Name: Una guida al moderno Quantitative Fluorescent Western Blotting con strategie di risoluzione dei problemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Impara il quantitative fluorescent western blotting per rilevare e quantificare proteine con elevata sensibilità e precisione. Questa metodologia migliora l'analisi proteica in campioni biologici complessi.

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Vorremmo ringrazia per il sostegno finanziario: BBSRC Istituto strategico Programma di finanziamento - CF &amp; TMW; Finanziamento BBSRC Oriente Bio DTP - LG; Il Darwin fiducia di Edimburgo - MLH. Vorremmo anche ringraziare il dottor Barry McColl il permesso di includere l&#39;ottimizzazione TREM2 in questo manoscritto.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Adeguata considerazione e pianificazione è essenziale prima di ogni esperimento e possono infine determinare il successo della tecnica utilizzata. I progressi nella rilevazione della proteina utilizzando WB può presentare una pletora di potenziali ostacoli quando si cerca di scegliere gli anticorpi del caso, di trasferimento e visualizzazione metodi da utilizzare. Per fortuna, con una lista di controllo attento e misure di controllo adeguate QFWB può essere utilizzato di routine per determinare la presenza di proteine ​​e differenze sempre più sottili di espressione tra i campioni. Questo protocollo fornisce una guida completa a fluorescenza western blotting quantitativi così come un paio di strategie di risoluzione dei problemi al fine di evitare e / o superare alcuni dei molti problemi comuni ad esso associati. Le fasi critiche impiegate per mantenere la sensibilità ed ottenere veramente misurazioni quantificabili e comparabili includono: 1) estrazione delle proteine ​​robusta da campioni di tessuto; 2) preparazione del campione; 3) accurata loadin proteineg determinata mediante analisi di proteine ​​totali; 4) trasferimento ottimale di proteine ​​che utilizzano I-Blot; 5) preparazione di anticorpi primari e secondari in tampone di bloccaggio contenente 0,1% Tween20 e 6) corretta visualizzazione e l&#39;analisi utilizzando una termocamera a raggi infrarossi e il software associato. Rilevamento a fluorescenza a raggi infrarossi è veramente quantitativa e fornisce una maggiore sensibilità rispetto alle più tradizionali tecniche di rilevazione ECL 3,11. Questo sistema di rilevamento è multi sfaccettato, e come tale non è limitato a QFWB. Questo sistema è in grado di generare immagini di etichettatura immunoistologico a bassa potenza consentendo la visualizzazione e la quantificazione delle intere sezioni di tessuto 12. Questa è una zona di sviluppo potenziale futuro in termini di risoluzione che potrebbe vedere immagini molto rosso rivaleggiare cattura immunofluorescenza convenzionale con microscopi convenzionali in termini di valutazione quantitativa. Tuttavia, con una maggiore sensibilità ai cambiamenti sottili protein espressione è fondamentale per garantire la variabilità è ridotta al minimo e le misure di controllo sono rigorosi con i protocolli robusti. Questo inizia con l&#39;estrazione delle proteine ​​rigorosa dal campione di tessuto seguita dalla produzione di proteine ​​macchiato totale gel da assicurare che il caricamento del campione è uniforme, l&#39;ottimizzazione di anticorpi primari e secondari al fine di determinare se il rilevamento è reale e testare le linee guida del produttore per quanto riguarda il trasferimento volte per ottenere un efficace trasferimento delle proteine. Tuttavia, anche quando sono ottimizzate le condizioni per WB, ci possono ancora problemi associati alla gestione di western che potrebbero non essere stati completamente esplorati qui. Questi includono ma non sono limitati a fattori tra cui proteine ​​solubilizzazione e la scelta di tampone di estrazione. Alcuni buffer possono interferire con saggi di concentrazione di proteine, e alcuni tessuti sono particolarmente difficili da solubilizzare, richiedono tecniche più robuste come l&#39;uso di macerazione automatizzatoting contenitori sigillati quali tubi M insieme ad un dissociatore Mac. Inoltre, semplici misure di controllo per la conservazione di materiale estratto e non estratti a -80 ° C può essere la differenza tra ottenere etichettatura ottimale subito dopo l&#39;estrazione ed aventi scarsi risultati settimane più tardi. Metodi QFWB moderni hanno dimostrato di essere più sensibile per l&#39;acquisizione di sottili differenze di espressione proteica e sono più versatili permettendo simultanea doppia etichettatura 3 rispetto alle tecniche più vecchi come ECL. E &#39;fondamentale che i protocolli di Western blotting sono robusti e facilmente ripetibile per la quantificazione accurata e l&#39;analisi statistica. Questo protocollo è sensibile e abbastanza robusto per essere usata come metodo per la rilevazione di proteine ​​attraverso una varietà di campioni di tessuto e specie 3 diversi e consente la quantificazione delle proteine ​​poco abbondanti e alti nella stessa QFWB riducendo così l&#39;utilizzo di consumo nonché volta per esperimento 1. 1 Inoltre, la maggiore sensibilità di questa tecnica permette la validazione di sempre più popolare - studi omiche 9,14 tuttavia la precisione è fondamentale e l&#39;inclusione di appropriate misure di controllo devono essere rispettate evitando in tal modo l&#39;acquisizione dei dati errati.

