Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di misurare la funzione di una popolazione di canali CFTR in un sistema ricostituito e di esaminare la risposta dei canali alla presenza di molecole modulatrici. Ciò si ottiene purificando prima la proteina CFTR wild type o mutante da nove cellule SF utilizzando una procedura di purificazione rapida, che produce la proteina CFTR funzionale in soluzione detergente. Il secondo passo consiste nel ricostituire la proteina purificata in liposomi di protea di lipidi definiti come selezionato dallo sperimentatore.

Successivamente, un gradiente chimico di ioduro viene sviluppato attraverso la membrana rimuovendo lo ioduro extra liposomiale per generare una forza trainante per il movimento ionico attraverso il canale CFTR. Il passaggio finale consiste nell'attivare il canale e avviare il rilascio di ioduro dai liposomi della protea in presenza della molecola modulatrice di interesse. Infine, un elettrodo selettivo allo ioduro viene utilizzato per monitorare la funzione del canale CFTR in tempo reale in questo sistema ricostituito.

Questo metodo consente di studiare l'attività del canale del cloro di una popolazione purificata di molecole di CFTR dopo la ricostituzione in liposomi fosfolipidici. Sebbene questo metodo sia stato deciso per fornire informazioni sulla funzione dei nove canali C-F-D-R-N e sull'effetto dei modulatori di piccole molecole, questo metodo può essere applicato anche su altri sistemi come la caratterizzazione funzionale di altre proteine di membrana. Per avere successo, gli individui nuovi a questo metodo devono assicurarsi di aver ottimizzato i rapporti tra proteine e lipidi per il loro sistema, di non lavorare con proteine scarsamente funzionali o non funzionali e di aver generato un gradiente di ioduro sufficiente attraverso vescicole ben sigillate.

Per preparare il lipide, asciugare prima cinque milligrammi di fosfatidilcolina d'uovo o PC d'uovo in un tubo di vetro di silicato non boro sotto un flusso di gas argon per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, calcola il volume del tampone sei necessario come indicato nel protocollo di testo, quindi aggiungi il tampone sei direttamente al lipide. Sigillare il tubo di vetro con perfil e poi agitare il tubo per due minuti a temperatura ambiente per sospendere il lipide nel tampone.

Quindi, sospendere il lipide a temperatura ambiente con un ago da 25 gauge collegato a una siringa da un millilitro fino a quando non vi è alcun film lipidico visibile sul lato del tubo. Il tampone sarà torbido a causa del lipide sospeso. Sonicare il lipide nel tubo per un 22° getto in un bagno, sonicare contenente ghiaccio, quindi posizionare il tubo sul ghiaccio a riposare per un minuto.

Eseguire questo ciclo tre volte. Successivamente, aggiungi la proteina CFTR al lipide, ottenendo un volume finale di un millilitro. Mescolare la proteina con una sospensione lipidica 10 volte con un ago calibro 25.

Posizionare il campione sul ghiaccio per 30 minuti, facendo roteare la provetta cinque volte ogni cinque minuti per mescolarla durante l'incubazione del campione. Rompere la linguetta inferiore di una colonna di centrifuga per legare il detersivo monouso e centrifugare la colonna per due minuti a 2000 volte G.To rimuovere il tampone di stoccaggio, lavare la colonna con cinque millilitri di tampone sette e centrifugare la colonna per quattro minuti a 2000 volte. G per eluire il tampone di lavaggio.

Lavare la colonna tre volte, trasferire l'intero campione di lipidi proteici da un millilitro sulla parte superiore della resina della colonna, quindi incubare la colonna per due minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la colonna a temperatura ambiente per quattro minuti a 2000 volte G.Quindi trasferire il campione di liposoma di protea torbida in una provetta con microfusibile pulita e posizionare la provetta sul ghiaccio. Immergere cinque grammi di perline cidex G 50 in 50 millilitri di tampone nove per almeno due ore a temperatura ambiente.

Quindi caricare quattro piccole colonne di vagliatura con le perle sature fino a quando non sono piene almeno per tre quarti. Centrifugare le colonne per quattro minuti a 2000 volte G per rimuovere il tampone in eccesso dalla resina. Circa 2,25 millilitri di resina impaccata dovrebbero essere nella colonna dopo la centrifugazione.

