Name: Un In Vitro Enzimatica Assay misurare Trascrizione inibizione da gallio (III) e H 3 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Scopri un saggio enzimatico in vitro per misurare l'inibizione della trascrizione RNA da parte di corroli gallio(III) e H₃5,10,15-tris(pentafluorofenil). Questo metodo valuta potenziali farmaci antitumorali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ringraziamo il Dott Cindy N. Chiu aiuto per elettroforesi su gel, e Andy Zhou e Michael Grodick per la loro generosa donazione di DNA e di enzima di restrizione. Noi riconosciamo con gratitudine il professor J. Heath e il professor D. Prober per l&#39;accesso generoso attrezzature e materiali. Ringraziamo il Dott Karn Sorasaenee per utili suggerimenti. Ringraziamo Mary H. Tang per creare la figura utilizzata nella panoramica schematica nel video. Il finanziamento è stato fornito da Johnson &amp; Johnson e USC Y86786.

NOTA: Quando si lavora con l&#39;RNA mantenere un ambiente di lavoro pulito per evitare la contaminazione da DNasi e RNasi enzimi che degradano il DNA e l&#39;RNA. Assicurarsi che i puntali e tubi sono DNasi e RNasi gratuito. E &#39;utile anche per pulire le superfici di laboratorio e le attrezzature, come pipette, titolari di tubi, ecc, con una soluzione di decontaminazione. 1. RNA trascrizione con trattamento Corrole <ol><li> Preparare la corrole e inibitore composti in un 0.01: 1 rapporto molare [complesso]: [DNA]. NOTA: Nel nostro caso, il rapporto era di 4,3 complessa fmol: 0.43 pmol DNA, dove il modello di DNA usato era APET-28c vettoriale con liga gene da E. coli sotto il controllo del promotore T7. Altri DNA con il promotore T7 sono anche candidati validi per l&#39;esecuzione del test di trascrizione. <ol><li> Sciogliere Actinomicina D, triptolide, tpfc, e Ga (tpfc) in dimetilsolfossido (DMSO) in contenitori separati puliti. Ottenere la concentrazione finale di 0,01: 1 rapporto molare [complex]: [DNA] utilizzando diluizioni seriali con acqua priva di nucleasi. <ol><li> Sciogliere 1 mg Actinomicina D in 1,8 ml DMSO. Aliquotare 10 microlitri di un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1/100. Aliquota 1 ml di diluizione ad un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1 / 1.000. NOTA: La concentrazione della soluzione finale di actinomicina D è 4,3 fmol. </li><li> Sciogliere 1 mg triptolide a 0.64 ml DMSO. Aliquota 1 ml ad un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1 / 1.000. Aliquota 1 ml di diluizione ad un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare un secondo 1 / 1.000 di diluizione. NOTA: La concentrazione della soluzione finale di triptolide è 4.3 fmol. </li><li> Sciogliere 1 mg tpfc in 2,9 ml DMSO. Aliquotare 10 microlitri di un contenitore separato e diluire a 1 ml con acqua priva di nucleasi per creare un 1/100 dilution. Aliquota 1 ml di diluizione ad un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1 / 1.000. NOTA: La concentrazione della soluzione finale di tpfc è 4.3 fmol. </li><li> Sciogliere 1 mg Ga (tpfc) in 2,6 ml DMSO. Aliquotare 10 microlitri di un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1/100. Aliquota 1 ml di diluizione ad un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1 / 1.000. NOTA: La concentrazione della soluzione finale di Ga (tpfc) è 4.3 fmol. NOTA: Queste corroles e inibitori non sono solubili in acqua e devono essere pre-sciolti in DMSO. Piccole quantità di DMSO (inferiore all&#39;1%) non inducono citotossicità in cellule (dati non pubblicati). </li></ol></li></ol></li><li> Prima di iniziare la reazione di trascrizione, preparare i reagenti necessari singolarmente o acquistare da un fornitore commerciale. <ol><li> Thaw sul ghiaccio tutto congelaton reagenti (fare riferimento alla Tabella 1 per un elenco di reagenti congelati). </li><li> Lasciare che il 10X Reaction Buffer e il 4 ribonucleotide (ATP, CTP, GTP, e UTP) soluzioni tempo a mescolare fino