Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la funzione di una popolazione di canali CFTR in un sistema ricostruito ed esaminare la risposta dei canali alla presenza di molecole modulatrici. Questo viene ottenuto innanzitutto purificando la proteina CFTR di tipo selvaggio o mutante da cellule SF nine mediante una procedura rapida di purificazione, che fornisce proteina CFTR funzionale in soluzione di detergente. Il secondo passaggio consiste nel reconstituire la proteina purificata in proteoliposomi con un lipide definito, scelto dall'operatore.

Successivamente, viene generato un gradiente chimico di ioduro attraverso la membrana rimuovendo l'ioduro in eccesso presente nei liposomi, creando così una forza motrice per il movimento degli ioni attraverso il canale CFTR. L'ultimo passaggio consiste nell'attivare il canale e avviare il rilascio di ioduro dai liposomi proteici in presenza della molecola modulatrice di interesse. Infine, un elettrodo selettivo per l'ioduro viene utilizzato per monitorare in tempo reale la funzione del canale CFTR in questo sistema ricostruito.

Questo metodo permette lo studio dell'attività del canale del cloruro in una popolazione purificata di molecole di CFTR dopo la loro reidratazione in liposomi a base di fosfolipidi. Sebbene questo metodo sia stato ideato per ottenere informazioni sulla funzione del canale C-F-D-R-N nine e sull'effetto di modulatori di piccole molecole, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la caratterizzazione funzionale di altre proteine di membrana. Per avere successo, chi si approccia per la prima volta a questo metodo deve assicurarsi di aver ottimizzato i rapporti proteina/lipide per il proprio sistema, di non lavorare con proteine scarsamente funzionali o non funzionali, e di aver generato un gradiente sufficiente di ioduro attraverso vescicole ben sigillate.

Per preparare il lipide, essiccare innanzitutto cinque milligrammi di fosfatidilcolina da uovo o PC da uovo in un tubo di vetro non borosilicato sotto un flusso di gas argon per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, calcolare il volume del buffer sei come indicato nel protocollo testuale, quindi aggiungere direttamente il buffer sei al lipide. Sigillare il tubo di vetro con perfil e quindi vortexare il tubo per due minuti a temperatura ambiente per sospendere il lipide nel buffer.

Successivamente, sospendere il lipide a temperatura ambiente utilizzando un ago da 25 gauge collegato a una siringa da un millilitro, fino a quando non si osserva alcun film lipidico visibile sulla parete del tubo. Il tampone risulterà torbido a causa del lipide sospeso. Sottoporre il lipide nel tubo a un'ultrasonificazione mediante un'onda di 22 secondi in un bagno a ultrasuoni contenente ghiaccio, quindi posizionare il tubo sul ghiaccio per un minuto di riposo.

Eseguire questo ciclo tre volte. Successivamente, aggiungere la proteina CFTR al lipide, ottenendo un volume finale di un millilitro. Mescolare la proteina con una sospensione lipidica 10 volte utilizzando un ago da 25 gauge.

Posizionare il campione sul ghiaccio per 30 minuti, agitando il tubo cinque volte ogni cinque minuti per mescolare durante l'incubazione del campione. Rimuovere la linguetta inferiore di una colonna spin monouso per legame con detergente e centrifugare la colonna per due minuti a 2000 × g. Per rimuovere il buffer di conservazione, lavare la colonna con cinque millilitri di buffer 7 e centrifugare la colonna per quattro minuti a 2000 × g per eluire il buffer di lavaggio.

Lavare la colonna tre volte, trasferire l'intero campione proteico lipidico di un millilitro sulla sommità della resina della colonna e quindi incubare la colonna per due minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la colonna a temperatura ambiente per quattro minuti a 2000 ×g. Trasferire quindi il campione torbido di protea liposoma in una provetta microfuse pulita e posizionare la provetta sul ghiaccio. Immergere cinque grammi di perle cidex G 50 in 50 millilitri di buffer 9 per almeno due ore a temperatura ambiente.

Quindi caricare quattro piccole colonne di screening con le perle sature fino a riempirle almeno per tre quarti. Centrifugare le colonne per quattro minuti a 2000 ×g per rimuovere il tampone in eccesso dalla resina. Dopo la centrifugazione, la colonna dovrebbe contenere circa 2,25 millilitri di resina compatta.

