La linfa mesenterica Duct Cannulated Rat Modello: Applicazione alla valutazione di intestinale linfatico Drug Transport

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la velocità e l'entità del trasporto di lipidi e farmaci nel sistema linfatico intestinale dopo il parto intestinale. Ciò si ottiene isolando e incannulando prima il dotto linfatico mesenterico per la raccolta della linfa. Nella seconda fase, il duodeno viene cannulato per consentire l'infusione nell'intestino, quindi l'arteria carotide viene cannulata per consentire la raccolta di campioni di sangue.

Nella fase finale, il trattamento sperimentale viene somministrato nel duodeno e la linfa e il sangue vengono raccolti per la quantificazione dei livelli sistemici di lipidi o farmaci. In definitiva, questo modello può essere utilizzato per valutare l'assorbimento totale e il trasporto linfatico intestinale di lipidi e farmaci in seguito al parto intestinale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'incannulamento diretto del dotto linfatico mesenterico e la raccolta della linfa durante l'intero periodo sperimentale.

Ciò consente una stima del materiale massiccio assoluto che fluisce dentro e attraverso la linfa mesenterica. In vivo, sebbene questo modello consenta la valutazione in vivo del trasporto di farmaci e lipidi. Può anche essere utilizzato per misurare il trasporto linfatico intestinale di qualsiasi fattore di interesse, nonché il cambiamento nel trasporto linfatico di tali fattori in risposta a diverse sfide o stati patologici.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'incannulamento del dotto linfatico mesenterico è complicato e difficile dal fatto che il dotto è piccolo, fragile e negli animali a digiuno. Trasparente A dimostrare la procedura saranno la mia collega e collega di facoltà qui alla Monash University, la dottoressa Natalie cus, e un postdoc senior del gruppo, il dottor LJ Hugh, Il giorno prima dell'intervento, tagliare le cannule alla lunghezza appropriata e utilizzare una lama chirurgica sterile per fare uno smusso sulla punta di ogni pezzo di tubo. Successivamente, per preparare la cannula intraduodenale, avvolgere la cannula su se stessa e quindi riscaldare la cannula per creare un punto di ancoraggio nel tubo.

Il giorno dell'intervento, radere il pelo dal lato destro dell'addome e del collo e dalle regioni della clavicola sinistra di un ratto adulto anestetizzato, quindi pulire le regioni chirurgiche in modo asettico con tre successive soluzioni di iodio povidone e scrub all'etanolo al 70% per incannulare il dotto linfatico. Posizionare l'animale con il lato destro rivolto verso l'alto e utilizzare una lama di bisturi sterile per aprire lo strato superiore della parete muscolare addominale con un'incisione diritta di quattro centimetri che si estende dal processo xifoideo al fianco destro a circa due centimetri sotto il margine costale. Ritrarre l'intestino tenue sotto la parete addominale sinistra e utilizzare due o tre pezzi di garza sterile imbevuta di soluzione fisiologica normale per mantenerla in posizione.

Quindi collegare il ratto su una siringa di plastica da 10 millilitri posizionata orizzontalmente sotto la schiena dell'animale a livello del rene destro. Per facilitare la visualizzazione del dotto linfatico mesenterico, individuare il dotto linfatico mesenterico superiore, che ha un diametro compreso tra 0,5 e un millimetro circa, perpendicolare al rene destro e immediatamente rostrale e parallelo all'arteria mesenterica pulsante rosso scuro. Si noti che nei ratti non a digiuno, come mostrato qui, il dotto linfatico mesenterico superiore è bianco, opaco e più facile da visualizzare rispetto ai ratti infestati.

Successivamente, passare un paio di pinze diritte attraverso il letto adiposo perineale al margine inferiore del rene destro parallelamente al dotto linfatico mesenterico superiore e attraverso gli strati di tessuto connettivo immediatamente sotto la vena cava. Quindi, usando la punta della pinza, tirare la cannula linfatica attraverso il letto adiposo perrenico con un'estremità immediatamente adiacente al dotto linfatico mesenterico e l'altra esternalizzata dall'animale a livello del rene destro. Quindi, utilizzando un microscopio operatorio e una pinza da gioielliere, isolare il dotto linfatico mesenterico attraverso gli strati sovrastanti di tessuto connettivo e adiposo mediante dissezione smussata a partire dall'estremità inferiore e facendo attenzione a non danneggiare il dotto linfatico quando il dotto è stato isolato.

Usa la punta della pinza a punta sottile per praticare un piccolo foro nel dotto linfatico. Dopo essersi assicurati che la cannula linfatica sia completamente riempita con una soluzione anticoagulante e senza spazi d'aria, utilizzare un piccolo paio di pinze per inserire la cannula linfatica di circa due o quattro millimetri all'interno del dotto linfatico mesenterico tramite la puntura. Se l'incannulamento ha successo, si osserverà un flusso graduale di linfa intestinale dall'estremità di raccolta libera della cannula.

Quando ciò si verifica, posizionare una piccola goccia di colla cianoacrilica sul foro di ingresso nel dotto linfatico per fissare la cannula, facendo attenzione a non occludere il vaso con la colla in eccesso per incannulare il duodeno. In primo luogo, individuare il tessuto come la sezione rosa brillante dell'intestino tenue con una leggera trazione verso il basso, rivela lo stomaco. Quindi utilizzare un ago sterile calibro 23 per praticare un piccolo foro di puntura nel duodeno in corrispondenza del pilore, circa due centimetri sotto la giunzione dello stomaco e del duodeno.