a quando non sono completamente sciolti in soluzione. </li><li> Centrifugare brevemente tutti i reagenti per prevenire la perdita di materiale sul bordo del tubo. Una volta scongelato, negozio ribonucleotidi sul ghiaccio, mantenendo il 10x Reaction Buffer a RT. </li><li> Combine reagenti per la reazione di trascrizione in RT (vedi Tabella 2 per un elenco di reagenti). NOTA: La spermidina nella 10x tampone di reazione può coprecipitato DNA stampo se la reazione è montato su ghiaccio piuttosto che a RT. </li><li> Mescolare accuratamente muovendo il tubo o la miscela pipettando su e giù delicatamente. Dopo la miscelazione, centrifugare brevemente per raccogliere miscela di reazione sul fondo della provetta. </li><li> Incubare la miscela di reazione a 37 ° C per un totale di 2-4 ore. NOTA: I tempi di reazione varieranno necessariecon dimensioni del modello di DNA e la sequenza. Questo passaggio potrebbe richiedere ottimizzazione per sequenze specifiche. Modelli più brevi possono richiedere tempi di reazione più lunghi per una elevata resa di RNA totale. </li><li> Rimuovere 4 aliquote microlitri di ogni reazione dopo ogni ora e conservare a -20 ° C. Modificare come necessario per timepoints desiderati. </li></ol></li></ol> 2. RNA Spin Column <ol><li> Dopo la reazione di trascrizione, purificare l&#39;RNA usando colonne cromatografiche compatibile microcentrifuga. NOTA:. L&#39;uso di colonne RNA selezione per purificare RNA con più del 20 basi risultati in maggiore dell&#39;80% di recupero 44 NOTA: Cromatografia su colonna è un metodo comune e conveniente per purificare RNA. Altri metodi di purificazione esistono anche come cloruro di litio precipitazione, fenolo: estrazione con cloroformio, isopropanolo precipitazione, nonché altri kit disponibili in commercio. <ol><li> Uniformemente risospendere matrice Sephadex nel buffer colonna vigorosamente invertendo lacolonna di tre o più volte. A tale scopo, sfogliando colonna bruscamente. </li><li> Rimuovere il tappo superiore dalla colonna. Ci sarà qualche matrice Sephadex residua nel cap; se il tappo è riempito con la matrice, sostituire il tappo nella colonna e ripetere l&#39;operazione precedente fino maggioranza della matrice è nella colonna. </li><li> Snap al largo della punta inferiore della colonna. Nota: alcuni liquido può fuggire dalla colonna. </li><li> Riempire la colonna. <ol><li> Mettere colonna in una sterile (RNasi e DNasi gratuito) provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Centrifugare la provetta in una centrifuga da tavolo a 1.000 xg per 1 min. </li></ol></li><li> Gettare la provetta da 1,5 ml con tampone eluito dalla colonna. </li><li> Porre immediatamente la colonna in una nuova provetta sterile da 1,5 ml e pipettare il campione al centro del letto della colonna. Utilizzare 20-50 ml di campione per evitare di sovraccaricare la colonna. </li><li> Centrifugare la provetta in una centrifuga da tavolo a 1.000 xgper 1 min. NOTA: L&#39;eluente è il campione di RNA purificato. </li></ol></li></ol> 3. Agarosio elettroforesi su gel (1% agarosio Gel) 42 NOTA: bromuro di etidio reagisce dopo il legame al DNA e RNA, pertanto tali biomolecole possono essere visualizzate con luce UV incubandoli con 0,5 mg / ml di bromuro di etidio soluzione. <ol><li> Preparare una soluzione 1,000x scorta di etidio bromuro (0,5 mg / ml) sciogliendo 5 mg di bromuro di etidio in 10 ml di acqua. </li><li> Preparare Tris Acetato EDTA (TAE) buffer di corsa per elettroforesi su gel. Per fare un buffer 50x TAE combinare 2.0 M Tris-acetato con 0,05 M di acido etilendiamminotetracetico (EDTA) e regolare il pH a 8,5. </li><li> Preparare una 1% (peso / volume) gel sciogliendo 10 g UltraPure agarosio in 1 L 1x TAE buffer e la fusione agarosio con un forno a microonde convenzionale. Una volta raffreddato a 50 ° C, aggiungere 1 ml di bromuro di etidio 1,000x al 1% gel di agarosio soluzione, mescolare agitando delicatamente o capovolgendo