Name: Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Scopri la ricostituzione funzionale della proteina CFTR selvatica e mutante per studiare l'attività del canale cloruro nella fibrosi cistica. Questo metodo consente di misurare gli effetti dei modulatori molecolari in tempo reale.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

<ol><li>Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+mechanisms+underlying+CFTR+channel+activity%2C+the+molecular+basis+for+cystic+fibrosis+and+strategies+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy.</a> Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).</li>
<li>Bear, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Cell. 68 (4), 809-818 (1992).</li>
<li>Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+high-resolution+single-channel+recording+to+functional+studies+of+cystic+fibrosis+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants.</a> Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).</li>
<li>Genetic Analysis Consortium. , 
 <a target="_blank" href="http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html">http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html</a> (1989).</li>
<li>Kerem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene%3A+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis.</a> Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+defective+anion+transport+in+L+cells+expressing+recombinant+forms+of+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR.</a> Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).</li>
<li>Mendoza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+efficient+correction+of+DeltaF508+CFTR+revealed+by+analyses+of+evolved+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences.</a> Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).</li>
<li>Rabeh, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+both+NBD1+energetics+and+domain+interface+is+required+to+restore+DeltaF508+CFTR+folding+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function.</a> Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).</li>
<li>Aleksandrov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulation+balances+thermodynamic+stability+and+restores+function+of+DeltaF508%5BTitle%5D)+AND+%22CFTR.+J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508.</a> CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).</li>
<li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+recombinant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+from+Chinese+hamster+ovary+and+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells.</a> J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).</li>
<li>Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).</li>
<li>Peng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+affinity+isolation+of+recombinant+protein+using+the+baculovirus%2Finsect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system.</a> Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+reconstitution+of+epithelial+chloride+channel+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).</li>
<li>Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+protein+derived+from+the+baculovirus+expression+system+using+glutathione+affinity+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose.</a> Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).</li>
<li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).</li>
<li>Alkhouri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+properties+of+molecular+probes+for+the+rescue+site+on+mutant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).</li>
<li>Eckford, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VX-809+and+Related+Corrector+Compounds+Exhibit+Secondary+Activity+Stabilizing+Active+F508del-CFTR+after+Its+Partial+Rescue+to+the+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface.</a> Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).</li>
<li>Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+corrector+modifies+the+channel+function+of+F508del-CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR.</a> Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).</li>
<li>Verkman, A. S., Galietta, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+channels+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Chloride channels as drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).</li>
<li>Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+of+a+small-molecule+modulator+with+G551D-CFTR%2C+a+cystic+fibrosis-causing+mutation+associated+with+severe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease.</a> Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).</li>
<li>Norez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+CFTR+chloride+channel+activity+and+pharmacology+using+radiotracer+flux+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods.</a> J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).</li>
<li>Whitney, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+alginate+secretion+across+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).</li>
<li>Islam, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-dependent+gating+and+proton+uptake+by+Wzx+support+O-antigen-subunit+antiport+across+the+bacterial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane.</a> mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamjeesingh%2C+M+%22Reliable+Lab+Solutions%3A+Essential+Ion+Channel+MethodsReliable+Lab+Solutions%22">Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions</a>. Conn, P. M. , Academic Press. 337-357 (2010).</li>
<li>Wellhauser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).</li>
<li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).</li>
<li>Chang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+A+%28PKA%29+still+activates+CFTR+chloride+channel+after+mutagenesis+of+all+10+PKA+consensus+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites.</a> J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).</li>
<li>Gadsby, D. C., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CFTR+Cl-+ion+channels+by+phosphorylation+and+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Second+Messenger+Phosphoprotein+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation.</a> Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).</li>
<li>Ma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinone+CFTR+inhibitor+identified+by+high-throughput+screening+blocks+cholera+toxin-induced+intestinal+fluid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion.</a> J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).</li>
<li>Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+CFTR+inhibition+by+a+thiazolidinone+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative.</a> J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).</li>
<li>Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+new+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibitor+on+Cl-+conductance+in+human+sweat+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts.</a> Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).</li>
</ol>

