Un colorimetrico metodo che misura particolare Granzyme B proteolitici attività: idrolisi di Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
28 novembre 2014
Descriviamo un semplice test colorimetrico quantitativo che misura specificamente l'attività proteolitica del Granzima B (GzmB) umano, di topo o di ratto. Questo protocollo può essere facilmente adattato per determinare l'attività proteasica di altre serina proteasi in granuli mediante l'idrolisi di altri substrati peptidici sintetici con un'appropriata sequenza di riconoscimento.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare l'attività proteolitica della proteasi granzima B. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto un lisato delle cellule di interesse e quindi aggiungendo rapidamente il substrato ai campioni. L'attività del granzima B viene poi misurata mediante una reazione colorimetrica. In definitiva, la scissione altamente specifica di alla alla as s benzo da parte del granzima B può essere valutata in base alla sua specificità unica per residui di acido aspartico.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il rilevamento dell'espressione della granzima B mediante PCR o Western blot, è che l'idrolisi del benzil estere è specifica per la granzima B e indica anche che la proteasi è attiva. Per preparare la cellula, dopo l'attivazione, i lisati isolano innanzitutto cellule NK primarie da sospensioni cellulari singole di milza di topi di tipo selvatico C57BL/6 o di topi controllo null per il gene della granzima B, mediante selezione negativa utilizzando kit disponibili in commercio, seguendo le istruzioni del produttore. Lavare il campione tre volte in PBS alla velocità massima per due-tre secondi, quindi risospendere il pellet contenente almeno 5 milioni di cellule NK in 100 microlitri di tampone di lisi Nont P-40 su ghiaccio per 20 minuti.
Quindi centrifugare il lisato in una microcentrifuga per 10 minuti a 15.000 G e trasferire il sopranatante in una provetta nuova. Dopo aver determinato la concentrazione proteica secondo il protocollo commerciale appropriato, conservare il campione a una concentrazione minima di circa due milligrammi per millilitro a meno 20 gradi Celsius per eseguire un saggio di attività della granzima B. Successivamente, diluire un minimo di 100 microgrammi di lisato proteico per campione in tampone HEPES appena preparato fino a un volume finale di 160 microlitri.
Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, caricare 50 microlitri di campione per pozzetto in triplice replicato in una piastra da 96 pozzetti in vinile con fondo a U. Avendo cura di includere tre pozzetti di controllo contenenti solo tampone, aggiungere 100 microlitri di DTNB diluito a ciascun pozzetto. Successivamente, aggiungere rapidamente 50 microlitri di substrato di ala ala asks s benzoyl appena diluito ai pozzetti contenenti solo tampone, seguiti dai controlli negativi e terminando con i campioni positivi previsti.
Misurare l'attività della aase mediante l'idrolisi dell'alala come benzile in un lettore di micropiastre a una densità ottica di 405 nanometri, utilizzando un protocollo di saggio cinetico che prevede 25 letture ogni 15 secondi. Infine, utilizzare il software del lettore di piastre per calcolare la velocità massima di scissione del substrato per ogni pozzetto, quindi trasferire i dati grezzi al software appropriato per l'analisi statistica utilizzando topi con knockout del gene della granzima. È stato scoperto che il substrato peptidico sintetico alala come benzile viene idrolizzato specificamente dalla granzima B. Un'ulteriore scissione robusta del substrato sintetico può essere misurata nei lisati cellulari di cellule NK primarie di tipo selvaggio, ma non nelle cellule NK di animali con knockout della granzima B, utilizzati come controllo.
In questo esperimento, l'attività proteolitica della granzima A, che presenta una specificità del substrato simile alla tripsina ed è presente nei lisati di entrambi i tipi cellulari, era uguale, come misurato dall'idrolisi di BLT benzil. I-E-P-D-P-N-A è stato utilizzato in modo generico per testare l'attività della granzima B tra diverse specie. In questo esperimento rappresentativo, l'analisi delle sequenze tetrapeptidiche ha rivelato che la granzima B umana, ma non quella murina, può scindere in modo efficiente dopo la sequenza IEPD, che corrisponde alla sequenza di riconoscimento sia nel bid umano che murino. Al contrario, riducendo la quantità di lisato di cellule leucemiche NK umane da 30 microgrammi a 10 microgrammi, si ottiene comunque una quantità sufficiente di enzima granzima B per idrolizzare il substrato I-E-P-D-P-N-A.
Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come scegliere il substrato appropriato e i controlli sperimentali per l'analisi in vitro dell'enzima B rosso umano e murino.
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Panoramica
Questo articolo presenta un saggio colorimetrico quantitativo per la misurazione dell'attività proteolitica della Granzima B (GzmB) in campioni umani, di topo o di ratto. Il metodo può essere adattato ad altre proteasi sieriniche dei granuli utilizzando diversi substrati peptidici sintetici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Attività della proteasi
- Biologia cellulare
Sfondo
- La granzima B è una proteasi a serina coinvolta nelle risposte immunitarie.
- La misurazione della sua attività è fondamentale per comprendere il suo ruolo nella citotossicità mediata da cellule.
- Metodi esistenti come la PCR o il Western blot non misurano direttamente l'attività della proteasi.
- Questo saggio fornisce una misurazione specifica e diretta dell'attività della GzmB.
