Name: La linfa mesenterica Duct Cannulated Rat Modello: Applicazione alla valutazione di intestinale linfatico Drug Transport (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Scopri la tecnica di cannulazione del dotto linfatico mesenterico nel ratto per valutare il trasporto di lipidi e farmaci nel sistema linfatico intestinale. Questo metodo consente la quantificazione diretta dell'assorbimento e del trasporto linfatico in vivo.

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Il finanziamento da parte dell'Australian Research Council (ARC) e del National Health and Medical Research Council (NHMRC) è un riconoscimento di gratitudine.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il modello di ratto mesenterica linfa incannulamento consente la quantificazione diretta della concentrazione e la velocità di trasporto di varie cellule e molecole (come lipidi e farmaci) da l&#39;intestino nella linfa e le modifiche a questi che si verificano in risposta a sfidare di varie sostanze (dieta , antigene, farmaci, formulazioni, ecc) 10,27 e la malattia (cancro, virus, colite, insulino-resistenza, etc.) 5-7. I componenti che sono raccolti nella linfa possono essere ul...

La linfa fluisce dal piccolo intestino attraverso un processo unidirezionale che origina a singoli lacteals che sono contenuti all&#39;interno di ogni piccola villi intestinali 1. Lacteals sono relativamente permeabile ai fluidi, macromolecole e cellule e la formazione della linfa quindi inizia con l&#39;ingresso di questi fattori in lacteals. La linfa iniziale nei lacteals scorre successivamente dall&#39;intestino tramite una rete di microvasi linfatici, raccolta (afferente) vasi linfatici, una serie di linfonodi mesenterici e, infine, i post-nodale (efferenti) vasi linfatici. Nei nodi, linfa passa attraverso una serie di seni midollari dove avviene lo scambio con le cellule immunitarie nodo residenti nonché materiale che entrano nodo dal sangue. Tutte linfa scorre dal piccolo intestino eventualmente converge nel dotto efferente linfa mesenterica superiore e successivamente il chyli cisterna. Il chyli cisterna raccoglie anche linfodrenante tessuti periferici caudali, intestinale, regioni epatiche e lombari e si unisce al dotto linfatico toracico con la linfa del mediastino e parti del cranio del corpo. Il dotto linfatico toracico svuota linfa direttamente nel sistema venoso a livello della giunzione delle vene giugulari e succlavia sinistra interna. Il protocollo qui descritto, che consente la raccolta di linfa direttamente dal condotto mesenterico linfatico superiore, facilita quindi l&#39;analisi di vari fattori che transitano direttamente dall&#39;intestino al (generale) circolazione sistemica attraverso il sistema linfatico intestinale. Le principali funzioni fisiologiche assegnate al sistema linfatico intestinale sono di mantenere l&#39;equilibrio dei fluidi, per facilitare l&#39;assorbimento dei lipidi e molecola lipofila, e per consentire opportune risposte immunitarie 1. Le cellule tumorali e virus si propagano anche attraverso i vasi linfatici intestinali 2-4 e principali cambiamenti si verificano all&#39;interno dei vasi linfatici in diverse patologie infiammatorie e metaboliche 5-7. Lattinanulation del condotto linfatico mesenterico per raccogliere linfa nel mesentere consente un&#39;analisi del flusso di fluido di massa attraverso i vasi linfatici intestinali e quantificazione del tasso di concentrazione e trasporto di varie cellule e molecole. Modifiche alla concentrazione o di transito di questi fattori in risposta alle varie sfide (ad esempio, diete, antigeni, farmaci) e in modelli di malattia (ad esempio, colite, HIV, diabete) possono anche essere valutate. Sebbene sia impossibile descrivere ampiamente ogni componente linfa che possono essere analizzati e confrontati qui, linfonodi mesenterici consiste semplicisticamente di acquosa, lipidi e fasi cellulari. I componenti di interesse nella fase acquosa includono peptidi e proteine, come antigeni o tolerogens 8, messaggeri del sistema immunitario come le citochine e mediatori dei mastociti 9, e mediatori metaboliche come incretine 10. La frazione cellulare del mesenterico linfatico post-nodale consiste quasi interamente (oltre il 99%) di lymphocytES 11. Varie cellule immunitarie (cellule dendritiche, mastociti, ecc) entrano nei vasi linfatici mesenterici pre-nodali, ma rimangono all&#39;interno del nodo 12. Se le cellule all&#39;interno afferente linfa sono di interesse, è possibile raccogliere queste cellule mediante la rimozione della linfa mesenterica nodi diversi giorni prima cannulazione del condotto linfatico mesenterico 12. In questo modo i condotti linfatici afferenti ed efferenti sono direttamente collegati e le cellule linfatici afferenti linfa passano direttamente nel condotto linfa mesenterica. Il transito e il fenotipo delle varie cellule immunitarie che passano attraverso i vasi linfatici intestinali possono quindi essere esaminati. Forse il motivo più comune citato per la raccolta della linfa mesenterica fino ad oggi, tuttavia, è quello di studiare la trasformazione intestinale, l&#39;assorbimento