Gli autori riconoscono i consigli del Dr. Mohabir Ramjeesingh durante lo sviluppo dei metodi di purificazione qui descritti. Questi studi sono stati supportati da sovvenzioni di funzionamento a CEB dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e fibrosi cistica Canada (CFC). PDWE è stato sostenuto in parte da premi Fellowship attraverso il CIHR e CFC. Gli autori riconoscono la fornitura di correttore, potenziatore e inibitori composti da Dr. R. Bridges (Rosalind Università di Medicina e Scienze) e distribuzione Fibrosi Cistica Therapeutics Fondazione (CFFT). Gli autori riconoscono anche un servizio eccezionale dalla coltura cellulare strumento Baylor (NIH concessione P30 CA125123) nell&#39;esprimere Wt e proteina CFTR mutata con il sistema baculovirus. Il inattiva VX-770 analogico, V-09-1188, era un dono di Vertex Pharmaceuticals.

Ci sono stati un numero limitato di protocolli di purificazione per tutta lunghezza, isolamento CFTR funzionale, da una varietà di sistemi iperespressione cellulari. Il metodo qui descritto è vantaggioso in quanto consente una rapida purificazione di Wt-CFTR o alto arricchimento di F508del- e G551D-CFTR in quantità moderate, che è altamente funzionale in saggi, tra cui ATPasi e misure dirette di funzione del canale, tra cui le misure a canale singolo a doppio strato planare sistemi e le misure dimostrato di funzione CFT...