Scopo dello studio
- Sviluppare un saggio semplice per la quantificazione dell'attività della GzmB.
- Fornire un metodo che può essere adattato per altre proteasi.
- Migliorare le tecniche esistenti offrendo specificità per l'attività della GzmB.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di lisati cellulari da cellule NK primarie.
- Utilizzo di una reazione colorimetrica per misurare l'attività della GzmB.
- Isolamento di cellule NK da milze di topi di tipo selvaggio e privi del gene della granzima B.
- Idrolisi del substrato per valutare l'attività della proteasi.
Risultati principali
- Il saggio misura con successo l'attività della GzmB attraverso il taglio di un substrato specifico.
- Dimostra un'elevata specificità per la GzmB rispetto ad altri metodi.
- I risultati indicano che la proteasi è attiva in base all'idrolisi del substrato.
- Il metodo è adattabile ad altre proteasi sieriniche dei granuli.
Conclusioni
- Il saggio sviluppato è uno strumento affidabile per misurare l'attività della GzmB.
- Offre vantaggi rispetto ai metodi tradizionali grazie alla valutazione diretta della funzione della proteasi.
- Questo approccio può migliorare la ricerca sulle risposte immunitarie e sulla biologia delle proteasi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione accurata dell'attività proteolitica della Granzima B è essenziale per validare la funzione dei linfociti citotossici nello sviluppo dell'immunoterapia. Questo saggio colorimetrico fornisce un'indicazione diretta e specifica dell'attività della proteasi, consentendo una valutazione meccanicistica del legame al bersaglio e del potenziale pro-apoptotico nei modelli preclinici. La sua compatibilità interspecie supporta la continuità traslazionale dagli studi su roditori alle applicazioni umane.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei percorsi di apoptosi dipendenti dalla Granzima B nei linfociti citotossici.
- Valore operativo: Distingue la proteasi attiva dalla semplice espressione, riducendo i falsi positivi nella validazione degli obiettivi.
- Valore predittivo: Supporta la conferma funzionale della Granzima B come fattore meccanicistico nell'eliminazione immunitaria dei tumori.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Utilizza il substrato Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl idrolizzato esclusivamente dalla Granzima B nei sistemi umano, murino e del ratto.
- Output quantitativo: Misura le velocità iniziali di idrolisi mediante reazione colorimetrica accoppiata a DTNB a 405 nm per l'analisi cinetica.
- Controllo della specificità: Esclude interferenze da parte delle caspasi e di altre granzime grazie alla specifica preferenza per l'aspartato.
- Riproducibilità: Compatibile con lisati non frazionati e proteasi ricombinanti quando vengono inclusi adeguati controlli.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Applicabile a modelli di immunosorveglianza tumorale, infezione virale e patologia autoimmune in cui la Granzima B media la morte delle cellule bersaglio.
- Continuità traslazionale: Permette una misurazione dell'attività coerente tra specie, supportando l'estrapolazione dei dati da mouse a uomo.
- Decisioni basate sul rischio: Fornisce un biomarcatore basato sull'attività per selezionare i candidati con potenziale citotossico confermato.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, in cui l'attività funzionale della proteasi fornisce informazioni sull'efficacia biologica e sul meccanismo d'azione.
- Biologia della scoperta: Conferma l'ipotesi secondo cui la Granzima B induce l'apoptosi nei linfociti effetori mediante scissione specifica per substrato.
- Screening: Fornisce letture quantitative standardizzate dell'attività per confrontare condizioni o perturbazioni genetiche.
- Analisi: Genera dati cinetici (Vmax) che consentono il confronto tra campioni e la valutazione statistica della capacità proteolitica.
- Ricerca traslazionale: Supporta la validazione preclinica verificando l'attività conservata della Granzima B in esseri umani, topi e ratti.
- Riutilizzo aziendale: Piattaforma adattabile ad altre proteasi dei granuli mediante sostituzione del substrato, aumentandone l'utilità a lungo termine.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: La misurazione diretta della funzione proteolitica riduce la dipendenza da marcatori surrogati come i livelli di mRNA o di proteina.
- Valore operativo: Formato semplice basato su piastre, con tempo minimo di manipolazione manuale e compatibilità con lettori standard di micropiastre.
- Valore strategico: Consente decisioni di avanzamento o interruzione basate sull'attività funzionale piuttosto che sull'espressione soltanto, migliorando l'affidabilità predittiva.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce lo sviluppo di immunoterapie con rischio adeguato, confermando precocemente la potenza meccanicistica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento di cellule immunitarie primarie e nella loro lisi in condizioni controllate per preservare l'attività delle proteasi.
- Richiede l'accesso a un lettore di micropiastre in grado di effettuare misurazioni cinetiche della densità ottica a 405 nm e a un software di analisi compatibile.
- Necessita dell'inclusione di controlli knockout per la Granzima B per confermare la specificità del saggio, come dimostrato nella fonte.
- L'adattamento ad altre proteasi richiede la validazione di substrati alternativi per mantenere una specificità e una finestra di segnale equivalenti.
- Limite pratico: il saggio misura l'attività totale del lisato e potrebbe richiedere una frazionatura per studi di localizzazione subcellulare.
