Name: Isolamento e arricchimento di Human derivate da tessuto adiposo cellule stromali di Osteogenesi avanzata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Scopri come isolare sottopopolazioni di cellule stromali adipose umane con potenziale osteogenico avanzato mediante citometria a flusso. Questo metodo supporta la medicina rigenerativa.

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Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health Research concessione R01-DE021683-01 e National Institutes of Health Research concessione R01-DE019434 a MTL; Howard Hughes Medical Institute Research Fellowship per MTCDCW è stata sostenuta dalla ACS Franklin Martin Faculty Research Fellowship, Il Laboratorio Hagey Pediatrica Medicina Rigenerativa, e la Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.

NOTA: Tutti i campioni dei pazienti sono stati ottenuti con il consenso informato, e protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati da Stanford University Institutional Review Board (protocollo # 2188 e # 9999). 1. Isolamento delle cellule e Cultura: <ol><li> Ottenere tessuto adiposo sottocutaneo umano da pazienti di sesso femminile sani sottoposti a lipoaspirazione elettiva del ventre, fianchi, e / o regione della coscia in anestesia locale / generale. Assicurarsi che Institutional Review Board (IRB) di approvazione è stata ottenuta per il protocollo di isolare ASC da tessuti umani, e seguire le precauzioni di sicurezza istituzionali mentre si lavora con questi materiali. </li><li> Per ottenere il SVF dal tessuto adiposo lipoaspirated, prima lavare il lipoaspirato tre volte con volumi uguali di 1x tampone fosfato salino (PBS) sterile. Con attenzione aspirare ed eliminare lo strato acquoso inferiore. </li><li> Preparare il buffer collagenasi digestione: 0,075% Tipo I collagenasi a Hank diSoluzione salina bilanciata (HBSS). Preparare tampone FACS: 2% FBS, 1% P188 e l&#39;1% Pen-Strep in PBS. Filtro entrambe le soluzioni che utilizzano una dimensione dei pori 0,22 micron filtro polietersulfone flusso veloce disponibile in commercio. </li><li> Per digerire il tessuto adiposo lavato, aggiungere un volume uguale di tampone di digestione collagenasi e posizionare vaso di digestione saldamente in un bagno d&#39;acqua agitazione per 60 min a 37 ° C (circa 180 frullati / min). NOTA: E &#39;meglio utilizzare un volume di digestione nave più grande del necessario, in quanto ciò permette di digestione massima durante l&#39;agitazione (cioè, 250 ml di tampone collagenasi digestione, 250 ml di tessuto adiposo lavati in un pallone sterile 1L). </li><li> Neutralizzare attività enzimatica aggiungendo un volume uguale di tampone FACS e consentendo di sedersi a temperatura ambiente per 5 min. Successivamente, centrifugare a 233 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Aspirare accuratamente e scartare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet SVF ad alta densità. </li><li> Risospendere il pellet in 5-10 ml di RT rossotampone di lisi cellulare, in base alle dimensioni del pellet. Lasciare soluzione sedersi a temperatura ambiente per 5 min e centrifugare a 233 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet aggiungendo 5-10 ml di mezzi di crescita tradizionali, in base alle dimensioni del pellet (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% soluzione di penicillina-streptomicina [pen-strep]). </li><li> Filtrare la sospensione attraverso un 100 micron filtro cella nylon per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Centrifugare a 233 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il supernatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere il pellet in 5-10 ml di mezzi di crescita tradizionali, in base alle dimensioni del pellet. </li><li> Inserire 2 x 10 6 cellule in un piatto di coltura standard di 15 cm, stabilire colture primarie O / N a 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2. Mantenere a livelli sub-confluenti per impedire differenziazione spontanea a 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2 nei substrati. Densità cellulare in uno completamente: NOTAconfluenti 15 centimetri piatto è di circa 4-6 x 10 6 cellule. </li></ol> 2. Colorazione <ol><li> ASC culturali in mezzo di crescita tradizionale a 37 ° C / 21% O 2, 5% di CO 2, per 36 ore prima della colorazione / smistamento. </li><li> ASC Ascensore da piastre di coltura utilizzando Accutase (come da protocollo del produttore). </li><li> Lavare le cellule una volta con tampone FACS (PBS con il 2% e l&#39;1% FBS pen-strep). </li><li> Centrifugare a 233 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Scartare il surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere le cellule in 0,5-1 ml di tampone FACS (a seconda del numero di cellule e la quantità di anticorpo desiderato). NOTA: Il volume della sospensione cellulare, in conformità con le raccomandazioni del costruttore l&#39;anticorpo FACS, determina la concentrazione di anticorpi. Tuttavia, la titolazione di concentrazione di anticorpi, utilizzando una concentrazione iniziale di 1: 100, è di solito consigliata se è la prima volta di utilizzare un anticorpo. </li><li> Contare il numero totale dicellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Riserva 100 aliquote ul a 1,5 ml provette da utilizzare per un campione senza macchia e controlli solo colore (in base al numero di anticorpi fluorescenti utilizzate). </li><li> Aggiungere gli anticorpi monoclonali fluorescenza marcata adeguati (a concentrazioni predeterminate, secondo le istruzioni del produttore) e incubare per 20-30 minuti sul ghiaccio, al riparo dalla luce. <ol><li> Per etichettare sottopopolazione osteogenic: Diluire anti-CD90 (APC CD90 anti-umano (Thy1)) o anti-CD105 (FITC anti-umano CD105 (endoglin)) in tampone FACS ad una concentrazione di 1:50. </li><li> Per etichettare altre popolazioni cellulari (ad esempio, ematopoietiche e cellule endoteliali): Diluire anti-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), anti-CD34 (Anti-Human CD34 APC), e / o anti-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) in FACS tampone a una concentrazione di 1:50. </li><li> Se non si usa anticorpi coniugati direttamente, utilizzare un anticorpo primario biotinilato con un secondo streptavidina coniugato appropriatoanticorpi ary, quali streptavidina PE-Cy7, a una diluizione di 1: 100. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare le cellule due volte: riempire tubi con tampone FACS e centrifugare a 233 xg per 5 minuti a 4 ° C, aspirando surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 400-500 campioni microlitri FACS tampone e filtro attraverso un colino 70 micron cella nylon per rimuovere grumi di cellule. </li><li> Trasferire cellule marcate in tubi FACS con piano filtro e mantenere i campioni in ghiaccio per la durata dell&#39;analisi. </li></ol> 3. Fluorescence-activated cell sorting NOTA: Le seguenti operazioni impongono conoscenza nella cella fluorescenza attivate (FACS) o l&#39;assistenza di un tecnico specializzato. <ol><li> Utilizzando il software FACS appropriate, trame di analisi progettuale esaminare forward scatter (FSC), side scatter (SSC), ficoeritrina (PE) -Texas Red, Pacific Blue, fluoresceina isotiocianato (FITC), Allophycocyanin (APC) e qualsiasi altro uso fluoroforod per etichettare le cellule. </li><li> Prima di essere caricato nel cell sorter, brevemente vortice ogni campione per sospendere nuovamente le cellule. </li><li> Iniziare con analisi del campione non colorato per impostare porte per la popolazione totale di cellule, di escludere detriti cellulari, e determinare autofluorescenza basale. </li><li> Aggiungere ioduro di propidio (PI) al campione non colorato e analizzarlo per visualizzare la popolazione di cellule vive all&#39;interno della popolazione cellulare totale. Costruire un cancello intorno a questa popolazione. </li><li> Analizzare un campione di controllo unico colore per ogni fluorocromo per impostare la compensazione della fluorescenza. </li><li> Analizzare il campione colorato per impostare la posizione di porte per l&#39;ordinamento. </li><li> Aggiungere PI al campione macchiato per macchiare cellule morte. </li><li> Ordina le popolazioni di cellule etichettate. Ordina in entrambi 1,5 ml provette o tubi conici (15 ml) contenenti terreno di coltura. </li><li> Cessare manualmente classificare una volta ottenuta la quantità necessaria di cellule. </li><li> Noiing FACS, eseguire un controllo della purezza analizzando una piccola frazione (ad es., 500 cellule) della popolazione cellulare acquisita. NOTA: Questo passaggio conferma la purezza delle popolazioni cellulari ordinati. Idealmente, la purezza dovrebbe essere maggiore di 90-95%. </li><li> Cellule centrifugare a 233 xg per 5 min a 4 ° C immediatamente dopo il completamento della cernita e risospendere in 1 ml di mezzo fresco contenente 10% FBS. NOTA: La quantità di materiale utilizzato può essere aumentato in base alle dimensioni del pellet di cellule. </li><li> Piatto su piastre rivestite di gelatina per migliorare la vitalità cellulare. A seconda del rendimento cellulare finale, piastra 300.000 cellule per bene in un 6-pozzetti, 100.000 cellule per pozzetto in una piastra di 12 pozzetti. </li></ol>

