Valutare l'efficacia delle Cancer Drug Sensibilizzazione In Vitro E In Vivo

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare l'efficacia della sensibilizzazione ai farmaci antitumorali misurando i cambiamenti nel metabolismo cellulare in vitro e la frequenza metastatica in vivo. Ciò si ottiene sezionando prima le cellule tumorali in vitro con molecole antisenso per abbattere il bersaglio di interesse. Successivamente, le cellule trasfettate vengono piastrate su chip biosensori e caricate in un sistema di misurazione del metabolismo per enumerare i cambiamenti nell'acidificazione, nella respirazione e nell'adesione durante il trattamento farmacologico.

Separatamente, le cellule trasfettate vengono trattate con un farmaco e iniettate nella circolazione venosa di un embrione di pollo al fine di valutare gli effetti sulla frequenza metastatica. I risultati mostrano la sensibilizzazione ai farmaci antitumorali come illustrato dai cambiamenti nel metabolismo cellulare e nella frequenza metastatica. Questa tecnica estende lo sviluppo della terapia antitumorale perché consente la valutazione simultanea di parametri che non sono sempre considerati durante i test preclinici convenzionali di bersagli farmacologici o composti.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su nuovi bersagli farmacologici coinvolti nella riparazione del DNA, può anche essere applicato alla convalida del bersaglio in altri sistemi come il controllo del ciclo cellulare. Dopo aver sezionato le cellule tumorali con oligonucleotidi antisenso, secondo il protocollo di testo in un ambiente sterile, utilizzare 400 microlitri di PBS per lavare accuratamente sei chip del biosensore Per sterilizzare i chip, rimuovere il PBS e aggiungere 400 microlitri di etanolo al 70% incubare per 20 minuti prima di utilizzare il PBS per lavare i chip tre volte. Inserire tre chip ciascuno in piastre di coltura sterili, etichettate come controllo e target di interesse, ed etichettare due provette da 50 millilitri in modo simile.

Successivamente, utilizzare il PBS per lavare le cellule trasfettate prima di aggiungere un volume appropriato di tripsina EDTA allo 0,25%, attendere che il monostrato si stacchi e trasferire la sospensione cellulare nell'apposito tubo. Dopo aver contato le cellule, regolare il volume per raggiungere una concentrazione finale di 6,0 volte 10 al quinto cellulare per millilitro aggiungendo terreno o concentrando le cellule. Preparando un gruppo alla volta, aggiungere 250 microlitri di soluzione cellulare a ciascun chip del biosensore.

Posizionare le piastre sterili contenenti le patatine all'interno di una camera di umidità per evitare l'evaporazione e incubare durante la notte per effettuare misurazioni del metabolismo seguendo lo schema sperimentale dettagliato nell'etichetta del protocollo di testo Provette da 1450 millilitri e aggiungere 50 millilitri di crescita, terreno più 0,2% FBS e una x penicillina e streptomicina. O PS. Posizionare sei provette in un sistema di misurazione del metabolismo, sei provette in un altro e la provetta rimanente in un terzo rack per provette che contiene anche provette con cisplatino. Utilizzare una membrana permeabile all'aria per sigillare i primi due rack per evitare l'evaporazione.

Successivamente, preparare un volume appropriato di sei micromolari di cisplatino in terreno con 0,2% di FBS e un XPS. Erogare il volume richiesto di terreno in quattro provette da 50 millilitri etichettate e riposizionarle nelle quattro fessure del terzo rack per provette per la misurazione del metabolismo. Utilizzare una membrana permeabile all'aria per sigillare i tubi.

Etichettare sei provette da 50 millilitri e aggiungere 20 millilitri a ciascuna soluzione di Triton X allo 0,1% Nel terreno, la soluzione di Triton X giacerà tutte le cellule rimanenti e fornirà un valore zero per ogni chip. Posizionare le provette in un quarto rack per provette e sigillarle. Quindi caricare i chip nei moduli bio.

