Un colorimetrico metodo che misura particolare Granzyme B proteolitici attività: idrolisi di Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
28 novembre 2014
Descriviamo un semplice test colorimetrico quantitativo che misura specificamente l'attività proteolitica del Granzima B (GzmB) umano, di topo o di ratto. Questo protocollo può essere facilmente adattato per determinare l'attività proteasica di altre serina proteasi in granuli mediante l'idrolisi di altri substrati peptidici sintetici con un'appropriata sequenza di riconoscimento.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare l'attività proteolitica del granzima ine proteasi B. Ciò si ottiene preparando prima un lisato delle cellule di interesse e quindi aggiungendo rapidamente il substrato ai campioni. L'attività del granzima B viene quindi misurata mediante una reazione colorimetrica. In definitiva, la scissione altamente specifica di alla as s benzo da parte del granzima B può essere valutata in base alla sua specificità di substrato unica per i residui di una parte acida.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il rilevamento dell'espressione della grande zona B mediante PCR o Western blot, è che l'idrolisi del benzile è specifica per la grande zona B e indica anche che la proteasi è attiva. Per preparare la cellula, i lisati isolano prima le cellule NK primarie dalle sospensioni unicellulari della milza da sei neri selvatici di tipo C 57, o controllano i topi privi del gene del granzima B mediante selezione negativa utilizzando kit disponibili in commercio secondo le istruzioni del produttore dopo che le cellule sono state attivate. Lavare la coltura tre volte in PBS alla massima velocità per due o tre secondi, quindi risospendere il pellet contenente un minimo di 5 milioni di cellule NK in 100 microlitri di tampone di lisi Nont P 40 su ghiaccio per 20 minuti.
Quindi centrifugare il lisato in una microcentrifuga per 10 minuti a 15.000 g e trasferire l'agente supino in una provetta nuova. Dopo aver determinato la concentrazione proteica, secondo l'appropriato protocollo disponibile in commercio, conservare lo stato a una concentrazione minima di circa due milligrammi per millilitro a 20 gradi Celsius negativi per eseguire un saggio di attività del grande zima B. Successivamente, diluire un minimo di 100 microgrammi di lisato proteico per campione in cumuli di tampone appena preparati fino a un volume finale di 160 microlitri.
Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, caricare 50 microlitri di campione per pozzetto in triplicato in una piastra inferiore a U in vinile da 96 pozzetti. Avendo cura di includere tre pozzetti di controllo solo tampone, aggiungere 100 microlitri di DTNB diluito a ciascuno. Bene, quindi aggiungere rapidamente 50 microlitri di substrato benzoilico di alala chiede s appena diluito a ciascuno dei pozzetti tampone da solo, seguito da eventuali controlli negativi e terminando con i campioni positivi attesi.
Misurare l'attività dell'aase mediante idrolisi dell'alala come benzile in un lettore di micropiastre a una densità ottica di 405 nanometri utilizzando un protocollo di saggio cinetico che effettua 25 letture ogni 15 secondi. Infine, utilizzare il software di lettura delle piastre per calcolare il tasso massimo di scissione del substrato per ciascun pozzetto, quindi trasferire i dati grezzi al software di analisi statistica appropriato utilizzando topi knockout per il gene granzyme. È stato scoperto che il substrato peptidico sintetico alala come benzile è specificamente idrolizzato dal granzima B. Un'ulteriore robusta scissione del substrato sintetico può essere misurata nei lisati cellulari di cellule NK primarie wildtype, ma non nelle cellule NK di animali knockout per granzima B come controllo.
In questo esperimento, l'attività proteolitica del granzima A, che ha una specificità del substrato simile alla tripsina ed è presente nei lisati di entrambi i tipi di cellule, è stata uguale misurata dall'idrolisi del benzile BLT, I-E-P-D-P-N-A è stato utilizzato genericamente per testare l'attività del granzima B in tutte le specie. In questo esperimento rappresentativo, l'analisi delle sequenze di tetra peptidi ha rivelato che il granzima B umano, ma non di topo, può scindersi in modo efficiente dopo la sequenza IEPD, che corrisponde alla sequenza di riconoscimento sia nell'offerta umana che in quella di topo. Al contrario, la diminuzione della quantità di lisato di cellule di leucemia NK umana da 30 microgrammi a 10 microgrammi si traduce ancora in una quantità sufficiente di grammo dell'enzima B per idrolizzare il substrato I-E-P-D-P-N-A.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come scegliere il substrato appropriato e i controlli sperimentali per l'analisi in vitro dell'enzima B rosso umano e murino.
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Panoramica
Questo articolo presenta un saggio colorimetrico quantitativo per la misurazione dell'attività proteolitica della Granzima B (GzmB) in campioni umani, di topo o di ratto. Il metodo può essere adattato ad altre proteasi sieriniche dei granuli utilizzando diversi substrati peptidici sintetici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Attività della proteasi
- Biologia cellulare
Sfondo
- La granzima B è una proteasi a serina coinvolta nelle risposte immunitarie.
- La misurazione della sua attività è fondamentale per comprendere il suo ruolo nella citotossicità mediata da cellule.
- Metodi esistenti come la PCR o il Western blot non misurano direttamente l'attività della proteasi.
