Name: Un colorimetrico metodo che misura particolare Granzyme B proteolitici attività: idrolisi di Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Impara a misurare l'attività proteolitica della Granzyme B con un saggio colorimetrico specifico. Questo metodo utilizza lisati di cellule NK e substrati sintetici per valutare direttamente la funzione enzimatica.

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Questo lavoro ha ricevuto sostegno attraverso la sovvenzione HA 6136/1-1 dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) a MH. JAT è supportato da sovvenzioni per programmi e progetti del National Health and Medical Research Council of Australia.

NOTA: milze erano derivate da topi (6-10 settimane di età) e tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida etiche degli animali del Centro Cancer MacCallum Peter (E486). 1. Preparazione dei campioni. <ol><li> Preparazione delle cellule del mouse NK attivate. <ol><li> Isolare cellule NK naive primarie da cella singola sospensioni dei milza di C57BL / 6 o B6.GrzmB - / - (GzmB gene null) topo di selezione negativa utilizzando kit disponibili in commercio. </li><li> Seguire il protocollo dei costruttori. In breve, magneticamente etichettare &quot;non-NK&quot; cellule come le cellule T e B, cellule dendritiche, granulociti, macrofagi e globuli rossi utilizzando anticorpi biotina-coniugato contro i loro marcatori di superficie specifici. Utilizzare separazione magnetica con perle anti-biotina deplezione delle cellule &quot;non-NK&quot;. </li><li> Culture isolato cellule NK per 5-7 giorni in terreni contenenti IL-2 (1.000 U / ml) a 700.000 cellule / ml in piastre da 24 pozzettia 37 &#160; ° C. </li><li> In alternativa, l&#39;uso attivato cellule T 19, primaria antigene-ristretto da CTL OT1 T cell receptor topi transgenici 20, CTL generati in colture miste linfocitarie 21 o supernatanti di cellule NK attivate per determinare l&#39;attività di secreto GzmB 19. </li></ol></li><li> Mantenimento della linea di cellule NK umane e l&#39;isolamento di cellule NK primarie. <ol><li> Mantenere leucemia umana NK (cellule YT) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium supplementato con siero di vitello fetale del 10%. In alternativa, purificare cellule NK primari da sangue periferico di soggetti sani e stimolare per 2-3 giorni in terreno contenente IL-2 a 100 U / ml 22 come precedentemente descritto. </li></ol></li><li> Generazione di lisati cellulari. <ol><li> Lavare le cellule tre volte in PBS (pH 7,4), poi sospendere Nonidet P-40 tampone di lisi (0,1% NP-40, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes, 2,5 mM EDTA). Idealmente, lisare un minimo di 5 x 10 6 </sup&gt; cellule NK, o 1 x 10 7 cellule T in 100 microlitri di buffer. Non aggiungere gli inibitori della proteasi, come molti sono inibitori irreversibili della serina-proteasi, in particolare tryptases quali GzmA. Incubare in ghiaccio per 20 minuti, e poi pellet nuclei in una microcentrifuga a 15.000 xg per 10 min. Eliminare il pellet nucleare e trasferire il surnatante in una nuova provetta. </li></ol></li><li> Determinare la concentrazione di proteine ​​dei lisati. <ol><li> Utilizzare un protocollo disponibile in commercio di scelta come, Bradford o acido bicinconinico (BCA) e determinare la concentrazione di proteine. Assicurarsi che la concentrazione è ~ 2 mg minimo / ml. Conservare lisati a -20 ° C fino al momento (attività granzyme è stabile per molti mesi a -20 ° C). </li></ol></li></ol> 2. Granzyme B Activity Assay <ol><li> Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparare uno stock 10 mM dei substrati (Boc-AAD-S-Bzl o Ac-IEPD-Anp) in DMSO (~ 5 mg / ml) e conservare in aliquote a -20 &amp; #176; C. Preparare una diluizione di lavoro fresco e gettare dopo ogni giorno, come Boc-AAD-S-Bzl idrolizza parzialmente in deposito in DMSO. </li><li> Preparare uno stock di 250 mm del reagente colorimetrico (5,5&#39;-ditio-bis (acido 2-nitrobenzoico), DTNB) in DMSO (0,09 g / ml) e conservare a -20 ° C. Preparare una diluizione di lavoro fresco ogni giorno. Questo reagente è richiesto solo per substrati con gruppi di indicatori SBzl, non dell&#39;Anp. </li><li> Make up tampone fresco (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl 2, pH 7,3) ogni 2-3 settimane. </li></ol></li><li> Portare DTNB e substrati sintetici a temperatura ambiente. Diluire substrati (01:16, ad esempio 100 microlitri di 1.6 ml di tampone) e DTNB (1: 250, ad esempio, 10 ml a 2,5 ml di tampone) e mescolare bene. </li><li> Diluire un minimo di 100 mcg di proteine ​​lisato di ciascun campione in tampone ad un volume finale di 160 microlitri. Usando una pipetta multicanale aggiungere 50 ml per pozzetto in triplice copia (~ 33,3 mcg / pozzetto) in un &#39;&#39; U &#39;&#39; vinile bottom piastra da 96 pozzetti.Includere un &quot;buffer-only&quot; di controllo (anche in triplice copia). </li><li> Aggiungere 100 ml di DTNB diluito al controllo dei campioni / tampone (saltare questo passaggio quando si lavora con Ac-IEPD-pNA. NOTA: La scissione di Ac-IEPD-pNA dal GzmB rilascia direttamente fluorogenico pNA (Figura 4B). </li><li> Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere rapidamente 50 ml di substrati diluito per ogni set di triplicato, a cominciare con il tampone poi tutti i controlli negativi e la finitura con campioni positivi attesi. </li><li> Posizionare la piastra nel lettore di piastre. Misurare l&#39;attività Asp-ase per idrolisi di Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA in un lettore di micropiastre a OD 405 nm. Utilizzare un protocollo di test cinetico, prendere 25 misure, ogni 15 sec (ca. 6 min di tempo di lettura totale). </li><li> Utilizzare le letture di assorbanza generati in ogni punto di tempo per calcolare manualmente il tasso di substrato scissione se il software della piastra-reader non può generare un valore per Vmax. </li></ol> 3. Analisi di Data NOTA: I dati generati si presenta come la velocità massima, definita come il cambiamento di OD nel tempo (Mod / min). <ol><li> Per analizzare i dati, determinare il tasso massimo di substrato scissione, che viene calcolato dal tasso di variazione di assorbanza. Fate questo automaticamente utilizzando il software lettore di piastre, che in genere ha questa opzione. </li><li> In alternativa, dopo aver visto le trame cinetiche di variazione di assorbanza, che vengono generati durante il dosaggio cinetico sul lettore piatto, selezionare manualmente i punti di dati che danno la più ripida linea retta. Per la maggior parte i test la velocità massima viene raggiunta entro i primi 2 minuti del test. </li><li> Sottrarre la lettura OD iniziale dalla lettura OD alto su questa linea retta e dividere per l&#39;intervallo di tempo. Trasferire i dati grezzi per pad Microsoft Excel / Graph per l&#39;analisi statistica e la visualizzazione grafica. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Storicamente i granzimi sono stati identificati come molecole effettrici chiave di linfociti citotossici (cellule CTL e NK) in grado di indurre una rapida morte apoptotica nelle cellule bersaglio. Questo è principalmente dovuto all&#39;azione di GzmB che scisso molecole substrato bersaglio a (D) residui di aspartato e quindi era in grado di attivare la cascata caspasi da entrambi da tagliare pro-caspasi, così come molti dei loro bersagli a valle. Tuttavia, è ora apprezzato che l&#39;espressione GzmB non è limitato alle ...