e il trasporto dei lipidi alimentari e molecole lipofile 10. Dopo ingestione, lipidi alimentari sono digeriti (ad esempio, da trigliceridi di acidi grassi e monogliceridi, phospholipid di acidi grassi e lysophospholipid e esteri del colesterolo ad acidi grassi e colesterolo, ecc) e dispersi nel lume intestinale in piccola micelle e strutture vescicolari tramite l&#39;aggiunta di anfifili di bile (fosfolipidi, sali biliari e colesterolo) e l&#39;azione di enzimi pancreatici 10,13. Da qui essi vengono assorbiti nel enterociti. Una parte dei componenti sono assorbiti riesterificati per formare trigliceridi, fosfolipidi e gli esteri del colesterolo nelle cellule assorbenti (enterociti). Questi lipidi riesterificati sono costituiti da una combinazione di esogenamente ingerito componenti lipidici e dei componenti lipidici endogeni dalla bile secreta, piscine lipidici mucosa intestinale o fornitura di sangue 13. Da qui i lipidi esterificati o sono memorizzate all&#39;interno di enterociti o assemblati in lipoproteine ​​intestinale (chilomicroni, lipoproteine ​​a bassissima densità (VLDL)) insieme a varie apoproteine ​​e altre molecole lipofile ( <em&gt; per esempio, vitamine) 10,13. Dopo l&#39;uscita enterociti, lipoproteine ​​sono specificamente trasportati dall&#39;intestino nella circolazione sistemica attraverso il sistema linfatico mesenterico le lacteals intestinali sono più permeabili al loro ingresso di capillari sanguigni intestinali. Una parte dei componenti lipidici assorbiti vengono anche trasportati dall&#39;intestino alla circolazione sistemica attraverso i capillari sanguigni e della vena porta, come singolo, non-lipoproteine ​​associati, molecole 14. In generale, tuttavia, la via di trasporto vena porta è solo un operatore significativo l&#39;assorbimento dei lipidi lunghezza della catena corta e media. La raccolta della linfa mesenterica consente quindi la valutazione del trasporto delle lipoproteine ​​e componenti associati (lipidi, molecole lipofile, apo-proteine) dall&#39;intestino. Le lipoproteine ​​possono essere quantizzati e caratterizzati con il vantaggio che lipoproteine ​​linfonodi mesenterici, in generale, sono in un nascenStato t poiché non sono stati ampiamente modificati da enzimi sistemici come lipoproteina lipasi 15. Mentre la linfa mesenterica modello di ratto cannulato è forse storicamente più ampiamente descritto per l&#39;analisi del trasporto di lipidi / lipoproteine ​​dall&#39;intestino, una zona di espansione interesse è il ruolo dei linfatici nel trasporto di farmaci lipofili, profarmaci e altri xenobiotici 13,16 che è al centro del modello qui descritto. Farmaci lipofili (generalmente quelli con log P&gt; 5 e solubilità in catena lunga trigliceridi&gt; 50 mg / g, anche se eccezioni sono evidenti) 17,18, profarmaci 19 e altri xenobiotici 13,16 può accedere ai vasi linfatici intestinali passivamente o da integrando attivamente in lipoproteine ​​intestinale vie di trasporto 19. Il ratto linfa mesenterica tecnica incannulamento ha quindi molte applicazioni. Bollman et al. Primo descrisse una technique per cannulare condotto linfa mesenterica nei ratti nel 1948 20. Da allora una serie di variazioni sul modello sono state descritte. Ad esempio, la raccolta si può verificare quando il ratto è anestetizzato con diversi anestetici 21,22, o in stato cosciente, mentre trattenuto 15 o liberamente in movimento 23,24. I ratti possono essere somministrati diverse soluzioni reidratanti e di altre sostanze come i lipidi e le formulazioni di farmaci a prezzi diversi nello stomaco, l&#39;intestino o parenterale (in genere 0-5 ml / h) 25. In alcuni studi dotto linfatico toracico piuttosto che condotto linfatico mesenterico è cannulati stimare trasporto dall&#39;intestino attraverso i vasi linfatici anche se questo può sovrastimare transito dal piccolo intestino, a seconda del fattore di interesse, come il dotto linfatico toracico riceve anche linfatico da altri regioni 22,26. Modelli incannulamento linfonodi sono stati descritti in numerose altre specie, tra cui topi 15,27, mini-pigs 12, pecore 28,29, maiali e cani 30 31. Tuttavia, il modello di ratto è il più ampiamente e costantemente citata. Protocolli dettagliati per l&#39;incannulamento della condotta della linfa mesenterica seguita dalla raccolta di linfa in conscia 25 o anestetizzato 22 ratti e topi 15,27 sono stati pubblicati in precedenza e il lettore interessato è rivolta a questi protocolli. Questo protocollo è il primo a dimostrare la tecnica in un formato visualizzato. La linfa cannulata modello murino ha dei vantaggi rispetto ai modelli animali di maggiori dimensioni in termini di costi, la facilità di chirurgia e le considerazioni etiche. Rispetto al modello di topo, mesenterica chirurgia incannulazione linfatico è anche più facile nel ratto, anche se il modello del mouse consente studi più approfonditi sugli animali transgenici 27. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni del modello di ratto, in particolare quelle legate a differenze nella fisiologia, tale limite extrapolatione ad altre situazioni pre-clinici e clinici. Ad esempio, nel flusso di ratto biliare è costante ed indipendente dall&#39;assunzione di cibo che negli alimenti specie superiore o lipidi stimolano flusso biliare 32. Questo crea problemi per ottenere rappresentanza ambienti pre e post-prandiale nel ratto che riflettono ciò che si vede in specie più grandi e gli esseri umani. Per gli studi di somministrazione di farmaci, specie più grandi possono anche essere preferito al momento della valutazione del trasporto linfatico dopo la somministrazione di dosi realistico umano forma 25. In un recente studio, prezzi di trasporto dei lipidi nella linfa mesenterica sono risultati comparabili tra le specie (topo, ratto, cane) dopo la somministrazione di una massa equivalente e il tipo di lipidi che fornisce una certa fiducia in estrapolando i dati di trasporto dei lipidi tra le specie 27. Tuttavia, il trasporto di un modello lipofilo droga, alofantrina, ordinati in ordine di grandezza animale (cioè, cane&gt; rat&gt; mouse). Un fattore di scala può quindi essere richiesto di extrapolate dati sul trasporto di droga linfatici da topo ad altre specie. Una limitazione di modelli linfatico cannulazione, in generale, è che la raccolta della linfa passiva direttamente da un condotto linfatico può modificare il flusso linfatico e trasporto dal vasi linfatici funzionano contro un gradiente di pressione che viene alterata quando il vaso è cannulata 33. Il modello linfa incannulamento può anche essere difficile stabilire in laboratori che non hanno familiarità con la tecnica. Sono stati così descritto modelli alternativi. Per esempio, il transito di fattori attraverso il sistema linfatico intestinale, come lipoproteine ​​e molecole lipofile, è stata studiata indirettamente tramite la raccolta di sangue. Un tale modello prevede confrontando concentrazioni ematiche di lipidi e / o farmaci dopo somministrazione orale in presenza e in assenza di inibitori (ad esempio, colchicina, Pluronic L81, cicloeximide) della produzione lipoproteine ​​intestinali che bloccano il trasporto 34 linfatica. Un vantaggiodi modelli che quantificano il trasporto linfatico indirettamente tramite la raccolta di campioni di sangue è che permette una valutazione del trasporto linfatico negli esseri umani come la chirurgia invasiva, non è richiesto 35. Tuttavia, gli inibitori del trasporto linfatico non sono specifici e fattori che sono trasportate attraverso i vasi linfatici sono diluiti e modificati nella circolazione sistemica che complica tali valutazioni. In vitro alternative sono stati descritti. Ad esempio, le culture Caco-2 cellulari o isolato enterociti sono stati utilizzati per studiare in modo più approfondito la secrezione intestinale di molecole che entrano i vasi linfatici 36-38. Un modello avanzato in vitro che è più rappresentativo del microambiente intestinale umano è stato anche recentemente descritto 39. In questo modello di uno strato di cellule endoteliali linfatico è co-coltura con cellule Caco-2 che consente un&#39;analisi più dettagliata del trasferimento di sostanze dall&#39;intestino nei vasi linfatici. Tuttavia, in vitro sistemi cellulari mancanza di flusso di scambio e di trasferimento, ossia l&#39;interconnessione con un lume intestinale e sangue alla base e la fornitura vascolare linfatico. In un approccio alternativo, Kassis et al. Stabilito un doppio canale (campo chiaro ad alta velocità di video e fluorescenza) in situ sistema di imaging che permette di confronto quantitativo fra contrazione nave, il flusso linfatico e le concentrazioni di lipidi fluorescenti mesenterici vasi linfatici 33. Un vantaggio di questo modello sopra citato in sistemi in vitro è che consente un monitoraggio accurato del passaggio di cellule immunitarie attraverso i vasi linfatici. Misurazioni assolute di lipidi massa (o droga) trasporto sono, tuttavia, non sono ancora stabiliti con metodi di imaging. In vitro e in silico approcci per prevedere in particolare la misura del trasporto di droga lipofila attraverso i vasi linfatici intestinali sono stati anche pubblicati 40-42. Ad esempio, l&#39;ex vivo affinità di vari compounds per chilomicroni plasma è risultato correlare ragionevolmente bene con il loro trasporto linfatico in vivo 41. Successivamente, lo stesso gruppo ha stabilito un modello in silico per prevedere affinità farmaco per chilomicroni basate su più di 40 proprietà fisico-chimiche. Holm et al. Anche stabilito un modello relativamente complessa in silico per prevedere definitiva trasporto linfatico di composti lipofilici sulla base di descrittori molecolari 42. Questi modelli possono fornire un approccio utile prevedere l&#39;ampiezza del trasporto linfatico droghe sconosciute. Validazione dei modelli con una vasta gamma di farmaci e tra i vari laboratori, tuttavia, è necessario per confermare la loro accuratezza e riproducibilità. Incannulazione del condotto mesenterico linfatico rimane pertanto l&#39;unico mezzo per esaminare direttamente il contenuto della linfodrenante tenue e il tasso di transito della complessa serie di fattori (cellule, proteine,peptidi, lipidi, farmaci) in linfa in una situazione in vivo. Qui si descrive un protocollo per incannulazione del dotto linfatico e carotide arteria mesenterica che consente la raccolta di linfa mesenterica e arteriosa sistemica da ratti anestetizzati. Dati rappresentativi dimostrano come il modello può essere utilizzato per esaminare lipidico e trasporto del farmaco dall&#39;intestino attraverso il sistema linfatico mesenterico. Questa è seguita da una discussione di difficoltà che si possono incontrare nella definizione del modello e una guida alla risoluzione. Una volta stabilito il modello è un potente strumento per studiare il trasporto linfatico intestinale.