in un contenitore chiuso, quindi versare la soluzione di agarosio in una piattaforma-gel fusione e lasciare il gel di solidificare a temperatura ambiente. NOTA: il bromuro di etidio è mutageno e potenzialmente cancerogeno. Indossare guanti e maneggiare con cura le soluzioni. Per le procedure di manipolazione di bromuro di etidio, consultare: <a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</a> . </li><li> Dopo che il gel si è solidificato, posizionare il gel set nel serbatoio elettroforesi. Aggiungere abbastanza tampone TAE a coprire il gel fino pozzetti sono sommersi. Verificare che il livello del buffer TAE è di circa 1 mm sopra il livello del gel. Rimuovere il pettine gel. NOTA: La rimozione del pettine dopo pozzi sono sommersi impedisce sacche d&#39;aria di essere intrappolati nei pozzi. </li><li> Preparare i campioni di RNA. Combina 1 ml di ciascuna aliquota campione purificato con 1 ml Gel Loading Buffer (o con 1 ml 10x tampone di caricamento e diluted al 10 microlitri di acqua priva di nucleasi) e mescolare accuratamente pipettando su e giù con una micropipetta. NOTA: 10x tampone di caricamento contiene il 20% Ficoll 400, 0,1 M Na 2 EDTA, pH 8,0, 1,0% SDS, 0,25% blu di bromofenolo. 0,25% Xilene cianolo può anche essere aggiunto al tampone di caricamento, in quanto corre ~ 50% più velocemente blu di bromofenolo e può essere utile per monitorare tirature molto lunghe. 42 </li><li> Caricare il gel con ciascun campione pipettando accuratamente la soluzione nel fondo di ciascun pozzetto. Fare attenzione a non lasciare bolle d&#39;aria o mescolare campioni tra i pozzetti. NOTA: Una scala RNA può anche essere utilizzata per determinare la dimensione del trascritto. </li><li> Fissare i cavi in ​​modo che il DNA migrerà nel gel verso il cavo positivo. Impostare la tensione al livello desiderato, tipicamente da 1 a 10 V / cm di gel. Eseguire il gel per tutto il tempo è sufficiente per significativa separazione tra i frammenti di RNA, usando la migrazione di coloranti per monitorare l&#39;andamento della separazione. NOTE: A 23 centimetri x 25 cm gel a 250 V richiede circa 1 ora, mentre 8 cm x 8 cm gel a 150 V si terrà a circa 20 min. Frammenti di RNA più piccoli hanno una risoluzione migliore quando viene eseguito a tensioni superiori. </li><li> Spegnere l&#39;alimentazione quando il colorante dal buffer di caricamento è migrata una distanza giudicato sufficiente per la separazione tra i frammenti di RNA. </li><li> Immagine del RNA sotto luce UV come bromuro di etidio sarà fluorescenza. </li><li> Scatta una foto dell&#39;immagine e confrontare intensità di fluorescenza di RNA purificato da ogni condizione. </li></ol> 4. Quantificazione RNA tramite spettroscopia UV-Vis <ol><li> Mettere 2 ml H 2 O su un NanoDrop 2000 o macchina simile, e misurare il vuoto. </li><li> Quindi, posizionare 2 ml di ogni campione di RNA, seguenti purificazione, sulla spettrofotometro e misurare UV-Vis da una lunghezza d&#39;onda di 200 nm a 800 nm. NOTA: Un A 260 lettura di 1.0 è equivalente a circa 40 ug / ml di RNA,e RNA pura ha un A 260 / A 280 Rapporto di 2.1. 45 </li><li> Nel caso che l&#39;assorbanza è superiore a 1 OD, diluire i campioni in acqua priva di nucleasi per ottenere un OD inferiore 1. </li><li> Utilizzare software grafici per tracciare i vari campioni e confrontare OD a 260 nm. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo test dimostra che l&#39;aggiunta di Ga (tpfc) inibisce la trascrizione dell&#39;RNA paragonabile alle note che legano il DNA complessi antitumorali Actinomicina D e Triptolide. Il comportamento citotossica di Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1-154,7 micron) possono grazie alle sue proprietà anticorrosione. Poiché nessuna inibizione della trascrizione è stata osservata nel tpfc, la citotossicità di tpfc non è dovuta alla trascrizione dell&#39;RNA inibizione ma è causata da altri mezzi non ancora studiati. <p c...