Trasporto di cloruro attraverso le membrane apicale delle cellule epiteliali in tali tessuti come le ghiandole polmone, intestino, pancreas e sudore è mediata principalmente dalla fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR), un ATP e membro fosforilazione regolamentato della ABC (ATP Binding Cassette) C sottofamiglia di proteine ​​di membrana (rivisto in 1). Come altri membri della sottofamiglia ABCC, CFTR è un grande, multi-spanning proteina integrale di membrana che lega l&#39;ATP a due siti di legame di nucleotidi formate all&#39;interfaccia dei suoi domini nucleotide binding (NBDS), dove possiede ATPasi modesta in un unico site. Tuttavia, a differenza di altri membri sottofamiglia ABCC, CFTR è evoluto come un canale unico regolamentato Cl, piuttosto che come un soluto transporter attiva. Le mutazioni in CFTR causa la fibrosi cistica, una malattia che colpisce diversi organi tra cui i polmoni, tratto gastrointestinale, del pancreas e del tratto riproduttivo, portando a Morbidity e mortalità nei giovani adulti. Malattia polmonare solitamente rappresenta mortalità precoce nella fibrosi cistica e nella maggior parte dei casi è causata dalla perdita di funzione di CFTR sulla superficie dell&#39;epitelio delle vie aeree di conduzione. La mancanza di CFTR canale attività cloruro provoca una riduzione sia Cl - e il movimento dell&#39;acqua attraverso l&#39;epitelio superficie per modificare lo strato di liquido sulla superficie apicale dell&#39;epitelio respiratorio ciliato. Ciò si traduce in un liquido viscoso di superficie delle vie aeree che riducono la capacità di cellule epiteliali respiratorie ciliate a patogeni efficacemente sgombrare delle vie aeree. Di conseguenza, la maggior parte dei pazienti con fibrosi cistica soffrono di attacchi ricorrenti di infezione polmonare e danni ai polmoni a causa di infiammazione. Come previsto, studi del meccanismo di azione della normale proteina CFTR è concentrata principalmente su studi elettrofisiologici modalità della sua attività gating canale. Studi di canale singolo hanno dimostrato direttamente che funziona CFTR come PKA-dipendente Cl- Canale che possiede un ATP cancello regolamentato 2. Dettagliati studi elettrofisiologici forniscono una grande quantità di informazioni sui canali CFTR singoli 1,3, ma ci possono essere preoccupazioni sul fatto che le caratteristiche di un particolare singolo canale che è stato studiato è riflettente di tutta la popolazione di canali CFTR e quindi il singolo canale risultati devono sempre essere considerati insieme con i metodi per studiare la popolazione macroscopico. Analisi diretta del canale attività popolazione di CFTR purificato ha il potenziale per fornire una conoscenza del difetto molecolare associata a mutazioni che causano malattie e per guidare la scoperta di modulatori chimici quali riparazione proteine ​​CFTR mutante. Ad oggi, ci sono in eccesso di 1.900 differenti mutazioni nel CFTR pensato per causare la fibrosi cistica 4. La mutazione importante, F508del-CFTR, che si trova in almeno un allele in circa il 90% dei pazienti in Nord America e in Europa conduce alle proteine ​​misfolding unritenzione nd nel reticolo endoplasmatico 5. F508del-CFTR ha anche altre conseguenze, tra cui l&#39;attività del canale difettoso 6-9. La risultante assenza di CFTR dalla superficie cellulare è associata con la malattia grave. G551D-CFTR, una mutazione meno comune, è pensato per essere adeguatamente ancora piegato è disfunzionale come canale del cloro sulla superficie cellulare 6. Lo sviluppo di piccole molecole correttori e potenziatori ha rispettivamente lo scopo di correggere piegatura e / o traffico di mutanti, come F508del-CFTR alla superficie cellulare, e di potenziamento o aumentando l&#39;attività del canale di mutazioni come G551D quando presenti sulla superficie cellulare, . Mentre i correttori VX-809 e VX-661 (non sono ancora approvati per l&#39;uso nei pazienti, il potenziatore Kalydeco (ivacaftor, VX-770) viene utilizzata a 150 mg ogni 12 h nei pazienti con FC&gt; 6 anni con almeno un G551D mutazione -CFTR, e più recentemente per i pazienti con uno dei G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pe G1349D. Kalydeco è sicuro e si traduce in un miglioramento delle misure cliniche della malattia CF 10, ma il meccanismo di azione di questo piccola molecola è stato poco compreso al momento della approvazione della FDA per l&#39;uso in pazienti. Una manciata di metodi di purificazione CFTR sono state descritte in precedenza 2,11-18, molti dei quali richiedono un considerevole periodo di tempo per completare. In una recente pubblicazione 19, un metodo di purificazione e ricostituzione rapida unico è stato descritto per CFTR sovraespresso in S f sistema di espressione 9 cellule, e questa proteina purificata in sistemi lipidici definiti stato usato per sviluppare un alogenuro CFTR determinazione dell&#39;attività canale per una popolazione di CFTR molecole. Il test ricapitola i noti effetti di fosforilazione, nucleotidi e gli inibitori sulla funzione CFTR. Il sistema è stato utilizzato per interrogare gli effetti del potenziatore VX-770 / Kalydeco su WT- (wild-type), e F508del- G551D-CFTR ed è stato mostrato per la primatempo che il farmaco interagisce direttamente con la proteina CFTR potenziano l&#39;attività del canale in maniera indipendente ATP, dimostrando l&#39;utilità e l&#39;applicabilità di questi metodi per lo studio dell&#39;interazione di CFTR e mutanti con nucleotidi e piccole molecole da una prospettiva popolazione rispondere alle domande clinicamente rilevanti circa la proteina. I metodi sono stati utilizzati per studiare altre molecole potenziatore e loro derivati ​​20, nonché gli effetti di una piccola molecola di correttore sull&#39;attività della proteina 21. Saggi efflusso sono stati utilizzati in molti studi precedentemente per studiare l&#39;attività di mutanti CFTR e gli effetti dei composti CFTR-modulatori sulla sua attività, compresi saggi cellulari totali utilizzando elettrodi, traccianti radioattivi e fluorofori 22,23, vescicole di membrana con elettrodi iono selettivi 24 , e purificato CFTR ricostituito con traccianti radioattivi 25. Tuttavia the l&#39;uso di elettrodi iono selettivi per studiare purificato CFTR ricostituito è stato segnalato di recente 19. Un adattamento del metodo attuale è stata utilizzata per la ricostituzione e la caratterizzazione funzionale di due proteine ​​di membrana in Pseudomonas aeruginosa, un patogeno CF comune. Ricostituzione di purificato Alge proteina della membrana esterna insieme con misure di efflusso ioduro sono stati usati per sostenere un modello per la secrezione alginato anionici attraverso questo trasportatore 26. Ricostituzione e misurazioni efflusso ioduro stati applicati alla proteina Wzx purificata, che ha permesso un modello da proporre che suggerisce un meccanismo antiport -dipendente H + per lipidi-linked oligosaccaride traslocazione attraverso la membrana interna batterica da questa proteina 27. In entrambi i casi ioduro è stato usato come un surrogato per il substrato anionico, anche se a velocità inferiore a quanto ci si potrebbe aspettare per un substrato nativo. Il metodo può essere adatto per l&#39;adattamento ad altre proteine ​​con cdi trasporto o di conduzione percorsi ationic per substrati anionici. Qui una procedura di purificazione rapida è descritto per la proteina CFTR e la sua ricostituzione in proteoliposomi di lipidi definito. La procedura di ricostituzione rapida può essere facilmente adattato per l&#39;uso con CFTR purificato con altri metodi, a condizione che il tipo di detersivo utilizzato nella purificazione è facile da eliminare con i metodi qui o può essere sostituito con un detergente adatto prima della procedura di ricostituzione. Il metodo efflusso ioduro di misurazione dell&#39;attività di proteina canale CFTR purificata e ricostituito è descritta in dettaglio e alcuni risultati tipici che possono essere ottenuti da questo metodo sono rappresentati.