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina sterile</td><td>Baxter healthcare</td><td>AHB 1307</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è Baxter 100 ml sacche di soluzione salina, scatola da 50</td></tr><tr><td>70 % di etanolo in acqua</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>marca può essere utilizzata</td></tr><tr><td>Soluzione di clorexidina gluconato (Microshield 4)</td><td>Livingstone International</td><td>JJ60243L</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =JJ60243L</td></tr><tr><td>Soluzione di betadina</td><td>Livingstone International</td><td>BU0510</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =BU0510</td></tr><tr><td>Ilium Ketamil (Ketamina 100 mg/ml)</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>KETA I 1</td><td>http://www.provet.com.au/</td></tr> <tr><td>Ilio xilazil(xilazina 100 mg/ml)</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>TRO-3828</td><td>http://www.provet.com.au/</td></tr> <tr><td>ACP 10 Iniezione (Acepromazina 10 mg/ml)</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>VTG-DACP010020</td><td>http://www.provet.com.au/</td></tr> <tr><td>Pentobarbitone di sodio</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>24529</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è Lethabarb&reg; 325 mg/ml di pentobarbitone di sodio, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au</td></tr><tr><td>Eparina (35000U. in 35 mL)</td><td>Sigma Pharmaceuticals</td><td>337220</td><td>http://sigmaco.com.au/</td></tr> <tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) sale disodico diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td>Qualsiasi marca può essere utilizzata. Un esempio qui è il sale disodico di EDTA di Sigma.</td></tr><tr><td>Cannula in polietilene (PE) d.o. 0,96 mm x d.i. 0,58 mm</td><td>Prolunghe per microprovette</td><td>PE8050</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. L'esempio è un tubo in PE 0,96 x0,58 mm, 30 m</td></tr><tr><td>Cannula in polietilene (PE) con diametro esterno 0,8 mm x diametro interno 0,5 mm</td><td>Prolunghe per microtubi</td><td>PE9658</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. L'esempio è un tubo in PE 0,8 x0,5 mm, 30 m</td></tr><tr><td>Righello</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>marca può essere utilizzata</td></tr><tr><td>Marcatori</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>marca può essere utilizzata</td></tr><tr><td>Accendisigari</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>marca Qualsiasi marca può essere utilizzata</td></tr><tr><td>Adesivo veterinario</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>Qualsiasi marca può essere utilizzata</td></tr><tr><td>Aghi calibro 23</td><td>Livingstone International</td><td>DN23GX0.75LV</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. L'esempio è l'ago monouso Livingstone, sterile, 23GX0,75 pollici, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT= 6& search=DN23GX0.75LV</td></tr><tr><td>Ferri calibro 25</td><td>Livingstone International</td><td>DN25GX1.0LV</td><td>Può essere utilizzato qualsiasi marca. Esempio qui è l'ago usa e getta Livingstone, sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search= DN25GX1.0LV</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>Livingstone International</td><td>T3SS01TA</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è la siringa Terumo 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA</td></tr><tr><td>siringa da 10 ml</td><td>Livingstone International</td><td>T3SS10SA</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è la siringa Terumo 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA</td></tr><tr><td>Tamponi di garza</td><td>Livingstone International</td><td>GSC075</td><td>Qualsiasi marca può essere utilizzata e tagliata alla dimensione richiesta. Esempio qui è la garza tampone di cotone riempito 7,5x7,5 cm, 8 strati. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075</td></tr><tr><td>Cotton fioc</td><td>Livingstone International</td><td>CTAST075DP</td><td>Qualsiasi marca può essere utilizzata. Esempio qui è l'applicatore in cotone Livingstone in plastica a doppia punta. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =CTAST075DP</td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Ratek</td><td>WT1</td><td>Può essere utilizzato qualsiasi marca che mantenga la temperatura a 37°C. Un esempio qui è il vassoio scaldavivande Ratek.