La chemioterapia comporta spesso ad ampio spettro agenti citotossici con effetti collaterali indesiderati e il targeting limitata, ma con una maggiore comprensione della biologia del cancro, vi è una sempre crescente domanda di farmaci antitumorali con efficacia il cancro-targeting superiore e minori effetti collaterali. 1 le cellule tumorali umane spesso diventano dipendenti da un singolo oncogene attivato o overexpressed per la sopravvivenza 2 Così., molti farmaci antitumorali vengono valutati per la loro capacità di inibire la trascrizione dell&#39;RNA. Trattamenti che bloccano l&#39;espressione di questi geni che trasformano sono efficaci per eliminare le cellule tumorali e portano alla morte cellulare. 3 Le cellule trasformate sono più sensibili alle interruzioni di RNA di trascrizione di quelle corrispondenti cellule normali. 4 farmaci antitumorali che inibiscono la trascrizione dovrebbero inibire selettivamente la espressione degli oncogeni che sono necessari per la cellula tumorale di sopravvivere. 5 Di conseguenza, i trascrizione dell&#39;RNAnhibition è un modo utile per identificare i potenziali candidati farmaco antitumorale e saperne di più sul loro meccanismo d&#39;azione. Questo protocollo dimostra che Ga (tpfc) inibisce la trascrizione dell&#39;RNA sullo stesso ordine delle droghe di chemioterapia Actinomicina D e triptolide; paragoni simili possono essere effettuate utilizzando questo protocollo con altri farmaci candidati antitumorale. Actinomicina D è un inibitore della trascrizione di RNA comunemente usato per trattare il cancro gestazionale trofoblastica, cancro ai testicoli, tumore di Wilms, rhabdomyosacoma, e Ewing sarcoma di 6. Actinomicina D è stato utilizzato nella terapia del cancro per quasi 50 anni da quando è stata approvata dalla FDA nel 1964.Triptolide è un inibitore selettivo della trascrizione che è stata valutata in vitro e in vari modelli animali di tumore per 30 anni. 7 La natura amfifilico macrociclico di corroles conferisce vantaggi significativi rispetto ad altri classi di farmaci, quali piccole molecole o biologicas. 8-14 Il carattere macrociclico permette permeabilità cellulare che è maggiore del previsto per tali grandi molecole, e sono abbastanza grandi per interagire con superfici macromolecolari, come quelle delle proteine. 8 Corroles sono noti per formare complessi covalenti stretti con biomolecole e droghe. 10 Oltre alla citotossicità intrinseca del quadro corrole, abbiamo dimostrato che un solfonati agisce corrole come una molecola carrier per agenti chemioterapici, in particolare il antracicline doxorubicina farmaco-DNA intercalanti. Quando il corrole solfonata è stato somministrato con doxorubicina, un aumento di 3 volte nella IC 50 di doxorubicina è stata osservata per DU-145 cellule. 9 Il quadro corrole è stabile e ha assorbanza e fluorescenza intrinseche proprietà che, quando funzionalizzato, sottoposti a turni di assorbanza unici che possono essere utilizzati per la caratterizzazione. 10 Funzionalizzazione del ponteggio no intrinsecamente affetto,t le proprietà fotofisiche del corrole, 9-15 ma, come si è visto con un corrole solfonato, modificando selettivamente quadro del corrole può cambiare in modo sostanziale le sue proprietà biologiche. 16 Abbiamo già valutato sei metallocorroles contro sette linee cellulari tumorali umane. I risultati indicano che la tossicità verso cellule tumorali umane dipende lo ione metallico specifica, così come la sostituzione del gruppo funzionale. Ad esempio, corroles gallio solfonati sperimentato elevato assorbimento cellulare e penetrarono selettivamente nel nucleo delle cellule tumorali della prostata metastatico cervello (DU-145); cellule stesso corrole, anche se non penetra nel nucleo di altre linee cellulari, presenta una maggiore citotossicità per il seno (MDA-MB-231), il melanoma (SK-MEL-28), e delle ovaie (OVCAR-3) che per il cancro il cancro alla prostata. 