Granzimi sono una famiglia di serina proteasi presenti nei lisosomi secretori di natural killer (NK) e dei linfociti T citotossici (CTL) 1. Esistono cinque differenti granzimi nell&#39;uomo (A, B, H, K e M), e dieci nei topi (A - G, K, M e N) 2,3. Granzyme A e B Granzyme (GzmA, GzmB) sono i più abbondanti e sono stati ampiamente studiati nel contesto umano e roditori. La funzione classica GzmB è l&#39;induzione di apoptosi nelle cellule bersaglio eseguite in combinazione con la proteina perforina formano pori, che permette di accedere granzyme citosol cellula bersaglio 4. Anche se l&#39;espressione GzmB è inequivocabilmente trova in linfociti citotossici, studi recenti stanno affrontando una serie di altri tipi di cellule-GzmB esprimono, compreso ma non limitato ai cheratinociti 5, 6 basofili, mastociti 7, cellule dendritiche plasmacitoidi 8, e le cellule B 9, 10.In questo contesto, le funzioni GzmB non-apoptotici sono stati rivelati vanno dalla partecipazione a processi infiammatori, rimodellamento dei tessuti e altre proprietà immunomodulanti 11-14. Dato che un ruolo biologico più ampio è stato proposto per GzmB quanto precedentemente sospettato, ricercatori richiedono strumenti affidabili e specifici per la sua individuazione. Di vantaggio è requisito specifico di GzmB per fendere sul lato carbossilico di residui di acido aspartico, una struttura unica tra serina proteasi eucariotiche 15. Mouse, umano e di ratto GzmB sono strutturalmente molto simile, tuttavia la specificità di substrato di topo GzmB estesa differisce leggermente da quella di umano e di ratto 16, il che significa che certi substrati generici con Asp al terminale (P1) possono essere scissi efficientemente GzmB da tutte e tre le specie, mentre altri substrati con sequenze più complesse monte di P1 può dare risultati molto variabili. Sia nel passato e li più recenteterature, questo fatto ha provocato una notevole confusione e cattiva interpretazione del significato biologico di alcuni risultati sperimentali, anche se attentamente controllato, studi cinetici hanno cercato di correggere la situazione 17. In questo articolo abbiamo cercato di illustrare questi punti con due substrati disponibili in commercio, vale a dire Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl e N-acetil-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilide. I due reagenti fare generare diversi gruppi reattivi a seguito di scissione (un sulfidrilico gratuito contro un paranitroanilide gratuito fluorescente), ma questo non ha alcun effetto su qualunque taglio proteolitico. Il protocollo descritto è un adattamento moderno di un protocollo molto vecchio 18, ma dovrebbe aiutare gli investigatori di utilizzare i diversi substrati GzmB adeguatamente, fornendo inoltre un quadro metodologico per rilevare l&#39;attività di altri granzimi, come GzmA e GzmH.

