantità di PBS sul vetro.

Nell'angolo in basso a sinistra dell'imager, posizionare la membrana sopra il PBS assicurandosi che sia perpendicolare all'asse dell'imager e che sia rimasto uno spazio di un centimetro tra la membrana e l'asse della griglia. Arrotolare la membrana per assicurarsi che non rimangano intrappolate bolle tra il vetro e la membrana, quindi contare il numero di quadrati occupati dalla membrana sugli assi x e y. Quindi, chiudere il coperchio dell'imager e inserire il numero di quadrati nel software del computer.

Selezionare il canale a infrarossi appropriato e l'intensità appropriata, quindi avviare la scansione per visualizzare la colorazione proteica totale del gel di controllo del carico. Riparare il gel e l'imager come appena dimostrato per la membrana sperimentale, quindi selezionare il canale 700. Impostare l'intensità su cinque e avviare la scansione.

Per quantificare i dati di scansione. Inizia regolando i pulsanti di luminosità e contrasto del file scansionato per produrre la migliore qualità dell'immagine, ruotando le immagini necessarie per ottenere l'orientamento desiderato. Quindi, seleziona un rettangolo dal menu delle forme e usalo per disegnare un rettangolo attorno all'intera corsia.

Nella corsia di campionamento uno. Copia e incolla la forma intorno alla corsia uno per campionare la corsia due. Dopo aver verificato che la misurazione del fondo non incorpora un segnale nella corsia successiva, disegna un rettangolo attorno a ciascuna corsia per il resto delle corsie di campionamento.

Quindi visualizza il segnale per la tabella delle forme per ogni rettangolo disegnato in unità fluorescenti arbitrarie e salva l'immagine come bile tiff. Esistono una serie di misure di controllo che sono cruciali per garantire che vengano raccolti dati accurati durante il Western blotting fluorescente quantitativo. Ad esempio, è auspicabile includere campioni di controllo positivi.

In secondo luogo, è importante ottimizzare il tempo di trasferimento per garantire un movimento equivalente delle proteine ad alto e basso peso molecolare dal gel alla membrana. In terzo luogo, devono essere determinate le diluizioni anticorpali primarie e secondarie appropriate per evitare l'interpretazione errata delle proteine di interesse a causa del banding non specifico, come illustrato in queste immagini. In quarto luogo, è importante considerare se possa essere necessario un anticorpo secondario allevato in una specie ospite diversa, in particolare nei casi in cui non viene rilevata una banda proteica prevista.

In quinto luogo, la produzione di un gel di controllo del carico può confermare l'uniformità del carico del campione. Se combinato con un'analisi delle proteine totali, il gel può quindi essere utilizzato per confrontare e quantificare il carico proteico in ciascuna corsia a vari intervalli di peso molecolare misurato rispetto a ciascun campione. Infine, questa tecnica si presta allo stripping e al risoning di membrane con maggiore flessibilità rispetto alla luminescenza kemi a causa di fattori quali, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, una maggiore sensibilità, un fondo ridotto, il rilevamento del doppio colore e la stabilità della membrana in condizioni di conservazione a lungo termine.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il tracciamento occidentale fluorescente quantitativo per rilevare e quantificare accuratamente le proteine di interesse, nonché di come risolvere i problemi comuni che possono verificarsi durante l'esecuzione di questa tecnica.