Caricare i due brack nel supporto dei due brack, quindi iniziare l'esperimento. Dopo aver preparato gli embrioni di pollo come indicato nel protocollo di testo il secondo giorno di trasfezione cellulare, suddividere i gruppi di controllo e di interesse target in due fiasche per il veicolo e due per il cisplatino. Aspirare il terreno e utilizzare tre millilitri di cisplatino fresco, medio o medio con sei micromolari di cisplatino per reintegrare.

I matracci incubano per sei ore. Dopo l'incubazione, aspirare il terreno, quindi lavare e triplizzare le cellule, trasferire la sospensione cellulare in quattro provette da 15 millilitri opportunamente etichettate prima di centrifugare e utilizzare PBS per lavare tre volte Resus risospendere le cellule. E poi, dopo il conteggio, utilizzare il PBS per diluire o centrifugare per concentrare le cellule a una concentrazione finale di 1,0 volte 10 per la sesta cellula per millilitro.

Trasferire la sospensione cellulare in provette da cinque millilitri etichettate per l'iniezione e metterla su ghiaccio. Successivamente, mettere da parte 24 embrioni di pollo di 9 giorni per l'iniezione al microscopio stereoscopico e utilizzando un ago di vetro collegato a un tubo flessibile collegato a una siringa da un millilitro con un lento movimento pulsante. Iniettare 1,0 volte 10 al quinto cellulare in un volume di 100 microlitri nella circolazione venosa della membrana toica del carbone o cam con un panno morbido.

Tamponare delicatamente il sito di iniezione per arginare il flusso sanguigno e assorbire eventuali fuoriuscite di centrifuga. Etichettare ogni contenitore di embrioni in modo appropriato dopo ogni iniezione al microscopio a fluorescenza. Confermare la presenza e la distribuzione di cellule fluorescenti nel sistema vascolare della camma.

Prendi nota di tutti gli embrioni in cui il numero di cellule tumorali appare basso o la distribuzione è scarsa. Infine, posizionare gli embrioni di pollo in una camera di umidità e incubare per sette-nove giorni prima di enumerare i focolai metastatici come indicato nel protocollo di testo, come mostrato qui dopo 24 ore, cellule di cancro del polmone umano, 5 49 trattate con BRCA due mirate a un SO e cisplatino hanno mostrato una diminuzione precoce e irreversibile della respirazione rispetto alle cellule che hanno ricevuto il controllo a SO e cisplatino da solo. La diminuzione del 39% rispetto alle cellule trattate con il controllo è iniziata circa 10 ore prima di un calo rilevabile dell'adesione cellulare, suggerendo che si è verificato indipendentemente dai cambiamenti nel numero di cellule e che potrebbe essere un evento formativo che precede la morte cellulare, come dimostrato qui.

Durante l'esperimento di 72 ore non è stata osservata alcuna differenza nell'acidificazione, suggerendo che il trattamento con BRCA 2, SO e cisplatino ha avuto un effetto minimo o nullo sul metabolismo del glucosio. In questo esperimento, cellule di cancro del polmone umano A 5 49 sono state trattate con controllo a SO o BRCA due A SO in presenza o assenza di cisplatino e iniettate nella circolazione venosa della cam. Nove giorni dopo, le cellule trattate con BRCA 2 a SO e cisplatino hanno mostrato una frequenza inferiore del 77% di focolai metastatici rispetto alle cellule trattate con controllo a SO e cisplatino o BRCA due A SSO da soli, suggerendo che il trattamento con BRCA 2 a SO e cisplatino ha il potenziale per ridurre o prevenire il carico metastatico nei pazienti con tumori solidi.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi più tradizionali come la proliferazione cellulare, i saggi e gli studi sugli xenotrapianti in vivo al fine di esplorare ulteriormente il contributo di un particolare bersaglio a una maggiore sensibilità ai farmaci.