- Questo saggio fornisce una misurazione specifica e diretta dell'attività della GzmB.
Scopo dello studio
- Sviluppare un saggio semplice per la quantificazione dell'attività della GzmB.
- Fornire un metodo che può essere adattato per altre proteasi.
- Migliorare le tecniche esistenti offrendo specificità per l'attività della GzmB.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di lisati cellulari da cellule NK primarie.
- Utilizzo di una reazione colorimetrica per misurare l'attività della GzmB.
- Isolamento di cellule NK da milze di topi di tipo selvaggio e privi del gene della granzima B.
- Idrolisi del substrato per valutare l'attività della proteasi.
Risultati principali
- Il saggio misura con successo l'attività della GzmB attraverso il taglio di un substrato specifico.
- Dimostra un'elevata specificità per la GzmB rispetto ad altri metodi.
- I risultati indicano che la proteasi è attiva in base all'idrolisi del substrato.
- Il metodo è adattabile ad altre proteasi sieriniche dei granuli.
Conclusioni
- Il saggio sviluppato è uno strumento affidabile per misurare l'attività della GzmB.
- Offre vantaggi rispetto ai metodi tradizionali grazie alla valutazione diretta della funzione della proteasi.
- Questo approccio può migliorare la ricerca sulle risposte immunitarie e sulla biologia delle proteasi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione accurata dell'attività proteolitica della Granzima B è essenziale per validare la funzione dei linfociti citotossici nello sviluppo dell'immunoterapia. Questo saggio colorimetrico fornisce un'indicazione diretta e specifica dell'attività della proteasi, consentendo una valutazione meccanicistica del legame al bersaglio e del potenziale pro-apoptotico nei modelli preclinici. La sua compatibilità interspecie supporta la continuità traslazionale dagli studi su roditori alle applicazioni umane.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei percorsi di apoptosi dipendenti dalla Granzima B nei linfociti citotossici.
- Valore operativo: Distingue la proteasi attiva dalla semplice espressione, riducendo i falsi positivi nella validazione degli obiettivi.
- Valore predittivo: Supporta la conferma funzionale della Granzima B come fattore meccanicistico nell'eliminazione immunitaria dei tumori.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Utilizza il substrato Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl idrolizzato esclusivamente dalla Granzima B nei sistemi umano, murino e del ratto.
- Output quantitativo: Misura le velocità iniziali di idrolisi mediante reazione colorimetrica accoppiata a DTNB a 405 nm per l'analisi cinetica.
- Controllo della specificità: Esclude interferenze da parte delle caspasi e di altre granzime grazie alla specifica preferenza per l'aspartato.
- Riproducibilità: Compatibile con lisati non frazionati e proteasi ricombinanti quando vengono inclusi adeguati controlli.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Applicabile a modelli di immunosorveglianza tumorale, infezione virale e patologia autoimmune in cui la Granzima B media la morte delle cellule bersaglio.
- Continuità traslazionale: Permette una misurazione dell'attività coerente tra specie, supportando l'estrapolazione dei dati da mouse a uomo.
- Decisioni basate sul rischio: Fornisce un biomarcatore basato sull'attività per selezionare i candidati con potenziale citotossico confermato.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, in cui l'attività funzionale della proteasi fornisce informazioni sull'efficacia biologica e sul meccanismo d'azione.
- Biologia della scoperta: Conferma l'ipotesi secondo cui la Granzima B induce l'apoptosi nei linfociti effetori mediante scissione specifica per substrato.
- Screening: Fornisce letture quantitative standardizzate dell'attività per confrontare condizioni o perturbazioni genetiche.
- Analisi: Genera dati cinetici (Vmax) che consentono il confronto tra campioni e la valutazione statistica della capacità proteolitica.
- Ricerca traslazionale: Supporta la validazione preclinica verificando l'attività conservata della Granzima B in esseri umani, topi e ratti.
- Riutilizzo aziendale: Piattaforma adattabile ad altre proteasi dei granuli mediante sostituzione del substrato, aumentandone l'utilità a lungo termine.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: La misurazione diretta della funzione proteolitica riduce la dipendenza da marcatori surrogati come i livelli di mRNA o di proteina.
- Valore operativo: Formato semplice basato su piastre, con tempo minimo di manipolazione manuale e compatibilità con lettori standard di micropiastre.
- Valore strategico: Consente decisioni di avanzamento o interruzione basate sull'attività funzionale piuttosto che sull'espressione soltanto, migliorando l'affidabilità predittiva.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce lo sviluppo di immunoterapie con rischio adeguato, confermando precocemente la potenza meccanicistica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento di cellule immunitarie primarie e nella loro lisi in condizioni controllate per preservare l'attività delle proteasi.
- Richiede l'accesso a un lettore di micropiastre in grado di effettuare misurazioni cinetiche della densità ottica a 405 nm e a un software di analisi compatibile.
- Necessita dell'inclusione di controlli knockout per la Granzima B per confermare la specificità del saggio, come dimostrato nella fonte.
- L'adattamento ad altre proteasi richiede la validazione di substrati alternativi per mantenere una specificità e una finestra di segnale equivalenti.
- Limite pratico: il saggio misura l'attività totale del lisato e potrebbe richiedere una frazionatura per studi di localizzazione subcellulare.