Western blotting (WB) è una tecnica analitica originariamente sviluppato alla fine del 1970 per determinare la presenza o l&#39;assenza di una proteina di interesse in un campione biologico complesso, ad esempio un tessuto omogenato 1. Comunemente denominato immunoblot proteine, a causa dell&#39;interazione antigene-anticorpo chiave, la metodologia consiste di 5 fasi distinte: 1) separazione elettroforetica delle proteine ​​da loro punto isoelettrico; 2) trasferimento ad un nitrocellulosa o di polivinilidene (PVDF) membrana; 3) etichettatura utilizzando un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse; 4) incubazione con un anticorpo secondario diretto contro l&#39;anticorpo primario; e 5) visualizzazione. Metodologia di visualizzazione si è evoluto nel tempo per migliorare la sicurezza e la sensibilità. Alcuni dei primi WB sono state effettuate utilizzando radiofoniche tag etichettati che poi progredita al chemilluminescent più diffuso (ECL) metodi colorimetrici e poi. Radioactivity è stato marcato direttamente su sonde di antigeni specifici, mentre metodologie colorimetriche e ECL utilizzano una tecnica di marcatura indiretto con un giornalista di enzimi come la fosfatasi alcalina o perossidasi streptavidina rafano (HRP) 2. L&#39;intensità di etichettatura del prodotto cromogeno o luminescente è misurata utilizzando densitometria per cui la potenza del segnale, forte o debole, indica più o meno la presenza della proteina di interesse nel campione. ECL è il più sensibile e quindi favorita la metodologia 2, ma tutti e 3 i metodi sono stati inizialmente sviluppati in un film x-ray con più sofisticate tecniche di imaging digitale successivamente stabiliti 3. L&#39;avanzamento di imaging digitale di WB consentito non solo un ricercatore per determinare la presenza o l&#39;assenza della loro proteina di interesse, ma anche consentito una deduzione al livello di espressione di una proteina selezionata quando confrontato con altri campioni e quindi può essere indicato come &quot;semi-quantitativa &amp; #8221 ;. Recentemente, una tecnologia western blotting veramente quantitativa e più sensibile è stato sviluppato per cui il livello di fluorescenza misurata è direttamente proporzionale alla quantità e l&#39;espressione di una singola proteina all&#39;interno di un campione: quantitativa fluorescente Western blotting (QFWB). Confrontando QFWB all&#39;etichettatura ECL, l&#39;utilizzo di un anticorpo secondario fluorescente genera un profilo rivelazione lineare 4. Questo è in contrasto con le tecniche ECL, dove la linearità del segnale si verifica in genere con un sacco di proteine ​​basse inferiori a 5 mg e la saturazione del segnale direttamente legati alla espressione della proteina, cioè, con geni housekeeping ubiquitariamente espressi 5,6. Questa disparità è probabilmente causato da un maggior numero di siti di legame disponibili per un substrato avidina ECL lega ad uno secondario biotinilato, risultando in una maggiore probabilità di potenziale saturazione del segnale. Questo è uno dei motivi principali per ECL base di immunoblotting essere indicato come only &quot;semi-quantitativa&quot; 7. Il punto di saturazione del segnale è di fondamentale importanza quando si misura sottili differenze nei livelli di espressione e può portare a misurazioni imprecise. Negli ultimi anni l&#39;avvento di diffuse tecniche di proteomica in dettaglio sempre maggiore sensibilità e l&#39;identificazione dei differenziali di espressione sottili ha comportato un ricorso sempre maggiore a western blotting veramente quantitativo per esperimenti di validazione 8,9. L&#39;applicazione della metodologia sensibile, robusto e veramente quantitativa è quindi cruciale. Molte metodologie di Western blotting &quot;ottimizzate&quot; sono stati utilizzati da laboratori indipendenti, che spesso risultano difficili da creare o replicare a causa di lievi modifiche metodologiche che potrebbero non essere evidenti nei protocolli formali documentate. Si tratta di un protocollo stabilito e robusto per QFWB e inoltre fornisce preziose strategie per la risoluzione dei problemi comuni that possono sorgere in fase di attuazione. Questo protocollo è stato originariamente ottimizzato per l&#39;utilizzo con omogenati di cervello di topo, ma da allora è stato effettivamente utilizzato in una vasta gamma di campioni di tessuto e specie 4,9,10. Variazioni di protocollo potenziali necessari per risolvere i problemi specifici sono inclusi.