<table><tbody><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SMSB05</td><td>Substrato del granzima B (topo e uomo)</td></tr><tr><td>Ac-IEPD-pNA&nbsp;</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SMPNA009</td><td>substrato di Granzyme B (solo umano)</td></tr><tr><td>N-&#945;-CBZ-L-lisina-S-Bzl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3647</td><td>Substrato di Granzyme A</td></tr><tr><td>Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SB025</td><td>Substrato di Granzyme H</td></tr><tr><td>5,5'-ditio-bis(acido 2-nitrobenzoico)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8130</td><td>DTNB, Ellman' s Kit</td></tr><tr><td>di isolamento cellulare NK</td> reagente II <td>topo Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-096-892</td><td>kit di selezione negativa</td></tr><tr><td>Kit di isolamento cellulare NK umano</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-657</td><td>kit di selezione negativa</td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>Biorad iMark</td><td></td><td>Biorad Microplate Manager Versione software MPM6.3</td></tr><tr><td>Serocluster U-bottom vinile piastra a 96 pozzetti</td><td>Corning, MA, USA</td><td>2797</td><td></td></tr></tbody></table>

un colorimetrico metodo che misura particolare granzyme b proteolitici attività: idrolisi di boc-ala-ala-asp-s-bzl

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

La serina proteasi Granzyme B (GzmB) media l'apoptosi delle cellule bersaglio quando viene rilasciata dai linfociti T citotossici (CTL) o dalle cellule natural killer (NK). Il GzmB è il granzima più studiato nell'uomo e nei topi e quindi i ricercatori hanno bisogno di strumenti specifici e affidabili per studiarne la funzione e il ruolo nella fisiopatologia. Ciò richiede in particolare saggi che non riconoscano proteasi come caspasi o altri granzimi strutturalmente o funzionalmente correlati. Qui, applichiamo la preferenza di GzmB per la scissione dopo residui di acido aspartico in un saggio colorimetrico utilizzando il peptide tioestere Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Il GzmB è l'unica serina proteasi di mammifero in grado di scindere questo substrato. Il substrato viene tagliato con efficienza simile dal GzmB umano, di topo e di ratto, una proprietà non condivisa da altri substrati peptidici disponibili in commercio, anche da alcuni che sono pubblicizzati come adatti a questo scopo. Questo protocollo è dimostrato utilizzando lisati non frazionati da cellule NK attivate o CTL ed è adatto anche per proteasi ricombinanti generate in una varietà di sistemi procariotici ed eucariotici, a condizione che vengano utilizzati i controlli corretti. Questo test è un metodo altamente specifico per accertare la potenziale attività pro-apoptotica di molecole citotossiche nei linfociti di mammifero e delle loro controparti ricombinanti espresse da una varietà di metodologie.

Il substrato Boc-AAD-S-Bzl è specifico per GzmB Il GzmB serina proteasi è un importante costituente di linfociti citotossici (cellule CTL e NK) ed è prevalentemente responsabile per indurre una rapida morte per apoptosi nelle cellule bersaglio, come le cellule infettate da virus o trasformate. Ciò è in gran parte dovuto alla sua preferenza substrato per la scissione, dopo taluni residui aspartato specifici in proteine ​​selezionate, un attributo condiviso con le caspasi, che...