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Nessuno degli autori ha un interesse finanziario in uno qualsiasi dei prodotti, dispositivi, o farmaci citati in questo manoscritto. Nessuno degli autori ha alcun concorrente interesse finanziario a riferire.

Attualmente, l&#39;isolamento di sottopopolazioni omogenei di ASC dal SVF di tessuto adiposo umano rimane una sfida anche se obiettivo auspicabile. Isolamento di sottopopolazioni ASC pro-osteogeniche è particolarmente desiderabile, poiché tali cellule possono essere usati per studiare la formazione e l&#39;omeostasi dei tessuti scheletrici. Tuttavia, la SVF di tessuto adiposo ospita una significativa eterogeneità in materia di staminali la capacità delle cellule e potenziale di differenziazione. 11 Le basi mo...

La natura eterogenea delle popolazioni di cellule staminali non è ancora completamente compresa e rimane un grave ostacolo allo sviluppo di applicazioni terapeutiche clinicamente efficaci basate sulle cellule staminali. Uno dei modi più comuni per caratterizzare una popolazione eterogenea di cellule staminali è quello di impiegare un metodo di selezione cellulare, come la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS), per separare le cellule in base ai loro profili di espressione dei marcatori di superficie. Man mano che i metodi di smistamento diventano più complessi, diventa possibile identificare sottopopolazioni funzionali di cellule più distinte. Le tecnologie basate sulla microfluidica stanno diventando sempre più frequentemente utilizzate nell'analisi dell'espressione genica a livello di singola cellula. La reazione a catena quantitativa della polimerasi multiplexata (qPCR) all'interno di un chip microfluidico consente un'analisi trascrizionale efficace e affidabile ad alta risoluzione su singola cellula. 1-5
In uno studio precedente che utilizzava il profilo trascrizionale di una singola cellula di 48 geni, è stata osservata una notevole eterogeneità trascrizionale tra gli ASC. 6 Tuttavia, la distribuzione dei geni MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 ha mostrato una forte associazione con un gruppo di cellule che possiedono profili trascrizionali altamente osteogenici. Per isolare le cellule in base a questo profilo di espressione genica osteogenica, i modelli di espressione dell'antigene di superficie sono stati correlati con i modelli di trascrizione e successivamente è stato scoperto che l'espressione del marcatore di superficie dell'endoglina (CD105) è strettamente correlata con l'aumentato potenziale di differenziazione osteogenica degli ASC. Indipendentemente dall'espressione di CD105, l'espressione del recettore di superficie Thy-1 (CD90), una proteina di membrana legata al glicosil-fosfatidilinositolo precedentemente dimostrato da Chen et al. essere associata alle cellule osteoprogenitrici, era anche correlata con l'espressione genica osteogenica. 6,7 Questi risultati offrono l'opportunità di isolare in modo prospettico sottopopolazioni all'interno del più ampio pool eterogeneo di ASC con maggiore capacità osteogenica per applicazioni di ingegneria del tessuto osseo basate su cellule.