<table><tbody><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10230544</td><td></td></tr><tr><td>M Tubes</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Stack di trasferimento iBlot, PVDF Regular</td><td>Life Technologies, Regno Unito</td><td>IB401001</td><td></td></tr><tr><td>MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td><td>Life Technologies, Regno Unito</td><td>LC5602</td><td>Utilizzare in gel 1 per Western blotting</td></tr><tr><td>SeeBlue Standard di proteine precolorate</td><td>Life Technologies, Regno Unito</td><td>LC5625&nbsp;</td><td>Utilizzare in gel 2 Gel colorato con proteine totali</td></tr><tr><td>NuPAge LDS Tampone per campioni 4x</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (solo per Bis-Tris Gel) (20x)</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 pozzetti</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Compressa salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA, Kit per il dosaggio delle proteine</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10249133</td><td></td></tr><tr><td>tampone bloccante Odyssey</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>P/N 927-40000</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD IgG anti-coniglio di capra (H+L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD IgG anti-topo d'asino (H+L), 0,5 mg&nbsp;</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW IgG anti-coniglio di capra (H + L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW IgG anti-capra d'asino (H + L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32214</td><td></td></tr><tr><td>ODYSSEY CL Imager a infrarossi</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>Richiesta di preventivo</td></tr><tr><td>iBlot 7-Minute Blotting System</td><td>Life technologies, Regno Unito</td><td></td><td>Questo modello non è più in produzione</td></tr><tr><td>InstantBlue Protein stain</td><td>Expedeon, UK</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Revitablot western blot stripping buffer&nbsp;</td><td>Rockland Immunochemicals Inc.</td><td>MB-085-0050</td><td></td></tr></tbody></table>

una guida al moderno quantitative fluorescent western blotting con strategie di risoluzione dei problemi

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

Fine del 1970 ha visto il primo uso segnalata pubblicamente del Western Blot, una tecnica per valutare la presenza e l&#39;abbondanza relativa di proteine ​​specifiche all&#39;interno di campioni biologici complessi. Da allora, la metodologia western blotting è diventata una componente comune dei biologi molecolari repertorio sperimentale. Una ricerca sommaria di PubMed usando il termine &quot;Western Blot&quot; suggerisce che in eccesso di 220.000 manoscritti pubblicati hanno fatto uso di questa tecnica per l&#39;anno 2014. È importante sottolineare che, negli ultimi dieci anni hanno visto progressi di imaging tecnici accoppiati con lo sviluppo etichette fluorescenti di sensibili che hanno migliorato la sensibilità e diedero ancora più gamme di rilevamento lineare. Il risultato è una fluorescenza ora veramente quantificabile basato Western Blot (QFWB) che permette ai biologi di effettuare analisi di espressione comparativa con maggiore sensibilità e precisione rispetto al passato. Molti &quot;ottimizzato&quot; western blottingesistono metodologie e sono utilizzati in diversi laboratori. Questi spesso risultare difficile a causa della necessità di modifiche procedurali sottili, ma senza documenti. Questo protocollo fornisce una descrizione completa di un metodo QFWB consolidata e robusto, completo di strategie di risoluzione dei problemi.