</td></tr><tr><td>Lampada chirurgica</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-0215 con 72-0267</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è l'apparecchio Harvard V-Lux 1000 Sorgente di luce fredda con guida di luce a collo d'oca biforcato, nero, diametro della fibra di 4,7 mm (ciascun braccio). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ -1_HAI_ProductDetail e&nbsp; http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ -1_HAI_ProductDetail___</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>operatorio Zeiss</td><td>495005-0014-000</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. Ne è un esempio lo Stereomicroscopio Zeiss Stemi 2000-C con Stand S Double Spot e KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143</td></tr><tr><td>Sutura di seta</td><td>Livingstone International</td><td>DTSK163019F4</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. L'esempio qui è &nbsp; Sutura in seta a taglio inverso a 3/8 cerchi 3/0 filo 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4</td></tr><tr><td>Lame per bisturi</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10020-00</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. L'esempio qui è la lama per bisturi FST #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191</td></tr><tr><td>Manico per bisturi</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10004-13</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51</td></tr><tr><td>1 x Forbici chirurgiche piccole</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14060-09</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui sono le forbici fini FST, 9 cm con tagliente da 21 mm, affilate, dritte. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17</td></tr><tr><td>2 pinze con punta curva seghettata</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11001-13</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è una pinza FST da 13 cm con punta curva da 2,8x1,4 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32</td></tr><tr><td>1 x Forbici per iridectomia</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>15000-08</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui sono le forbici a molla FST Vannas - tagliente da 2,5 mm, dritte. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16&nbsp;</td></tr><tr><td>1 x Pinze con punta diritta serata</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11650-10</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. L'esempio è FST Graefe 10 cm dritto con punta seghettata 1 x 0,99 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32</td></tr><tr><td>1 x Pinze con punta fine liscia, affilata, diritta</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11251-10</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. L'esempio qui è la pinza FST Dumont #5 dritta da 11 cm con punta da 0,08 x 0,04 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29</td></tr><tr><td>1 x Pinze con pinze curve lisce e fini</td><td>Strumenti per la scienza fine (FST)</td><td>11063-07</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è la pinza delicata FST da 9 cm con punta liscia da 0,4 x 0,3 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360</td></tr><tr><td>2 x Emostatici Strumenti per la</td><td>scienza fine (FST)</td><td>13010-12</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. Non tutti gli operatori utilizzano gli emostatici. L'esempio sono gli emostatici per microzanzare FST da 12 cm con 20 mm di lunghezza x 1,3 mm di larghezza, punta dritta seghettata. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33</td></tr><tr><td>1 x Porta aghi da sutura</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12001-13</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è il porta-aghi Hasley FST da 13 cm con punta da 16 mm di lunghezza x 1,9 mm di larghezza. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70</td></tr><tr><td>1 x Morsetto per arteria</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>18050-28</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è FST Bulldog Serrefines dritto, 28 mm di lunghezza, dimensioni della ganascia 9x1,6 mm con pressa a pinza media. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82</td></tr><tr><td>Acido oleico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1008</td><td>Quando richiesto, può essere utilizzata qualsiasi marca. L'esempio qui è l'acido oleico puro al 99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>acido 14C-oleico</td><td>Perkin</td><td>NEC317050UC&nbsp;</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi marca. L'esempio qui è l'acido oleico, [1-14C]-, 50&micro; Ci (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC</td></tr><tr><td>Taurocolato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4009</td><td>Qualsiasi marca può essere utilizzata. L'esempio qui è l'acido taurocolico sale di sodio idrato &ge; 95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>Halofantrine</td><td>Glaxo Smith Kline L'alofantrina</td><td></td><td>è stata gentilmente fornita come regalo da Glaxo Smith Kline</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71507</td><td>Qualsiasi marca può essere utilizzata. Un esempio è il fosfato di sodio monobasico monoidrato, BioXtra, per la biologia molecolare, >99,5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71643</td><td>Qualsiasi marca può essere utilizzata. Un esempio qui è il fosfato di sodio bibasico diidrato, BioUltra, per la biologia molecolare, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU</td></tr></tbody></table>