<table><tbody><tr><td>fos-colina 14 detergente</td><td>Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)</td><td>F312</td><td>Affymetrix: Anatrace Products; CAS#&nbsp; :77733-28-9</td></tr><tr><td>cOmplete Compresse da cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA</td><td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td><td>04 693 132 001</td><td>Compresse da cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA (1 in 50 ml o mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Codice prodotto: 11873 580 001)</td></tr><tr><td>cOmplete ULTRA Compresse, Mini, senza EDTA, EASYpack&nbsp;</td><td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td><td>05 892 791 001</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qaigen GmbH</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Colonne di screening</td><td>Fisher Healthcare</td><td>11-387-50</td><td></td></tr><tr><td>Filtri ultra centrifughi Amicon, Ultracel-100K</td><td>Millipore (www.millipore.com)</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>proteina chinasi A cAMP-dipendente (PKA), subunità</td> <td>cataliticaNew England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)</td><td></td><td>Peirce PKA è adatto anche</td></tr><tr><td>PC, Uovo di gallina</td><td>Avanti Lipidi polari (www.avantilipids.com)</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Lipidi polari (www.avantilipids.com)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>PS, Cervello suino</td><td>Avanti Lipidi polari (www.avantilipids.com)</td><td>840032C</td><td>Il CFTR è stato ricostituito con successo in Egg PC, POPC, 2:1 (p/p) Uovo PC:POPC, o una miscela di PE:PS:PC:ergosterolo, 5:2:2:1 (p/p)</td></tr><tr><td>PE, Uovo di gallina</td><td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td><td>841118C</td><td></td></tr><tr><td>Ergosterol</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>45480</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Colonna rotante per la rimozione del detersivo</td><td>Thermo Scientific</td><td>87779</td><td>Colonne da 1 ml di capacità</td></tr><tr><td>valinomicina</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>V-0627</td><td></td></tr><tr><td>VX-770 (ivacaftor)</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1144</td><td></td></tr><tr><td>microelettrodo selettivo per ioduro</td><td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)</td><td>LIS-146ICM</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Software Clampex 8.1</td><td>Axon Instruments (www.axon.com)</td><td></td><td>utilizziamo componenti del sistema ClampX con un filtro fatto in casa per monitorare e registrare la risposta al nostro elettrodo</td></tr><tr><td>Software alternativo: ArrowLabb System&nbsp;</td><td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)</td><td>LIS-146LICM-XS</td><td>Lazar Research vende un misuratore in grado di interfacciarsi con un computer e un software per registrare la risposta della sonda. Questo software dovrebbe svolgere una funzione simile alla nostra configurazione.</td></tr><tr><td>piccole ancorette</td><td>Big Science Inc (www.stirbars.com)</td><td>SBM-0502-CMB</td><td>scegli un'ancoretta abbastanza piccola da inserirsi facilmente in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Sephadex G50, fine</td><td>GE Health Care (www.gelifesciences.com)</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Laboratory Supplies Co, Inc.</td><td>G112SP1G</td><td>Anche i sonicatori da bagno di altri produttori dovrebbero essere adatti</td></tr></tbody></table>

ricostituzione funzionale e attività canale misure di purificata di tipo selvatico e mutante cftr proteine