<table><tbody><tr><td>Provette coniche monouso da 250 ml</td><td>Corning (Thomas Scientific)</td><td>2602A43</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, GlutaMAX Integratore</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Betadine - Soluzione antisettica povidone/iodio</td><td>Purdue&nbsp;</td><td>PFC-67618015017</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hank, 1X</td><td>Cellgro</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, certificato, origine USA</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi da&nbsp; Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-5G</td><td></td></tr><tr><td>ACCUTASE Soluzione di distacco cellulare</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>APC Topo Anti-Umano CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>FITC Topo anti-Umano CD105 (Endoglin)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Umano CD45 eFluor 450 (sostituzione Pacific Blue)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>48-9459-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD34 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0349-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Strumento Aria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e arricchimento di human derivate da tessuto adiposo cellule stromali di osteogenesi avanzata

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Le cellule stromali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BM-MSC) sono considerate il gold standard per le applicazioni di ingegneria tissutale basate su cellule staminali. Tuttavia, il processo mediante il quale devono essere prelevati può essere associato a una significativa morbilità del sito donatore. Al contrario, le cellule stromali di derivazione adiposa (ASC) sono più facilmente abbondanti e più facilmente raccolte, il che le rende un'alternativa interessante alle BM-MSC. Come le BM-MSC, le ASC possono differenziarsi in cellule del lignaggio osteogenico e possono essere utilizzate in applicazioni di ingegneria tissutale, come la semina su scaffold per l'uso in difetti scheletrici craniofacciali. Le ASC sono ottenute dalla frazione vascolare stromale (SVF) del tessuto adiposo digerito, che è una miscela eterogenea di ASC, cellule endoteliali vascolari e murali, cellule muscolari lisce, periciti, fibroblasti e cellule circolanti. L'analisi citofluorimetrica ha dimostrato che il profilo dei marcatori di superficie per le ASC è simile a quello per le BM-MSC. Nonostante diversi rapporti pubblicati stabiliscano marcatori per il fenotipo ASC, c'è ancora una mancanza di consenso sui profili che identificano le cellule osteoprogenitrici in questa popolazione eterogenea. Questo protocollo descrive come isolare e utilizzare una sottopopolazione di ASC con una maggiore capacità osteogenica di riparare difetti calvari di dimensioni critiche.

Utilizzando CD90 come marcatore per le cellule con risultati migliorati osteogenesi in isolamento di una popolazione altamente arricchito di ASC umani (Figura 1A, 1B). ASC sono state colorate con Pacific Blue coniugati CD45 anti-umane, coniugati con coniugato CD105 anti-umana, e APC-coniugato anti-CD90 umano. Dopo la cernita, il livello di purezza era superiore al 98%, come quantificato mediante analisi post-ordinamento. Gruppi di cellule in base ai profili trascrizionali co...

L'eterogeneità trascrizionale all'interno delle cellule stromali umane di derivazione adiposa può essere definita a livello di singola cellula utilizzando marcatori di superficie cellulare e geni osteogenici. Descriviamo un protocollo che utilizza la citometria a flusso per l'isolamento di sottopopolazioni cellulari con aumentato potenziale osteogenico, che può essere utilizzato per migliorare la ricostruzione scheletrica craniofacciale.

Isolamento e arricchimento di Human derivate da tessuto adiposo cellule stromali di Osteogenesi avanzata