Come sensibilità QFWB e la gamma lineare di rilevamento è superiore a rilevamento convenzionale ECL, ci sono una serie di misure di controllo che sono fondamentali per garantire che i dati accurati vengono raccolti, favorendo in tal modo l&#39;interpretazione efficace. In primo luogo, l&#39;inclusione di campioni di controllo positivi come mostrato in Figura 1. In secondo luogo, l&#39;ottimizzazione di trasferimento per garantire circolazione equivalenti di proteine ​​alto e basso peso molecolare dal gel alla membrana come mostrato in Figura 2. In terzo luogo, l&#39;ottimizzazione di anticorpi, in particolare secondaria anticorpi la cui ottimizzazione è spesso trascurato, ma che può produrre non specifico banding in grado di interferire con la corretta interpretazione di proteine ​​(s) di interesse. Vedere Figura 3. In quarto luogo, esso può anche essere il caso che, quando una proteina appare rilevabile ma dovrebbe essere presente, questo può anche essere un problema di anticorpo secondario che può essere corretta tramite una semplice rais secondaricato in un ospite di specie diversa. Vedere Figura 4. In quinto luogo, l&#39;etichettatura proteine ​​totali e l&#39;analisi è un metodo molto più robusto e quantificabile in confronto all&#39;uso di proteine ​​singola tradizionale (s) che sono ubiquitariamente espresso per gli standard di riferimento interno 3. Molte di queste singole proteine ​​sono stati trovati per essere espressi in modo differenziale in modelli di malattie neurodegenerative e tra campioni di tessuto differenti e l&#39;uniformità di espressione può variare all&#39;interno dello stesso tessuto 3. Pertanto, la produzione di un gel di controllo carico confermerà l&#39;uniformità del carico del campione quando combinato con un&#39;analisi proteine ​​totali confrontando e quantificare il carico di proteine ​​in ogni corsia a vari intervalli di pesi molecolari misurati contro ogni campione per indicare errore standard come mostrato in figura 6 . È importante sottolineare che tutte queste tecniche e controlli risoluzione dei problemi sono solo efficace come la sensibilità e coerenza dell&#39;analisi tools applicati dal gestore (Figura 5). Infine questa tecnica si presta a stripping e ri-probing delle membrane con maggiore flessibilità rispetto ECL causa di fattori tra cui, ma non limitato ad una maggiore sensibilità, ridotta sfondo, rilevamento doppio colore e stabilità della membrana in condizioni di stoccaggio a lungo termine. Vedere la Figura 7.

Il progresso del western blotting utilizzando la fluorescenza ha permesso di rilevare sottili cambiamenti nell'espressione proteica consentendo analisi quantitative. Qui descriviamo una solida metodologia per il rilevamento di una serie di proteine in una varietà di specie e tipi di tessuto. Viene inoltre fornita una strategia per superare i problemi tecnici comuni.

Una guida al moderno Quantitative Fluorescent Western Blotting con strategie di risoluzione dei problemi