Descriviamo un semplice test colorimetrico quantitativo che misura specificamente l'attività proteolitica del Granzima B (GzmB) umano, di topo o di ratto. Questo protocollo può essere facilmente adattato per determinare l'attività proteasica di altre serina proteasi in granuli mediante l'idrolisi di altri substrati peptidici sintetici con un'appropriata sequenza di riconoscimento.

Un colorimetrico metodo che misura particolare Granzyme B proteolitici attività: idrolisi di Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare l'attività proteolitica della proteasi granzima B. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto un lisato delle cellule di interesse e quindi aggiungendo rapidamente il substrato ai campioni. L'attività del granzima B viene poi misurata mediante una reazione colorimetrica. In definitiva, la scissione altamente specifica di alla alla as s benzo da parte del granzima B può essere valutata in base alla sua specificità unica per residui di acido aspartico.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il rilevamento dell'espressione della granzima B mediante PCR o Western blot, è che l'idrolisi del benzil estere è specifica per la granzima B e indica anche che la proteasi è attiva. Per preparare la cellula, dopo l'attivazione, i lisati isolano innanzitutto cellule NK primarie da sospensioni cellulari singole di milza di topi di tipo selvatico C57BL/6 o di topi controllo null per il gene della granzima B, mediante selezione negativa utilizzando kit disponibili in commercio, seguendo le istruzioni del produttore. Lavare il campione tre volte in PBS alla velocità massima per due-tre secondi, quindi risospendere il pellet contenente almeno 5 milioni di cellule NK in 100 microlitri di tampone di lisi Nont P-40 su ghiaccio per 20 minuti.Quindi centrifugare il lisato in una microcentrifuga per 10 minuti a 15.000 G e trasferire il sopranatante in una provetta nuova. Dopo aver determinato la concentrazione proteica secondo il protocollo commerciale appropriato, conservare il campione a una concentrazione minima di circa due milligrammi per millilitro a meno 20 gradi Celsius per eseguire un saggio di attività della granzima B. Successivamente, diluire un minimo di 100 microgrammi di lisato proteico per campione in tampone HEPES appena preparato fino a un volume finale di 160 microlitri.Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, caricare 50 microlitri di campione per pozzetto in triplice replicato in una piastra da 96 pozzetti in vinile con fondo a U. Avendo cura di includere tre pozzetti di controllo contenenti solo tampone, aggiungere 100 microlitri di DTNB diluito a ciascun pozzetto. Successivamente, aggiungere rapidamente 50 microlitri di substrato di ala ala asks s benzoyl appena diluito ai pozzetti contenenti solo tampone, seguiti dai controlli negativi e terminando con i campioni positivi previsti.Misurare l'attività della aase mediante l'idrolisi dell'alala come benzile in un lettore di micropiastre a una densità ottica di 405 nanometri, utilizzando un protocollo di saggio cinetico che prevede 25 letture ogni 15 secondi. Infine, utilizzare il software del lettore di piastre per calcolare la velocità massima di scissione del substrato per ogni pozzetto, quindi trasferire i dati grezzi al software appropriato per l'analisi statistica utilizzando topi con knockout del gene della granzima. È stato scoperto che il substrato peptidico sintetico alala come benzile viene idrolizzato specificamente dalla granzima B. Un'ulteriore scissione robusta del substrato sintetico può essere misurata nei lisati cellulari di cellule NK primarie di tipo selvaggio, ma non nelle cellule NK di animali con knockout della granzima B, utilizzati come controllo.In questo esperimento, l'attività proteolitica della granzima A, che presenta una specificità del substrato simile alla tripsina ed è presente nei lisati di entrambi i tipi cellulari, era uguale, come misurato dall'idrolisi di BLT benzil. I-E-P-D-P-N-A è stato utilizzato in modo generico per testare l'attività della granzima B tra diverse specie. In questo esperimento rappresentativo, l'analisi delle sequenze tetrapeptidiche ha rivelato che la granzima B umana, ma non quella murina, può scindere in modo efficiente dopo la sequenza IEPD, che corrisponde alla sequenza di riconoscimento sia nel bid umano che murino. Al contrario, riducendo la quantità di lisato di cellule leucemiche NK umane da 30 microgrammi a 10 microgrammi, si ottiene comunque una quantità sufficiente di enzima granzima B per idrolizzare il substrato I-E-P-D-P-N-A.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come scegliere il substrato appropriato e i controlli sperimentali per l'analisi in vitro dell'enzima B rosso umano e murino.

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In questo video, eseguiamo la zimografia, una tecnica elettroforetica, per analizzare l'attività proteolitica all'interno di campioni biologici.