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

La fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR) è un membro di canali che formano unico della ATP Binding Cassette (ABC) superfamiglia dei trasportatori. L&#39;attività del canale fosforilazione e nucleotide cloruro di dipendenti di CFTR è stato spesso studiato in sistemi cellulari interi e come singoli canali in patch di membrana escisse. Molte mutazioni-fibrosi cistica provocando hanno dimostrato di alterare questa attività. Mentre un piccolo numero di protocolli di purificazione sono stati pubblicati, un metodo ricostituzione veloce che mantiene l&#39;attività del canale e un metodo adatto per studiare l&#39;attività del canale popolazione in un sistema purificato sono stati carenti. Qui metodi rapidi sono descritti per la purificazione e la ricostituzione funzionale della proteina CFTR full-length in proteoliposomi di definita composizione lipidica che mantiene l&#39;attività come canale alogenuro regolamentato. Questo metodo ricostituzione con un nuovo saggio basato flux-dell&#39;attività del canale è un sistema adatto perlo studio delle proprietà del canale popolazione di selvatici tipo CFTR e causano malattie mutanti F508del- e G551D-CFTR. In particolare, il metodo ha utility a studiare gli effetti diretti di fosforilazione, nucleotidi e piccole molecole quali potenziatori e gli inibitori sull&#39;attività del canale CFTR. I metodi sono anche suscettibili di studio di altri canali di membrana / trasportatori per substrati anionici.

Descritto in questa pubblicazione scritta sono metodi per purificare, ricostituire e misurare l&#39;attività dei canali regolamentata della proteina CFTR. Figura 1a mostra il flusso di lavoro per la purificazione, la ricostituzione e le procedure di efflusso ioduro. Metodi per la ricostituzione e l&#39;attività dei canali misure di flusso ioduro sono anche indicati in dettaglio nel video associato. Purificazione e ricostituzione di CFTR in proteoliposomi <p class="jove_c...

Descritto qui è una procedura rapida ed efficace per la ricostituzione funzionale di purificato wild-type e proteina CFTR mutata che preserva l&#39;attività per questo canale del cloro, che è difettoso in fibrosi cistica. Efflusso ioduro da proteoliposomi ricostituiti mediati da CFTR permette studi di attività di canale e gli effetti di piccole molecole.

Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la funzione di una popolazione di canali CFTR in un sistema ricostruito ed esaminare la risposta dei canali alla presenza di molecole modulatrici. Questo viene ottenuto innanzitutto purificando la proteina CFTR di tipo selvaggio o mutante da cellule SF nine mediante una procedura rapida di purificazione, che fornisce proteina CFTR funzionale in soluzione di detergente. Il secondo passaggio consiste nel reconstituire la proteina purificata in proteoliposomi con un lipide definito, scelto dall'operatore.Successivamente, viene generato un gradiente chimico di ioduro attraverso la membrana rimuovendo l'ioduro in eccesso presente nei liposomi, creando così una forza motrice per il movimento degli ioni attraverso il canale CFTR. L'ultimo passaggio consiste nell'attivare il canale e avviare il rilascio di ioduro dai liposomi proteici in presenza della molecola modulatrice di interesse. Infine, un elettrodo selettivo per l'ioduro viene utilizzato per monitorare in tempo reale la funzione del canale CFTR in questo sistema ricostruito.Questo metodo permette lo studio dell'attività del canale del cloruro in una popolazione purificata di mole

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Dimostreremo come studiare l'effetto di una singola mutazione puntiforme sulla funzione di un canale ionico.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

I tentativi di esprimere la fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR)...