9 Saggi cellulari iniziali indicano che questi composti promettenti come anti-cancro agenti terapeutici, quali meriti Fürthindagini er nel meccanismo di azione. L&#39;inibizione della trascrizione è osservato con alcuni complessi organometallici 17-27 e abbiamo cercato di esaminare questo processo come un possibile meccanismo per il comportamento citotossica della famiglia corrole. Questo test trascrizione fornisce un metodo semplice, poco costoso, e facile per valutare l&#39;inibizione di trascrizione, che porterà a informazioni più dettagliate sugli effetti di queste molecole in cellule vive. Qui, l&#39;inibizione della trascrizione di gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)), e il suo analogo freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figura 1) sono testati. A differenza di alcuni complessi di metalli di transizione, di gallio (III) è redox inattivo e, pertanto, non è direttamente coinvolto nel processo redox delle vie metaboliche a base redox-. 28 Indipendentemente, gallio (III) non presentano proprietà citotossiche ed è stato indagato per scopi terapeutici. Gallio è il secondo metallo più promettente per terapie antitumorali dopo platino e ha subito molti studi e ricerche; sali nitrati e cloruro di gallio sono stati valutati in studi clinici contro epatocarcinoma, linfoma, tumori della vescica, e di altre malattie. 29-34 gallio (III) è quindi l&#39;ideale per antitumorali studi corrole. I dati iniziali mostrano Ga (tpfc) e tpfc hanno un basso GI 50, la concentrazione necessaria farmaco per inibire il 50% della proliferazione cellulare massima, con varie linee cellulari tumorali (vedi figura 2); questo afferma la validità di ulteriori esperimenti su questi due composti per determinare le loro proprietà anticorrosione. Confrontiamo questi composti con i farmaci antitumorali comuni Actinomicina D e Triptolide. Actinomicina D intercala DNA, inibisce la RNA di allungamento, e induce apoptosi in alcune linee cellulari a concentrazioni picomolari 6,35-37 Triptolide ha dimostrato di inibire la crescita tumorale.; si lega a XPB umana / ERCC3, una subunità ofattore di trascrizione f TFIIH, porta alla inibizione della RNA polimerasi II attività. 6-7,38-40 Mentre è risaputo che corroles presentano proprietà citotossiche, esiste poca informazione sui diversi meccanismi derivanti dalla funzionalizzazione. L&#39;inibizione Corrole di RNA trascrizione offrirebbe una maggiore comprensione delle loro interazioni con biomacromolecole. Altri complessi noti per legarsi a DNA, come dirhodium (II, II), complessi di cromo (III), rutenio (II) polypyridyl, rodio (III), e vari altri, sono stati sottoposti a test RNA trascrizione, 18- 27 con conseguente maggiore comprensione delle loro interazioni con biomacromolecole. Questo esperimento facile e ampiamente disponibile è anche un buon test iniziale per valutare le proprietà di citotossicità di una data molecola e determinare se merita ulteriori test biologici. Il dosaggio RNA trascrizione permette anche per molte modifiche, come varying la quantità di composto o enzimi utilizzati; variando il periodo di incubazione, tempo di reazione e momenti di campionamento; e variando la lunghezza del DNA modello e sequenza, tra le altre variabili di interesse, quindi potenzialmente fornendo una grande quantità di dati. Questo test trascrizione è anche facilmente disponibili come kit a prezzi accessibili con tutti i componenti della reazione necessari previsti, anche se i componenti possono essere acquistati e preparati singolarmente. In questi esperimenti, usiamo un kit disponibile in commercio noti per avere alto rendimento. 41 Per valutare l&#39;inibizione della trascrizione, utilizziamo due metodi: elettroforesi gel e spettroscopia UV-Vis. Elettroforesi su gel di agarosio è un metodo semplice ed efficace per la separazione, l&#39;identificazione e purificazione da 0,5 a DNA e RNA frammenti di 25 kb. 42 spettroscopia UV-Vis può essere utilizzato per determinare la concentrazione e la purezza di RNA. 43