È fondamentale che la resina sia adeguatamente idratata per l'eluizione con i liposomi di protea. Quindi, trasferire 125 microlitri del campione di liposoma di protea nella parte superiore di ciascuna colonna e centrifugare per quattro minuti a 2000 volte. G Raggruppare gli EIT per l'uso negli esperimenti FLX sullo ioduro.

Posizionare una piccola ancoretta in pile F in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, quindi aggiungere 150 microlitri di VX seven 70 a una concentrazione di 20 micromolari nel tampone nove al pozzetto. Utilizzare una punta per pipetta per rimuovere eventuali bolle. Quindi aggiungere 150 microlitri del campione di liposoma di protea al pozzetto per un volume totale di 300 microlitri.

Posizionare la piastra a 96 pozzetti su una piastra di agitazione a 130 giri al minuto. Inserire la punta dell'elettrodo sensibile allo ioduro nella soluzione senza toccare l'ancoretta o il fondo del pozzetto. Per registrare i tracciati del segnale dell'elettrodo, filtrare il segnale attraverso un filtro passa-basso con una frequenza di campionamento di due hertz e registrare i tracciati dal campione per cinque minuti per consentire al campione di equilibrarsi.

Dovrebbe produrre una linea di base stabile, quasi piatta. Quindi aggiungere tre microlitri di una soluzione madre da 100 millimolari di magnesio A TP a pH sette. Per attivare i canali CFTR, lasciare che il campione si equilibri per altri cinque minuti per raggiungere una nuova linea di base.

Quindi, aggiungere tre microlitri di una soluzione madre a due micromolari. Una micina valinica per eliminare il gradiente elettrochimico generato dall'attività del CFTR. Registrare la diminuzione della tensione dovuta all'attività FLX mediata dallo ioduro CFTR per almeno cinque minuti.

Quindi aggiungere tre microlitri di una soluzione di Triton X 100% al campione per rilasciare lo ioduro dal lume del liposoma della protea come controllo. Un rilascio significativo di ioduro indica che lo ioduro intrappolato nelle vescicole non limitava l'attività del CFTR. Dopo aver misurato il campione, eseguire una serie di diluizioni di ioduro di potassio dalle concentrazioni micromolari a quelle nanomolari nel tampone nove.

Partendo dalla soluzione più diluita, registrare la risposta dell'elettrodo in millivolt a ciascuna concentrazione di ioduro per generare una curva standard. Il CFTR wild type è stato dosato per lo ioduro. Attività di flusso F misurata in anomoli al secondo dopo la ricostituzione.

Il flusso F di ioduro è stimolato in modo significativo in presenza di CFTR e A TP rispetto al controllo privo di CFTR e dall'aggiunta di un TP. Quando CFTR è fosforilato dalla proteina chinasi ciclica A MP dipendente. Una subunità catalitica nota come PKA, al contrario, il pretrattamento con il potente inibitore CFTR inibitore 1 72 riduce il tasso di iodio FLX, la capacità di VX 70 di potenziare il flusso di ioduro F di CFTR wild type, è stata testata senza e con fosforilazione da parte di PKA VX 70 ha aumentato lo ioduro relativo FLX solo in presenza di CFTR fosforilato. L'efficace VX seven 70 è stato dosato utilizzando una variante di CFTR chiamata Delta 5 0 8 CFTR e l'analogo inattivo V 0 9 11 88 non potenzia l'attività del delta fosforilato 5 0 8 CFTR mentre VX seven 70 aumenta il flx di ioduro relativo Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata dalla purificazione attraverso le misurazioni dell'attività CFTR in una tipica giornata lavorativa di otto ore, la purificazione del CFTR richiede circa quattro ore e la ricostituzione richiede un'altra ora prima dell'inizio del test eFlex.

Seguendo questa procedura, altri metodi, tra cui un saggio T PS e il singolo canale conducono una misurazione nel para lipide S, possono essere eseguiti utilizzando la stessa preparazione della proteina CFDR per caratterizzare ulteriormente l'interazione con le piccole molecole. Utilizzando questi metodi, un ricercatore di fibrosi cistica sarà in grado di affrontare domande chiave nel campo del modulatore CFTR, vale a dire, se quel modulatore interagisce direttamente con la proteina CFTR e anche qual è il meccanismo d'azione di quel modulatore.