Quindi, inserire l'estremità del gancio a forma di js della cannula duodenale attraverso la puntura e fissare la cannula in posizione con una goccia di colla acrilica Sano. Quindi utilizzare punti di sutura per chiudere l'incisione della parete muscolare addominale E l'incannulamento dell'arteria carotide può essere eseguito prima o dopo l'incannulamento del dotto linfatico mesenterico. In genere preferiamo incannulare l'arteria carotide prima dell'incannulamento del dotto linfatico, in modo da ridurre il potenziale di spostamento della cannula linfatica quando si muove l'animale Per incannulare l'arteria carotide, in primo luogo, segnare la cannula dell'arteria carotide a 2,5 centimetri dalla punta smussata per identificare la porzione del tubo da inserire nell'arteria.

Quindi collegare l'estremità non smussata della cannula a un ago calibro 25 collegato a una siringa riempita con soluzione anticoagulante e riempire la cannula con la soluzione, assicurandosi che non siano presenti vuoti d'aria. Successivamente, praticare un'incisione longitudinale da uno a 1,5 centimetri attraverso lo strato cutaneo sopra la sinistra della trachea sul piano sagittale, quindi utilizzare una pinza a punta smussata per sezionare il tessuto connettivo sottocutaneo ed esporre i muscoli del collo accoppiati sottostanti. Ritrarre i muscoli del collo per rivelare l'arteria carotide sinistra pulsante situata a circa un centimetro sotto la superficie della pelle.

Quindi pulire il tessuto connettivo sovrastante dall'arteria mediante dissezione smussata e utilizzare una pinza per tessuto smussato per isolare una sezione di circa un centimetro dell'arteria. Quindi, utilizzare una pinza a punta sottile per infilare due suture di seta sotto l'arteria carotide, posizionandole a ciascuna estremità della sezione dell'arteria isolata. Quindi legare la sutura più lontana dal cuore e dalla clavicola del ratto e posizionare un paio di pinze a punta sottile diritte sotto la carotide per occludere il flusso sanguigno attraverso l'arteria.

Ora, usando le forbici dell'iride a punta fine, fai una piccola incisione sulla superficie superiore dell'arteria a circa un terzo della discesa dalla parte superiore dell'area isolata. Inserire la punta della cannula nell'arteria con una pinza a punta curva. Una volta inserita, rimuovere la pinza a punta fine diritta, occludendo il flusso sanguigno e far avanzare la cannula di 2,5 centimetri nell'arteria utilizzando due paia di pinze.

Uno per tenere la cannula all'interno dell'arteria per impedire al sangue di fuoriuscire e l'altro per inserire la cannula. Quindi utilizzare un piccolo morsetto per arteria per tenere la cannula all'interno dell'arteria. Iniettare la soluzione anticoagulante nella cannula, quindi prelevare una piccola quantità di sangue per confermare la pervietà del tubo.

Quindi sciacquare la cannula con una soluzione anticoagulante e sigillare l'estremità con la fiamma di un accendino. Infine, utilizzare i punti di sutura per legare la cannula in posizione e rimuovere il morsetto arterioso. Quindi fissare una terza sutura attorno all'arteria e alla cannula, accorciare la lunghezza delle suture attorno all'arteria e chiudere la ferita del collo con più suture dopo il periodo di recupero, infusa una formulazione di interesse nell'animale tramite la cannula del duodeno.

Come illustrato nel grafico dopo la somministrazione del modello, farmaco lipofilo halal fanene, la velocità media del flusso linfatico per i ratti cannulati con successo era compresa tra 0,4 e 1,3 millilitri all'ora. In alcuni animali, la velocità del flusso linfatico era leggermente inferiore durante le prime una-tre ore dopo l'incannulamento prima di aumentare un fenomeno comunemente osservato dopo l'incannulamento linfatico riuscito nei ratti incannulati senza successo. Tuttavia, la velocità di flusso rimane sostanzialmente inferiore a quella osservata negli esperimenti riusciti durante il periodo di raccolta.

Allo stesso modo, in questi esperimenti rappresentativi, il trasporto linfatico cumulativo di trigliceridi e RIN halal era sostanzialmente inferiore negli animali incannulati senza successo. Mentre nei gruppi cannulati con successo, il trasporto cumulativo medio di halalan è stato del 15,1% della dose e il trasporto cumulativo dei trigliceridi è stato di 61 milligrammi in 10 ore. In questo esperimento rappresentativo di trasporto dei lipidi, la proporzione della dose di lipidi esogeni radiomarcata somministrata trasportata nella linfa era del 54%Questi valori non erano significativamente diversi da quelli osservati in precedenza.

Per una formulazione simile, la velocità di trasporto sia dei trigliceridi che dei farmaci nei picchi linfatici, alcuni dopo la somministrazione di lipidi e farmaci, e poi ritorna ai livelli basali. Come è tipico e intestinale esperimenti di trasporto di lipidi linfatici e farmaci. La velocità di trasporto del farmaco nella linfa durante ogni periodo di tempo rispecchia quella scena per il trasporto dei trigliceridi quando il farmaco viene trasportato nella linfa.

In associazione con le lipoproteine ricche di trigliceridi Una volta padroneggiata, l'incannulamento può essere completata entro 30 minuti se non si incontrano difficoltà. Seguendo questa procedura, i componenti all'interno della linfa raccolta possono essere isolati e utilizzati per ulteriori esperimenti, ad esempio per la reinfusione negli animali riceventi per valutarne direttamente la funzione, il metabolismo, la clearance o i modelli di disposizione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione delle tecniche per isolare e incannulare il dotto linfatico mesenterico, l'arteria carotide e il duodeno.

Utilizzando queste tecniche, dovresti essere in grado di valutare il trasporto di farmaci, lipidi e altri fattori dall'intestino attraverso e nella linfa mesenterica in Viva.