È fondamentale che la resina sia idratata correttamente per l'eluzione con le protea liposomi. Successivamente, trasferire 125 microlitri del campione di protea liposomi sulla sommità di ciascuna colonna e centrifugare per quattro minuti a 2000 ×g. Raccogliere insieme gli EIT da utilizzare negli esperimenti di FLX con ioduro.

Posizionare un piccolo agitatore in fleece di forma F in una pozzetta di una piastra a 96 pozzette, quindi aggiungere 150 microlitri di VX seven 70 a una concentrazione di 20 micromolare nel buffer nine nella pozzetta. Utilizzare una punta da pipetta per rimuovere eventuali bolle d'aria. Successivamente, aggiungere 150 microlitri del campione di protea liposoma alla pozzetta, per un volume totale di 300 microlitri.

Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un agitatore magnetico a 130 giri al minuto. Inserire la punta dell'elettrodo sensibile allo ioduro nella soluzione senza toccare la barretta magnetica o il fondo del pozzetto. Per registrare le tracce del segnale dell'elettrodo, filtrare il segnale attraverso un filtro passa-basso con una frequenza di campionamento di due hertz e registrare le tracce dal campione per cinque minuti per consentire al campione di raggiungere l'equilibrio.

Dovrebbe produrre una linea di base stabile e quasi piatta. Aggiungere quindi tre microlitri di una soluzione madre di 100 millimolari di magnesio A TP a pH sette. Per attivare i canali CFTR, lasciare che il campione raggiunga l'equilibrio per altri cinque minuti fino a stabilire una nuova linea di base.

Successivamente, aggiungere tre microlitri di una soluzione madre di due micromolari di valinomicina per eliminare il gradiente elettrochimico generato dall'attività del CFTR. Registrare la diminuzione del voltaggio dovuta all'attività di FLX mediata da ioduro da parte del CFTR per almeno cinque minuti.

Quindi aggiungere tre microlitri di una soluzione al 10% di Triton X-100 al campione per rilasciare lo ioduro dalla cavità del protea liposoma come controllo. Un rilascio significativo di ioduro indica che lo ioduro intrappolato nelle vescicole non era limitante per l'attività del CFTR. Dopo aver misurato il campione, preparare una serie di diluizioni di ioduro di potassio da concentrazioni micromolari a nanomolari nel tampone nove.

A partire dalla soluzione più diluita, registrare la risposta dell'elettrodo in millivolt a ciascuna concentrazione di ioduro per generare una curva standard. È stato eseguito il saggio per ioduro sul CFTR di tipo selvaggio. L'attività del flusso di F è stata misurata in ano moli al secondo dopo la ricostruzione.

Il flusso di ioni ioduro è stimolato significativamente in presenza di CFTR e ATP rispetto al controllo privo di CFTR e mediante l'aggiunta di ATP. Quando CFTR viene fosforilato dalla proteina chinasi dipendente dall'AMP ciclico, una subunità catalitica nota come PKA, al contrario il pretrattamento con l'inibitore potente CFTR inhibitor-172 riduce la velocità del flusso di ioduro. L'abilità di VX-770 di potenziare il flusso di ioduro del CFTR di tipo selvaggio è stata testata in assenza e in presenza di fosforilazione da parte di PKA: VX-770 ha aumentato il flusso relativo di ioduro solo in presenza di CFTR fosforilato. L'efficacia di VX-770 è stata analizzata utilizzando una variante di CFTR chiamata DeltaF508-CFTR; l'analogato inattivo V091188 non potenzia l'attività del DeltaF508-CFTR fosforilato, mentre VX-770 aumenta il flusso relativo di ioduro. Una volta acquisita padronanza della tecnica, questa può essere completata, dalla purificazione fino alle misurazioni dell'attività di CFTR, nell'arco di una normale giornata lavorativa di otto ore; la purificazione di CFTR richiede circa quattro ore e la riconstituzione un'ulteriore ora prima dell'inizio del saggio eFlex.

Seguendo questa procedura, altri metodi, inclusi un saggio T PS e la misurazione della conduttanza di un singolo canale nel para lipidico S, possono essere eseguiti utilizzando la stessa preparazione della proteina CFDR per caratterizzare ulteriormente l'interazione con le piccole molecole. Utilizzando questi metodi, un ricercatore specializzato nella fibrosi cistica potrà affrontare domande fondamentali nel campo dei modulatori del CFTR, in particolare se un dato modulatore interagisce direttamente con la proteina CFTR e qual è il suo meccanismo d'azione.