<table><tbody><tr><td>Actinomycin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1410</td><td>Negozio a 2-8 gradi C , proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>Triptolide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3652</td><td>Negozio a 2-8 &deg; C , protegge dalla luce</td></tr><tr><td>priva di nucleasi H2O&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione MEGAscript T7</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>Negozio su &ndash; 20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>ATTENZIONE: Per le corrette procedure di manipolazione del bromuro di etidio, consultare: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td></tr><tr><td>Tris Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6025</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>mini Quick Spin RNA Colonne</td><td>Roche Life Science</td><td>11814427001</td><td>Store a 2-8 gradi C , non congelare</td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td>Store at &ndash; 20 &deg; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in vitro</em&gt; enzimatica assay misurare trascrizione inibizione da gallio (iii) e h<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

La chemioterapia comporta spesso ad ampio spettro agenti citotossici con molti effetti collaterali e il targeting limitato. Corroles sono una classe di macrocicli tetrapirrolici che presentano differenziali proprietà citostatici e citotossici in linee cellulari specifici, a seconda delle identità del metallo chelato e gruppi funzionali. Il comportamento unico di corroles funzionalizzati verso linee cellulari specifiche introduce la possibilità di chemioterapia mirata. Molti farmaci antitumorali vengono valutati per la loro capacità di inibire la trascrizione dell&#39;RNA. Presentiamo qui un protocollo passo-passo per RNA trascrizione in presenza di inibitori noti e potenziali. La valutazione dei prodotti RNA della reazione di trascrizione mediante elettroforesi su gel e-Vis UV spettroscopia fornisce informazioni sulle proprietà inibitive di potenziali farmaci candidati antitumorali e, con modifiche al dosaggio, più circa il loro meccanismo d&#39;azione. Piccolosi conosce il meccanismo molecolare di azione di citotossicità corrole. In questo esperimento, consideriamo due composti corrole: gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) e analogici freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Un saggio di trascrizione dell&#39;RNA è stata utilizzata per esaminare le proprietà anticorrosione dei corroles. Cinque reazioni di trascrizione sono stati preparati: DNA trattato con Actinomicina D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc a [complesso]: [modello base DNA] rapporto 0,01, rispettivamente, e un testimone non trattato. Le reazioni di trascrizione sono stati analizzati dopo 4 ore mediante elettroforesi su gel di agarosio e spettroscopia UV-Vis. C&#39;è l&#39;inibizione chiaro Ga (tpfc), Actinomicina D, e triptolide. Questo test RNA trascrizione può essere modificato per fornire dettagli più meccanicistica variando le concentrazioni del complesso antitumorale, DNA, o enzima polimerasi, o incubando il DNA polimerasi o con il complexes prima RNA di trascrizione; queste modifiche sarebbero distinguere tra un meccanismo di inibizione coinvolge il DNA o l&#39;enzima. Aggiunta del complesso dopo la trascrizione dell&#39;RNA può essere utilizzato per verificare se i complessi degradano o idrolizzare l&#39;RNA. Questo test può anche essere usato per studiare ulteriori candidati antitumorali.