la linfa mesenterica duct cannulated rat modello: applicazione alla valutazione di intestinale linfatico drug transport

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Il sistema linfatico intestinale gioca un ruolo chiave nel trasporto di liquidi, l&#39;assorbimento dei lipidi e la funzione immunitaria. La linfa scorre direttamente dal piccolo intestino attraverso una serie di vasi linfatici e nodi che convergono al dotto linfatico mesenterica superiore. Incannulazione del condotto mesenterico linfatico consente quindi la raccolta della linfa mesenterica scorre dall&#39;intestino. Mesenterici costituito da una frazione cellulare di cellule immunitarie (99% linfociti), frazione acquosa (liquido, peptidi e proteine ​​quali citochine e ormoni intestinali) e frazione lipoproteina (lipidi, molecole lipofile e apo-proteine). Il condotto linfatico modello cannulazione mesenterica può quindi essere utilizzato per misurare la concentrazione ed il tasso di trasporto di una serie di fattori dall&#39;intestino attraverso il sistema linfatico. Modifiche a questi fattori in risposta alle sfide differenti (ad esempio, le diete, gli antigeni, droga) e nella malattia (ad esempio, malattia infiammatoria intestinale, HIV, diabete) può anche be determinato. Un&#39;area di espansione interesse è il ruolo del trasporto linfatico nell&#39;assorbimento dei farmaci lipofili somministrati per via orale e profarmaci che associano con intestinali vie di assorbimento dei lipidi. Qui si descrive, in dettaglio, un modello di topo cannulata dotto linfatico mesenterica che consente di valutare la velocità e il grado di lipidi e di trasporto della droga attraverso il sistema linfatico per diverse ore dopo la consegna intestinale. Il metodo è facilmente adattabile alla misurazione di altri parametri in linfa. Forniamo una descrizione dettagliata delle difficoltà che si possono incontrare quando si stabilisce questo metodo chirurgico complesso, così come i dati rappresentativi di esperimenti falliti e di successo per fornire istruzioni su come per confermare il successo sperimentale e interpretare i dati ottenuti.

I risultati di un esperimento rappresentativo per quantificare la portata cumulativa e tasso di lipidi e di trasporto del farmaco attraverso il sistema linfatico seguente erogazione intestinale utilizzando il modello linfa cannulazione mesenterica sono mostrati in Figura 4 e Figura 5. In questo esperimento, 200 ug del modello lipofilo alofantrina farmaco è stato somministrato nel duodeno di ratti oltre 2 ore in una formulazione contenente 40 mg di acido oleico (compresi 2-5 uCi 14<...

Qui descriviamo una tecnica per incannulare il dotto linfatico mesenterico nei ratti che consente la quantificazione del trasporto di lipidi e farmaci attraverso il sistema linfatico dopo il parto intestinale. La tecnica può essere adattata per valutare le concentrazioni di linfa mesenterica e/o il trasporto di fluidi, cellule immunitarie, peptidi, proteine e molecole lipofile.

La linfa mesenterica Duct Cannulated Rat Modello: Applicazione alla valutazione di intestinale linfatico Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la velocità e l'entità del trasporto di lipidi e farmaci nel sistema linfatico intestinale dopo la somministrazione intestinale. Ciò viene ottenuto isolando ed effettuando la cannulazione del dotto linfatico mesenterico per la raccolta della linfa. Nel secondo passaggio, si effettua la cannulazione del duodeno per permettere l'infusione nell'intestino, quindi si procede con la cannulazione dell'arteria carotide per consentire il prelievo di campioni ematici.Nell'ultimo passaggio, il trattamento sperimentale viene somministrato nel duodeno e il linfa e il sangue vengono raccolti per la quantificazione dei livelli sistemici di lipidi o farmaci. In definitiva, questo modello può essere utilizzato per valutare l'assorbimento totale e il trasporto linfatico intestinale di lipidi e farmaci dopo la somministrazione intestinale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la cannulazione diretta del dotto linfatico mesenterico e la raccolta del linfa per l'intero periodo sperimentale.Questo consente una stima della massa assoluta di materiale che fluisce all'interno e attraverso la linfa mesenterica. In vivo, sebbene questo modello permetta la valutazione in vivo del trasporto di farmaci e lipidi, può essere utilizzato anche per misurare il trasporto linfatico intestinale di qualsiasi fattore di interesse, nonché le variazioni nel trasporto linfatico di tali fattori in risposta a diverse sfide o stati patologici.