Zimografia peptidica fluorescente: una tecnica modificata per rilevare l'attività della proteasi utilizzando substrati fluorogenici in gel per zimogrammi

Questo video descrive un test luminescente in vitro Caspase-3/7 per quantificare la morte cellulare o l'apoptosi. Il test misura la luminescenza prodotta in seguito alla scissione della caspasi-3/7 di un substrato DEVD proluminescente. La luminescenza generata è proporzionale all'attività della caspasi-3/7.

Saggio della caspasi-3/7: un test basato sulla luminescenza per quantificare l'apoptosi misurando le attività della caspasi-3/7 negli espianti di pelle di rana

Questo video mostra un test per lo screening dell'attività proteolitica delle proteasi utilizzando peptidi fluorogenici. La proteasi riconosce il suo sito di scissione sul peptide, scorporandolo e separando il quencher dal fluoroforo, consentendone l'emissione di fluorescenza. Il segnale di fluorescenza viene rilevato e analizzato per verificare l'efficienza di scissione di diverse varianti peptidiche.

Un saggio di scissione del peptide fluorogenico per lo screening dell'attività proteolitica delle proteasi

Questo video mostra un test per monitorare l'attivazione dei neutrofili e l'esocitosi dei granuli attraverso un test di degranulazione. Dopo l'attivazione da parte di composti proinfiammatori, i granuli citoplasmatici all'interno dei neutrofili contenenti gelatinasi si fondono con la membrana cellulare, scaricando il loro carico. La presenza di gelatinasi nel surnatante viene valutata attraverso l'idrolisi di un substrato di gelatina coniugato con fluorofori, confermando l'attivazione e la...

Un test di degranulazione per monitorare l'attivazione dei neutrofili e il rilascio di gelatinasi

Questo video mostra un saggio di degranulazione di granuli azurofili in neutrofili di topo, che coinvolge la stimolazione dei neutrofili per rilasciare granuli azurofili contenenti mieloperossidasi. La successiva reazione enzimatica viene impiegata per quantificare i livelli di mieloperossidasi, fornendo informazioni sull'attivazione dei neutrofili.

Un test per monitorare la degranulazione dei granuli azurofili nei neutrofili dopo l'attivazione

Descriviamo qui un sistema di espressione granzima efficiente in termini di costi utilizzando cellule HEK293T che produce alte rese di proteasi pura, completamente glicosilata ed enzimaticamente attiva.

A High Yield e Cost-efficient Sistema Espressione di granzimi umane in cellule di mammifero

Qui, presentiamo protocolli per selezionare e caratterizzare rapidamente gli enzimi per l'attività antimicrobica. Il saggio di diffusione su microvetrini e il saggio di rilascio del colorante utilizzano substrati batterici target per la valutazione qualitativa e quantitativa dell'attività enzimatica.

Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per una tecnica di zymographic modificate in cui peptidi fluorescenti vengono utilizzati come substrato degradabile al posto di proteine native. L'elettroforesi dei campioni biologici in zymograms peptide fluorescente consente il rilevamento di una vasta gamma delle proteasi che tecniche zymographic precedenti.

Rilevazione di attività di proteasi dallo Zymography Peptide fluorescente

Il presente protocollo descrive due metodi per misurare l'attività delle caspasi attraverso un substrato fluorogenico utilizzando la citometria a flusso o uno spettrofluorometro.

Misurazione dell'attività della caspasi mediante un saggio fluorometrico o citometria a flusso

Qui descriviamo i protocolli per la caratterizzazione biofisica della formazione di complessi ternari indotti da chimere mirate alla proteolisi (PROTACS) che coinvolgono le ubiquitina ligasi Von Hippel-Lindau E3 ligasi (VHL) e Cereblon (CRBN).  I metodi biofisici qui illustrati includono la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l'interferometria del biostrato (BLI) e la calorimetria di titolazione isotermica (ITC).

Lo sviluppo e l'applicazione di saggi biofisici per la valutazione della formazione di complessi ternari indotti da chimere mirate alla proteolisi (PROTACS)

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un metodo di saggio colorimetrico per determinare la capacità dei composti di inibire o attivare l'attività dell'elastasi.

Quantificazione della modulazione dell'attività dell'enzima elastasi attraverso l'analisi colorimetrica

Impara a misurare l'attività proteolitica della Granzyme B con un saggio colorimetrico specifico. Questo metodo utilizza lisati di cellule NK e substrati sintetici per valutare direttamente la funzione enzimatica.

Un colorimetrico metodo che misura particolare Granzyme B proteolitici attività: idrolisi di Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

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