RNA Trascrizione Qualitativamente Valutazione effettuta da Gel di Agarosio Elettroforesi su gel di agarosio è utilizzato per l&#39;immagine RNA trascritto. Etidio bromuro reagisce dopo il legame (λ = 605 nm em, λ = 210 nm ex, 285 nm) 46 permette l&#39;imaging di RNA. Bande scure nel gel corrispondono a concentrazioni più elevate di RNA. Se Actinomicina D, triptolide, o sia complesso corrole inibisce la trascrizione dell&#39;RNA, la produzione...

Gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole e il suo analogo freebase presentano bassa citotossicità cellulare micromolare. Questo manoscritto descrive una reazione di trascrizione di RNA, RNA di imaging con un gel bromuro di etidio macchiate e quantificare RNA con spettroscopia UV-Vis, al fine di valutare l&#39;inibizione della trascrizione da corroles e dimostra un metodo semplice di valutare le proprietà anticancro candidati.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimatica Assay misurare Trascrizione inibizione da gallio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare se potenziali composti antitumorali inibiscono la trascrizione dell'acido ribonucleico, o RNA. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto reazioni di trascrizione dell'RNA, includendo in questo esperimento composti CHO che mostrano proprietà citotossiche differenziali, i quali vengono analizzati per l'inibizione della trascrizione dell'RNA e confrontati con inibitori noti. Dopo aver mescolato accuratamente le reazioni, i tubi vengono incubati a 37 gradi Celsius ed aliquote vengono prelevate nei tempi desiderati.Successivamente, l'elettroforesi su gel viene utilizzata per valutare l'inibizione relativa poiché un bromuro di iridio fluoresce al legame con l'RNA; bande più scure nel gel corrispondono a concentrazioni più elevate di RNA. Per quantificare il grado di inibizione della trascrizione, viene eseguita una spettroscopia ultravioletta, visibile o UV-vis. In definitiva, questo video dimostra un metodo semplice per valutare le proprietà di potenziali agenti antitumorali.Valutando l'inibizione della trascrizione da parte dei coralli, è necessario esaminare i potenziali farmaci antitumorali in base alla loro capacità di inibi

an-vitro-enzymatic-assay-to-measure-transcription-inhibition-gallium

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Questo metodo descrive la sintesi in vitro ad alto rendimento di RNA messaggero sia con cap che senza cap, a partire da un plasmide linearizzato contenente il gene della luciferasi da Gaussia (GLuc). L'RNA viene purificato e una frazione dell'RNA senza cap viene cappata enzimaticamente utilizzando l'enzima di cappatura del virus della Vaccinia. Nell'ultima fase, l'mRNA viene trasfettato in cellule HeLa e i supernatanti delle colture cellulari vengono sottoposti a saggio per l'attività della...