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la cannulazione del dotto linfatico mesenterico è complessa e difficoltosa a causa delle ridotte dimensioni e della fragilità del dotto, specialmente negli animali a digiuno. A illustrare la procedura sarà la mia collega e membro del corpo docente qui alla Monash University, la dottoressa Natalie Cus, e un postdoc senior del gruppo, il dottor LJ Hugh. Il giorno precedente l'intervento chirurgico, tagliare le cannule alle lunghezze appropriate e utilizzare una lama chirurgica sterile per creare un bisello all'estremità di ciascun pezzo di tubo. Successivamente, per preparare la cannula intra-duodenale, ripiegare la cannula su se stessa e quindi riscaldarla per formare un punto di ancoraggio nel tubo.Nel giorno dell'intervento, rasare il pelo dalla regione addominale e cervicale laterale destra e dalla regione della clavicola sinistra di un ratto adulto anestetizzato, quindi pulire asepticamente le aree chirurgiche con tre passaggi alternati di soluzione di povidone-iodio e alcol al 70% per cannuccare il dotto linfatico. Posizionare l'animale con il lato destro rivolto verso l'alto e utilizzare una lama di bisturi sterile per aprire lo strato superficiale della parete muscolare addominale mediante un'incisione dritta di quattro centimetri, estesa dal processo xifoidale al fianco destro, approssimativamente due centimetri al di sotto del margine costale. Ritrarre l'intestino tenue sotto la parete addominale sinistra e utilizzare due o tre pezzi di garza sterile imbevuti di soluzione salina fisiologica per mantenerlo in posizione.Quindi posizionare il ratto sopra una siringa di plastica da 10 millilitri disposta orizzontalmente sotto la schiena dell'animale a livello del rene destro. Per facilitare la visualizzazione del dotto linfatico mesenterico, individuare il dotto linfatico mesenterico superiore, che ha un diametro di circa 0,5-1 millimetro, è perpendicolare al rene destro e si trova immediatamente in posizione rostrale e parallelo all'arteria mesenterica pulsante di colore rosso scuro. Si noti che nei ratti non digiuni, come mostrato in questo caso, il dotto linfatico mesenterico superiore è bianco, opaco e più facile da visualizzare rispetto ai ratti infestati.Successivamente, far passare una coppia di pinze dritte attraverso il letto adiposo perineale al margine inferiore del rene destro, in parallelo al dotto linfatico mesenterico superiore e attraverso gli strati di tessuto connettivo immediatamente al di sotto della vena cava. Quindi, utilizzando la punta delle pinze, far passare la cannula linfatica attraverso il letto adiposo perineale, con un'estremità immediatamente adiacente al dotto linfatico mesenterico e l'altra esteriorizzata dall'animale al livello del rene destro. Successivamente, utilizzando un microscopio chirurgico e pinze da orafo, isolare il dotto linfatico mesenterico attraverso gli strati sovrapposti di tessuto connettivo e adiposo mediante dissezione atraumatica, partendo dall'estremità inferiore e avendo cura di non danneggiare il dotto linfatico una volta isolato.Utilizzare la punta delle pinzette a punta fine per praticare un piccolo foro nel dotto linfatico. Dopo aver verificato che la cannula linfatica sia completamente riempita con soluzione anticoagulante e priva di bolle d'aria, utilizzare un piccolo paio di pinzette per inserire la cannula linfatica all'interno del dotto linfatico mesenterico, attraverso la puntura, per una profondità di circa due-quattro millimetri. Se la cannulazione ha successo, si osserverà un flusso graduale di linfa intestinale dall'estremità libera di raccolta della cannula.Quando ciò si verifica, applicare una piccola goccia di colla di cianoacrilato sull'apertura di ingresso del dotto linfatico per fissare la cannula, avendo cura di non ostruire il vaso con un eccesso di colla durante la cannullazione del duodeno. Innanzitutto, identificare il tessuto come la sezione di colore rosa brillante dell'intestino tenue; tirando delicatamente verso il basso, si rivela lo stomaco. Successivamente, utilizzare un ago sterile da 23 gauge per praticare un piccolo foro di puntura nel duodeno a livello del piloro, approssimativamente due centimetri al di sotto della giunzione tra stomaco e duodeno.Successivamente, inserire l'estremità a uncino di forma js della cannula duodenale attraverso la puntura e fissare la cannula in posizione con una goccia di colla acrilica Sano. Quindi utilizzare punti di sutura per chiudere l'incisione della parete muscolare addominale. La cannullazione dell'arteria carotidea può essere eseguita prima o dopo la cannullazione del dotto linfatico mesenterico. Di solito preferiamo cannullare l'arteria carotidea prima della cannullazione del dotto linfatico, al fine di ridurre il rischio di spostare accidentalmente la cannula linfatica durante lo spostamento dell'animale. Per cannullare l'arteria carotidea, innanzitutto segnare la cannula per l'arteria carotidea a 2,5 centimetri dalla punta smussata, in modo da identificare la porzione del tubo da inserire nell'arteria.Quindi collegare l'estremità non smussata della cannula a un ago da 25 gauge fissato a una siringa riempita con soluzione anticoagulante e riempire la cannula con la