Espressione e purificazione della proteina transmembrana cistica regolatore fibrosi conduttanza in Saccharomyces cerevisiae

Transmembrana della fibrosi cistica regolatore conduttanza (CFTR), un canale cloruro epiteliale, è stata riportata per interagire con varie proteine ​​e regolano importanti processi cellulari, tra i quali i CFTR PDZ motivo mediate da interazioni sono stati ben documentati. Questo protocollo descrive i metodi che abbiamo sviluppato per assemblare un PDZ-dipendente macromolecolare CFTR segnalazione...

L&#39;analisi in vitro dei complessi CFTR PDZ-dipendenti macromolecolari di segnalazione

Procedure per la ricostituzione completa di un canale del potassio voltaggio-dipendenti prototipo nelle membrane lipidiche sono descritti. I canali ricostituiti sono adatti per saggi biochimici, registrazioni elettriche, screening ligando e studi cristallografici di elettroni. Questi metodi possono avere applicazioni generali agli studi strutturali e funzionali di altre proteine ​​di membrana.

La ricostituzione di un canale Kv in membrane lipidiche per gli studi strutturali e funzionali

Espressione eterologa e purificazione del regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) sono sfide importanti e fattori limitanti per lo sviluppo di terapie farmacologiche per la fibrosi cistica. Questo protocollo descrive due metodi per l'isolamento di quantitativi milligrammo di CFTR adatti per studi funzionali e strutturali.

Purificazione della fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana proteina espressa in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

aritmie cardiache ereditarie sono spesso causate da mutazioni che alterano la consegna di superficie di uno o più canali ionici. Qui, ci adattiamo citometria a flusso saggi di fornire una quantificazione della espressione proteica totale e superficie cellulare relativa dei canali ionici ricombinanti espressi in TSA-201 cellule.

Determinazione del relativo cellulari di superficie e di espressione totale di canali ionici ricombinante in citometria a flusso

Questo articolo descrive metodi specifici per ottenere biochimico quantità di detersivo-solubilizzato TRPV1 per analisi spettroscopica. I protocolli combinati forniscono strumenti biochimici e biofisici che possono essere adattati per facilitare studi strutturali e funzionali per canali ionici dei mammiferi in un ambiente controllato di membrana.

Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

Questo protocollo presenta un metodo per misurare il legame dei nucleotidi adenina ai recettori in tempo reale in un ambiente cellulare. Il legame è misurato come trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) tra derivati del nucleotide trinitrofenile e proteine marcate con un amminoacido fluorescente non canonico.

Misurare il legame nucleotidico a proteine di membrana intatte e funzionali in tempo reale

Questo protocollo descrive un metodo per lo studio delle proteine di membrana elettrogeniche misurando le variazioni del potenziale di membrana. Questo test fornisce una piattaforma per la lettura funzionale di più canali ionici espressi endogenamente in linee cellulari epiteliali.

Un saggio basato sulla fluorescenza del potenziale di membrana per lo studio funzionale ad alta produttività di due canali ionici endogeni in due linee cellulari epiteliali

La fluorometria funzionale sito-diretta è un metodo per studiare i movimenti del dominio proteico in tempo reale. La modifica di questa tecnica per la sua applicazione nelle cellule native consente ora il rilevamento e il tracciamento dei movimenti di singoli sensori di tensione dai canali Ca2+ voltaggio-dipendenti nelle fibre muscolari scheletriche isolate murine.

Fluorometria funzionale sito-diretta in cellule native per studiare l'eccitabilità del muscolo scheletrico

L'elettrofisiologia è il gold standard per lo studio dell'attività dei canali ionici. Tuttavia, ci sono molti approcci alternativi, compresi i metodi ottici. Qui, descriviamo un metodo per monitorare l'attività della ripetizione ricca di leucina contenente canali anionici formati a 8 canali (LRRC8) utilizzando un metodo basato sul trasferimento di energia della risonanza di Förster (FRET) inter-subunità.

Monitoraggio dell'attività di ripetizione ricca di leucina contenente 8 canali (LRRC8/VRAC) utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di Förster a emissione sensibilizzata (SE-FRET)

Scopri la ricostituzione funzionale della proteina CFTR selvatica e mutante per studiare l'attività del canale cloruro nella fibrosi cistica. Questo metodo consente di misurare gli effetti dei modulatori molecolari in tempo reale.

Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

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