Trascrizione in vitro e tappatura mRNA Luciferase Gaussia Seguito da cellule HeLa Transfection

Questo protocollo descrive una procedura sperimentale per la rapida costruzione di fattori di trascrizione artificiali (ATF) con i reporter GFP cognate e la quantificazione della capacità ATF di stimolare l'espressione della GFP mediante citometria a flusso.

Sintesi rapida e screening dei fattori di trascrizione attivati ​​chimicamente con i giornalisti a base di GFP-

L'omeostasi del calcio del reticolo endoplasmatico è interrotta in diverse patologie.  Un reporter della proteina di monitoraggio del calcio ER secreta (SERCaMP) può essere utilizzato per rilevare le interruzioni nella riserva di calcio ER.   Questo protocollo descrive l'uso di una Gaussia luciferasi SERCaMP per esaminare l'omeostasi del calcio ER in vitro e in vivo.

Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasi SERCaMP

In questo lavoro forniamo un flusso di lavoro sperimentale su come i potenziatori attivi possono essere identificati e convalidati sperimentalmente.

Previsione e Validazione del gene regolatore elementi attivato durante retinoico Acid Induced embrionali cellule staminali Differenziazione

In questo manoscritto, descriviamo un protocollo per esaminare funzionalmente la trascrizione e l'attività inibitoria di agenti antibatterici che mirano alla trascrizione batterica.

In vitro trascrizione saggi e la loro applicazione in Drug Discovery

C'è una domanda per fare pre-clinica test per una nuova classe di farmaci "orfani" chiamato chaperoni farmacologici riproducibile, veloce ed efficiente. Abbiamo sviluppato un test cellulari semplice, altamente standardizzate e versatile cultura alla schermata per i pazienti eleggibili come pure droghe romanzo chaperoni farmacologici.

In Vitro Misurazione di enzima per Test farmacologici Chaperone reattività in Fabry e malattia di Pompe

Qui descriviamo il protocollo standard per la rilevazione di attività di β-galattosidasi in primi embrioni di topo intero e il metodo per paraffina sezionamento e colorazione di contrasto. Si tratta di una procedura facile e veloce per monitorare l'espressione genica durante lo sviluppo che può essere applicato anche a sezioni di tessuto, organi o cellule coltivate.

L'analisi di espressione genica tramite rilevazione di attività di β-galattosidasi in embrioni di topo intero

Regolamento dell'ambiente della cromatina è un processo essenziale necessario per l'espressione genica corretto. Qui, descriviamo un metodo per il controllo dell'espressione genica attraverso il reclutamento di modificante la cromatina macchinari in modo gene-specifico e reversibile.

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

L'immunoprecipitazioni della chromatina (ChIP) è un potente strumento per comprendere i meccanismi molecolari della regolazione genica. Tuttavia, il metodo comporta difficoltà nell'ottenere la frammentazione della cromatina riproducibile mediante tosatura meccanica. Qui, forniamo un protocollo migliorato per un saggio ChIP utilizzando la digestione ezimatica.

Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

Questo protocollo utilizza una reazione a catena di polimerasi in tempo reale basata su sonda (PCR), un saggio SRB (sulforhodamine B), una clonazione di 3 regioni non tradotte (3' UTR) e un analisi luciferasi per verificare i geni bersaglio di un miRNA di interesse e per comprendere le funzioni dei miRNA.

Un protocollo in vitro per la valutazione dei livelli, delle funzioni e dei geni target associati nelle cellule tumorali

Le DNA metiltransferasi sono potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Qui, viene presentato un protocollo per valutare piccole molecole per l'inibizione della DNA metiltransferasi. Questo test utilizza un'endonucleasi per accoppiare la metilazione del DNA alla generazione di fluorescenza e consente di monitorare l'attività enzimatica in tempo reale.

Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

Scopri un saggio enzimatico in vitro per misurare l'inibizione della trascrizione RNA da parte di corroli gallio(III) e H₃5,10,15-tris(pentafluorofenil). Questo metodo valuta potenziali farmaci antitumorali.

Un

Esplora altri video