soluzione, assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria. Successivamente, praticare un'incisione longitudinale lunga da uno a 1,5 centimetri attraverso lo strato cutaneo a sinistra della trachea nel piano sagittale, quindi utilizzare pinze a punta ottusa per dissezionare il tessuto connettivo sottocutaneo ed esporre i muscoli cervicali accoppiati sottostanti. Allontanare i muscoli del collo per evidenziare l'arteria carotidea sinistra pulsante, situata approssimativamente a un centimetro sotto la superficie della pelle.Quindi, rimuovere il tessuto connettivo sovrastante l'arteria mediante dissezione ottusa e utilizzare pinze da tessuto ottuse per isolare un tratto dell'arteria lungo circa un centimetro. Successivamente, utilizzare pinze a punta fine per passare due suture in seta al di sotto dell'arteria carotidea, posizionandole a ciascuna estremità del tratto arterioso isolato. Poi, legare la sutura più lontana dal cuore e dalla clavicola del ratto e posizionare una coppia di pinze a punta fine e dritte sotto la carotidea per occludere il flusso sanguigno attraverso l'arteria.Ora, utilizzando forbici da iridectomia a punta fine, effettuare una piccola incisione sulla superficie superiore dell'arteria a circa un terzo della distanza dalla sommità della zona isolata. Inserire la punta della cannula nell'arteria con una pinza curva. Una volta inserita, rimuovere la pinza dritta a punta fine, occludendo il flusso sanguigno, e avanzare la cannula di 2,5 centimetri all'interno dell'arteria utilizzando due paia di pinze.Uno per tenere la cannula all'interno dell'arteria e impedire che il sangue fuoriesca, e l'altro per inserire la cannula. Successivamente, utilizzare una piccola pinza per arteria per fissare la cannula all'interno dell'arteria. Iniettare una soluzione anticoagulante nella cannula, quindi aspirare una piccola quantità di sangue per verificare la pervietà del tubo.Quindi, sciacquare la cannula con soluzione anticoagulante e sigillare l'estremità utilizzando la fiamma di un accendino. Infine, utilizzare i punti di sutura per fissare la cannula in posizione e rimuovere il morsetto dell'arteria. Successivamente, posizionare un terzo punto di sutura intorno all'arteria e alla cannula, accorciare i fili di sutura intorno all'arteria e chiudere la ferita del collo con ulteriori punti di sutura. Al termine del periodo di recupero, infondere una formulazione di interesse nell'animale attraverso la cannula duodenale.Come illustrato nel grafico dopo l'amministrazione del modello, il farmaco lipofilico halal fanene, la portata media del flusso linfatico nei ratti correttamente cannullati è stata compresa tra 0,4 e 1,3 millilitri all'ora. In alcuni animali, la portata del flusso linfatico è stata leggermente inferiore durante le prime una-tre ore successive alla cannullazione, prima di aumentare, un fenomeno comunemente osservato dopo una cannullazione linfatica riuscita nei ratti non correttamente cannullati. Tuttavia, la portata rimane sostanzialmente più bassa rispetto a quella osservata negli esperimenti riusciti per tutto il periodo di raccolta.In modo analogo, in questi esperimenti rappresentativi, il trasporto linfatico cumulativo di trigliceridi e RIN halal è stato notevolmente inferiore negli animali con cannulazione non riuscita. Al contrario, nei gruppi con cannulazione riuscita, il trasporto cumulativo medio di halalan è stato del 15,1% della dose e il trasporto cumulativo di trigliceridi è stato di 61 milligrammi nell'arco di 10 ore. In questo esperimento rappresentativo sul trasporto lipidico, la proporzione della dose esogena di lipidi marcata radioattivamente somministrata e trasportata nella linfa è stata del 54%. Questi valori non differivano significativamente da quelli osservati in precedenza.Per una formulazione analoga, la velocità di trasporto sia dei trigliceridi che dei farmaci nella linfa raggiunge un picco pochi minuti dopo la somministrazione di lipidi e farmaco, per poi tornare ai livelli di base. Come è tipico negli esperimenti sul trasporto intestinale linfatico di lipidi e farmaci. La velocità di trasporto del farmaco nella linfa durante ciascun intervallo di tempo rispecchia quanto osservato per il trasporto dei trigliceridi, poiché il farmaco viene trasportato nella linfa.In associazione con le lipoproteine ricche di trigliceridi. Una volta acquisita padronanza, la cannulazione può essere completata entro 30 minuti, qualora non si verifichino difficoltà. Dopo questa procedura, i componenti presenti nel linfa raccolta possono essere isolati e utilizzati per ulteriori esperimenti, ad esempio per la reinfusione in animali riceventi al fine di valutarne direttamente la funzione, il metabolismo, l'eliminazione o i modelli di distribuzione. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione delle tecniche per isolare e cannulare il dotto linfatico mesenterico, l'arteria carotidea e il duodeno.Utilizzando queste tecniche, dovreste essere in grado di valutare il trasporto di farmaci, lipidi e altri fattori dall'intestino attraverso e verso la linfa mesenterica in vivo.

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