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

L'obiettivo di questa procedura è quello di rilevare e quantificare con precisione l'abbondanza relativa di proteine specifiche all'interno di un campione biologico complesso utilizzando la torsione e il blotting quantitativi, fluorescenti. Ciò si ottiene con i primi estratti proteici separati in elettrofluorescenza utilizzando un gel a gradiente prefabbricato. Nella seconda fase, la carica proteica equivalente viene verificata su tutte le corsie di campionamento attraverso l'applicazione di una colorazione proteica totale, quindi viene utilizzato il sistema di trasferimento rapido semi-secco del blocco oculare per trasferire i campioni sulla membrana A-P-V-D-F.Infine, le proteine vengono sondate con anticorpi primari specifici seguiti dall'anticorpo secondario marcato con fluorescenza appropriato per facilitarne la rilevazione sensibile, robusta e lineare a lunghezze d'onda infrarosse e rosse lontane. In definitiva, la fioritura occidentale fluorescente quantitativa può essere utilizzata per rilevare, visualizzare e quantificare con precisione in modo riproducibile un gran numero di proteine solubili e legate alla membrana in un'ampia gamma di campioni di tessuto. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'imaging basato su ECL, è che consente una maggiore sensibilità con una maggiore precisione su un'ampia scala lineare per una lettura veramente quantitativa. Iniziare con la macerazione manuale del campione di tessuto, seguita dall'omogeneizzazione in un tampone di estrazione appena preparato a circa uno - 10 peso di tessuto per volume di tampone fino a produrre un omogeneizzato liscio e coerente.Quindi, centrifugare il lisato cellulare per 20 minuti a 20.000 volte G a quattro gradi Celsius. Quindi trasferire lo stato contenente le proteine solubilizzate in una provetta da microcentrifuga pulita e conservare sia il pellet che le frazioni del surnatante S a meno 80 gradi Celsius fino al momento del bisogno. Dopo aver determinato la concentrazione proteica del supinato, trasferire 15 microgrammi di proteine per campione in nuove provette per microcentrifuga.Quindi portare il volume finale di ogni campione fino a 10 microlitri con acqua distillata e aggiungere cinque microlitri di tampone di caricamento Forex. Agitare accuratamente le soluzioni cellulari mediante vortex, quindi riscaldare i campioni a 98 gradi Celsius per due minuti per denaturare le proteine. Dopo la denaturazione, aggiungere tre microlitri di uno standard di peso molecolare appropriato nel primo pozzetto di ciascuno dei gel sperimentali e di controllo del carico.Successivamente, caricare 10 microlitri di ciascun campione negli appositi pozzetti successivi dopo l'elettroforesi. Usa un coltello da gel per rilasciare i gel dalla cassetta e rimuovi i pozzetti e il piede del gel. Segna il gel per facilitare l'orientamento successivo.Quindi, per determinare il carico proteico equivalente, decantare circa 30 millilitri di colorante proteico in una piastra di Petri quadrata di 12 x 12 centimetri e posizionare il gel di controllo del carico nella colorazione, assicurandosi che la soluzione copra l'intero gel. Agitare delicatamente il gel per almeno un'ora a temperatura ambiente, quindi scartare la macchia proteica e lavare il gel tre volte in acqua distillata prima della visualizzazione per il blocco oculare. Due trasferimenti di proteine veloci semi-asciutti Dopo l'elettroforesi, preparare la pila di trasferimento inferiore rimuovendo il coperchio di alluminio e pre-bagnando la membrana con il tampone di corsa direttamente dal serbatoio del gel.Bagnare nuovamente la carta da filtro con acqua distillata anche in questo momento. Quindi, allaccia il gel sperimentale sulla pila di trasferimento inferiore preparata, quindi stende la carta da filtro pre-lavoro sopra il gel e arrotolali entrambi per assicurarti che non rimangano intrappolate bolle tra gli strati. Appoggiare la pila superiore sopra la carta da filtro e la pila inferiore.Quindi arrotolare il sandwich della pila di trasferimento per eliminare eventuali bolle d'aria. Inserire la spugna del kit della pila di trasferimento sul tampone assorbente e posizionare il sandwich della pila di trasferimento nell'apposito spazio. Quindi chiudi bene il coperchio e avvia il blocco I due, trasferendo le proteine per sette minuti con il programma tre.Al termine del programma, rimuovere la pila di trasferimento dalla macchina per il blocco oculare e staccare la pila di trasferimento superiore e gli strati di carta da filtro esponendo il gel sulla pila di trasferimento inferiore. Utilizzare un bisturi per tagliare intorno al gel avendo cura di fare un taglio triangolare a scopo di orientamento sulla membrana dopo il taglio della membrana per verificare l'efficienza