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare sottopopolazioni di cellule staminali umane di derivazione adiposa con un potenziale osteogenico potenziato utilizzando la citometria a flusso assistito per raggiungere questo obiettivo. Le cellule staminali umane di derivazione adiposa o ASC vengono raccolte da lipoaspirato umano e coltivate per 36 ore. Le cellule vengono quindi colorate con anticorpi selezionati per marcare le popolazioni osteogeniche pro e le popolazioni desiderate vengono isolate utilizzando la citometria a flusso assistito.In definitiva, la fosfatasi alcalina e la colorazione con azarina rivelano un maggiore potenziale osteogenico delle cellule isolate. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla medicina rigenerativa e allo sviluppo di nuove terapie traslazionali perché descrive come isolare una sottopopolazione di ASC con osteogenesi potenziata. La seguente procedura viene eseguita utilizzando tessuto adiposo sottocutaneo umano di pazienti di sesso femminile sane che sono state sottoposte a lipoaspirazione elettiva della regione dell'addome, del fianco e/o della coscia in anestesia locale o generale.Iniziare con 500 millilitri in un litro di tessuto in un contenitore di aspirazione prelevato direttamente dalla sala operatoria. Subito dopo la raccolta, iniziare la procedura di raccolta. Ciò massimizzerà la vitalità cellulare per ottenere la frazione vascolare stromale o SVF dal tessuto adiposo lipoaspirato Inizia aggiungendo PBS sterile in un rapporto di uno a uno.Quindi agitare delicatamente il contenitore per mescolare. Dopo la miscelazione. Lasciare riposare la soluzione fino a quando non si separa in tre strati.Lo strato superiore dell'olio è chiaro e giallo. Lo strato medio di grasso è viscoso, opaco e giallo, mentre lo strato inferiore di sangue è rosso. Utilizzando con cautela una pipetta sierologica, aspirare e scartare lo strato di sangue inferiore, aspirare lo strato di olio superiore.Quindi ripeti l'operazione. Lavare altre due volte. Dopo aver preparato il tampone per la digestione della collagenasi e il tampone per fax come indicato nel documento di accompagnamento, collocarli nella cappa insieme al tampone per la lisi dei globuli rossi in modo che possano riscaldarsi a temperatura ambiente.Successivamente, trasferire il tessuto adiposo lavato in un grande pallone e digerirlo a un volume uguale di tampone per la digestione della collagenasi. Mettere il pallone in modo sicuro in un bagno d'acqua agitante per 60 minuti. A 37 gradi Celsius.È meglio utilizzare un recipiente di digestione di volume maggiore del necessario, in quanto ciò consente la massima digestione durante l'agitazione. Ad esempio, 250 di tampone digestivo collagenasi e 250 ml di tessuto adiposo lavato devono essere posti in un pallone sterile da un litro. Dopo l'incubazione, neutralizzare l'attività enzimatica aggiungendo un volume uguale di tampone fax e lasciando che il tessuto rimanga a temperatura ambiente per cinque minuti.Quindi, trasferire il tessuto digestivo in una provetta da centrifuga conica usa e getta da 250 millilitri e centrifugare a 233 Gs, o 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, aspirare il supinato e risospendere il pellet di pel aggiungendo da cinque a 10 millilitri di crescita tradizionale. Medio, a seconda delle dimensioni del pellet.Quindi pipettare la sospensione attraverso un filtro cellulare di nylon da 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri per rimuovere eventuali detriti cellulari. Dopo aver scartato il surnatante, la tavolozza dovrebbe apparire come mostrato. Qui, Reese, sospende il palato a 10 millilitri di temperatura ambiente.Tampone di lisi rosso. Lasciare riposare la soluzione a temperatura ambiente per cinque minuti e poi centrifugarla a 233 Gs per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi centrifugare a 233 Gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare la lenza senza disturbare il pellet.Quindi Resus, sospendere il pellet in 5-10 millilitri di crescita tradizionale. Medio, a seconda delle dimensioni del pellet. Dopo aver contato le cellule, posizionare 2 milioni di cellule in un piatto di coltura standard di 10 centimetri e stabilire le colture primarie durante la notte.Mantenere le cellule SVF a livelli sub confluenti per prevenire la differenziazione spontanea. 36 ore dopo la semina, sollevare le cellule utilizzando Accutane secondo il protocollo del produttore. Lavare le celle una volta con il tampone fax, quindi centrifugare a 233 Gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Dopo la rotazione, scartare la rullante senza rompere il pellet. Risospendere le cellule in 0,5-un millilitro di effetti. Buffer. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.Assegna 1,2 milioni di celle a un gruppo non ordinato che verrà placcato separatamente come controllo. Per questo esperimento, trasferire 100 quat da microlitro in un tubo einor da 1,5 millilitri. Per ogni campione da analizzare, preparare un campione non colorato più controlli di colore singolo per ciascuno degli anticorpi da utilizzare e posizionarli sul ghiaccio.Accanto all'etichettatura della sottopopolazione osteogenica diluire anti CD 90 o anti CD 1 0 5 in tampone fax per etichettare le altre popolazioni cellulari come le cellule ematopoietiche ed endoteliali diluire anti CD 45, anti CD 34 e/o anti CD 31 in tampone fax. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte riempiendo le provette con tampone fax e centrifugare a 233 Gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga aspirata, il nat dopo il secondo lavaggio risospende le cellule in 400-500 microlitri di effetti.Filtro tampone i campioni attraverso un filtro cellulare in nylon da 70 micrometri in una provetta da centrifuga per rimuovere i grumi di cellule. Eseguire lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza come descritto nel protocollo allegato. Utilizzando i grafici di analisi della progettazione del software di fatto per esaminare il fico di dispersione laterale di diffusione diretta, l'eryn, l'isotiocianato fluorescente blu del Texas Red Pacific, il cianuro di alluminio e qualsiasi altro Fluor four utilizzato per etichettare le cellule.È importante assicurarsi che i grafici di analisi dei fatti siano disegnati in modo appropriato in modo da non escludere inavvertitamente le popolazioni cellulari desiderate. Ordina le popolazioni cellulari marcate in provette da centrifuga da 1,5 millilitri o provette coniche da 15 millilitri contenenti la coltura. Il mezzo interrompe manualmente lo smistamento.Una volta ottenuta la quantità di cellule richiesta per questo esperimento, sono necessari circa 2 milioni di cellule. Successivamente, utilizzando i fatti, eseguire un controllo di purezza analizzando una piccola frazione di circa 500 cellule della popolazione cellulare acquisita. Si noti che questo passaggio conferma la purezza delle popolazioni cellulari selezionate.Idealmente, la purezza dovrebbe essere superiore al 90-95% subito dopo la selezione delle celle di centrifuga a 233 Gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi risospendere le cellule in un millilitro, terreno fresco contenente il 10% di piastra FBS, le cellule su piastre rivestite di gelatina per migliorare la vitalità cellulare. A seconda della piastra di resa delle celle finali, 300.000 celle per pozzetto in una piastra a sei pozzetti o 100.000 celle per pozzetto.In una piastra a 12 pozzetti per isolare il tessuto adiposo umano arrivano cellule stromali con aumentato potenziale osteogenico. Le ASC sono state colorate con Pacific Blue coniugato anti-umano CD 45, Fitz Conjugated Anti-Human CD 1 0 5 e A PC coniugato anti-human CD 90 e isolate come descritto in questo video come mostrato qui, l'ordinamento basato su un'alta espressione di CD 90 o bassa CD 1 0 5 ha prodotto popolazioni altamente arricchite di ASC umane per caratterizzare il potenziale osteogenico delle due sottopopolazioni. CD 90 positivi CD 1 0 5, ASC bassi e non ordinati sono stati coltivati in terreno di differenziazione osteogenica per 14 giorni, come si può vedere in questa immagine.La colorazione con fosfatasi alcalina, che funge da indicatore precoce della formazione ossea, è risultata aumentata nella popolazione positiva per la coltura CD 90 rispetto agli altri gruppi. La quantificazione con software di analisi delle immagini ha confermato che la differenza osservata era significativa. Allo stesso modo, al giorno 14, la colorazione aller e red, che viene utilizzata per rilevare la mineralizzazione della matrice extracellulare e serve come metrica per la differenziazione osteogenica terminale terminale, è stata aumentata nella popolazione CD 90 positiva rispetto ad altri gruppi. Anche la quantificazione con software di analisi delle immagini ha confermato che la differenza osservata era significativa.Questi dati indicano che le ASC CD90 positive sono in grado di mineralizzare una quantità significativamente maggiore di matrice extracellulare rispetto alle cellule non selezionate, suggerendo che le ASC isolate mantengono la capacità di subire una differenziazione osteogenica dopo la selezione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare una sottopopolazione di ASC con un potenziale osteogenico potenziato. Quando si lavora con campioni umani come descritto in questo protocollo, è importante indossare sempre indumenti protettivi adeguati.

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