di trasferimento della macchia proteica, il gel come appena dimostrato, e poi spostare rapidamente la membrana in un tubo pulito da 50 millilitri contenente cinque millilitri di PBS per il primo dei tre, Lavaggi di cinque minuti su un rullo meccanico. Dopo il terzo lavaggio, eliminare il tampone di lavaggio e incubare la membrana in tampone bloccante non diluito per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.Successivamente, incubare la membrana in un anticorpo primario diluito in cinque millilitri di tampone bloccante e 0,1 tra 20 durante la notte a quattro gradi Celsius con agitazione costante. La mattina successiva, dopo aver scartato la soluzione di anticorpi primari, lavare la membrana sei volte per cinque minuti in PBS, come appena dimostrato. Quindi incubare la membrana al buio con un anticorpo secondario marcato con fluorescenza, dilatato in cinque millilitri di tampone bloccante e 0,1% tra 20 con agitazione costante, seguito da sei lavaggi PBS di cinque minuti per tutto l'imaging.Innanzitutto, accedi al computer e all'imager. Quindi apri il software di imaging per visualizzare il western blot. Per prima cosa, aprire il coperchio della termocamera e versare una piccola quantità di PBS sul vetro.Nell'angolo in basso a sinistra dell'imager, posizionare la membrana sopra il PBS assicurandosi che sia perpendicolare all'asse dell'imager e che sia rimasto uno spazio di un centimetro tra la membrana e l'asse della griglia. Arrotolare la membrana per assicurarsi che non rimangano intrappolate bolle tra il vetro e la membrana, quindi contare il numero di quadrati occupati dalla membrana sugli assi x e y. Quindi, chiudere il coperchio dell'imager e inserire il numero di quadrati nel software del computer.Selezionare il canale a infrarossi appropriato e l'intensità appropriata, quindi avviare la scansione per visualizzare la colorazione proteica totale del gel di controllo del carico. Riparare il gel e l'imager come appena dimostrato per la membrana sperimentale, quindi selezionare il canale 700. Impostare l'intensità su cinque e avviare la scansione.Per quantificare i dati di scansione. Inizia regolando i pulsanti di luminosità e contrasto del file scansionato per produrre la migliore qualità dell'immagine, ruotando le immagini necessarie per ottenere l'orientamento desiderato. Quindi, seleziona un rettangolo dal menu delle forme e usalo per disegnare un rettangolo attorno all'intera corsia.Nella corsia di campionamento uno. Copia e incolla la forma intorno alla corsia uno per campionare la corsia due. Dopo aver verificato che la misurazione del fondo non incorpora un segnale nella corsia successiva, disegna un rettangolo attorno a ciascuna corsia per il resto delle corsie di campionamento.Quindi visualizza il segnale per la tabella delle forme per ogni rettangolo disegnato in unità fluorescenti arbitrarie e salva l'immagine come bile tiff. Esistono una serie di misure di controllo che sono cruciali per garantire che vengano raccolti dati accurati durante il Western blotting fluorescente quantitativo. Ad esempio, è auspicabile includere campioni di controllo positivi.In secondo luogo, è importante ottimizzare il tempo di trasferimento per garantire un movimento equivalente delle proteine ad alto e basso peso molecolare dal gel alla membrana. In terzo luogo, devono essere determinate le diluizioni anticorpali primarie e secondarie appropriate per evitare l'interpretazione errata delle proteine di interesse a causa del banding non specifico, come illustrato in queste immagini. In quarto luogo, è importante considerare se possa essere necessario un anticorpo secondario allevato in una specie ospite diversa, in particolare nei casi in cui non viene rilevata una banda proteica prevista.In quinto luogo, la produzione di un gel di controllo del carico può confermare l'uniformità del carico del campione. Se combinato con un'analisi delle proteine totali, il gel può quindi essere utilizzato per confrontare e quantificare il carico proteico in ciascuna corsia a vari intervalli di peso molecolare misurato rispetto a ciascun campione. Infine, questa tecnica si presta allo stripping e al risoning di membrane con maggiore flessibilità rispetto alla luminescenza kemi a causa di fattori quali, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, una maggiore sensibilità, un fondo ridotto, il rilevamento del doppio colore e la stabilità della membrana in condizioni di conservazione a lungo termine.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il tracciamento occidentale fluorescente quantitativo per rilevare e quantificare accuratamente le proteine di interesse, nonché di come risolvere i problemi comuni che possono verificarsi durante l'esecuzione di questa tecnica.

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