Name: Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Scopri l'imaging a due fotoni di cellule neurali precursore nel midollo spinale del mouse. Questo metodo permette di osservare in tempo reale le interazioni cellulari per studiare i meccanismi di riparazione del sistema nervoso.

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Questo lavoro è stato supportato in parte dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) R01 GM-41514 (a M.D.C.), R39 GM-048071 (a I.P.) e R01 NS-074987 (a T.E.L.) e dal National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (a C.M.W., T.E.L. e M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (a M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (a J.G.W.), e finanziamento dalla George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).

NOTA: Etica Dichiarazione: Il protocollo per la gestione degli animali è stato approvato dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) della University of California, Irvine, il protocollo # 2010-2943. 1. Rimozione del midollo spinale <ol><li> Posizionare asciugamani di carta bagnati con ~ 100% di liquido isoflurano, USP di eutanasia da camera e mettere gli asciugamani di carta a secco in cima. Posizionare il mouse nella camera in cima ai tovaglioli di carta a secco in modo da mouse non sia a contatto con l&#39;isoflurano e assicurarsi che la camera è coperto. Attendere almeno un minuto dopo la cessazione della respirazione per garantire che il mouse è eutanasia. </li><li> Eseguire una sezione spinale del collo per assicurare il mouse è eutanasia. Non eseguire una dislocazione cervicale in quanto ciò potrebbe danneggiare il midollo spinale. </li><li> Spruzzare il mouse con etanolo al 70% per bagnare i capelli. </li><li> Utilizzare forbici Belle taglienti per rimuovere i capelli e la pelle dalla parte posteriore del mouse per esporre la colonna vertebrale cervicale lamina da circa 1 (C1) A lamina sacrale 4 (S4). </li><li> Usando un bisturi con lama # 10, fare incisioni a sinistra ea destra della colonna vertebrale per separarlo dal muscolo e grasso. Questo renderà la rimozione del midollo spinale molto più facile. </li><li> optional: a curve rongeurs Luer possono essere utilizzati per scavare via la carne supplementare. </li><li> Tenendo la parte superiore delle vertebre spinali con seghettati pinze Graefe, inserto in titanio curva Vännäs forbici con il lato curvo in alto nella colonna vertebrale esposta a C1, facendo attenzione a non toccare il midollo spinale. </li><li> Far scorrere il titanio curva forbici Vännäs tutta la strada a destra e fare un piccolo taglio. Un piccolo suono crunch deve essere ascoltato e sentito come le forbici tagliano le vertebre. Ripetere questo taglio sul lato più a sinistra del cavo. Fare attenzione a non andare troppo in fretta o fare troppo grande di un taglio come questo rischiare di danneggiare il cavo con le forbici. </li><li> Il singolo lamina deve poter essere sollevato con la pinza una volta che i lati delle vertebre sono tagliate. REPEAT questo passaggio per ogni lamina fino S4, continuando a tenere e tirare indietro le vertebre del midollo spinale. NOTA: le vertebre di sopra del sito di trapianto probabilmente verrà fuori una volta che è tagliato al sito di trapianto. Continuare la procedura di avviamento appena sotto il sito di trapianto. </li><li> optional: gettare le vertebre verso il basso per vedere dove il sito di trapianto è e misura e tagliare ~ 20 millimetri rostrale e caudale al sito di trapianto. NOTA: Quando si trapiantano NPC più non saranno necessari come gli NPC trapiantati in genere non migrano più lontano di 15 mm. La quantità di midollo spinale necessaria dipenderà esperimento e migrazione caratteristiche del tipo di cellula trapiantato. Effettuare tagli rostrale e caudale equidistanti al sito di trapianto consentirà al sito di trapianto di essere poste più facilmente durante l&#39;imaging. </li><li> Usando un bisturi con lama # 11 tagliare accuratamente i gangli a destra e sinistra del lato ventrale del midollo spinale a partire dalla fine rostrale. Questo will consentire il midollo spinale per essere rimosso dalle vertebre ventrale più facilmente. NOTA: Fatto rapidamente (passaggi 1,7-1,11), il midollo spinale non si asciugherà. Tuttavia, 1x PBS può essere somministrato al cavo per mantenerlo umido. </li><li> Capovolgere il mouse e tenere premuto il mouse verso l&#39;alto in modo che il midollo spinale è rivolto verso il basso. Sbucciare cautela il midollo spinale con pinze Graefe seghettate chiusi. Senza intaccare il midollo spinale, tagliare accuratamente ogni gangli rimanenti per consentire al midollo spinale da sollevare in un unico pezzo integro. </li><li> Assicurarsi che il midollo spinale è in RPMI-1640 e posizionarlo sul ghiaccio per il trasporto al microscopio 2P. </li></ol> 2. Preparazione di Spinal Cord for Imaging <ol><li> Incorporare midollo spinale in agarosio <ol><li> Tenere il midollo spinale isolato in refrigerate RPMI-1640 sul ghiaccio prima di imaging. </li><li> Pesare agarosio (bassa temperatura di gelificazione) e preparare una soluzione al 5% in 5 ml di PBS 1x. Microonde la soluzione di agarosio 5% per 15 secondi per sciogliere la agnata e lasciar raffreddare la soluzione a 37 ° C. </li><li> Preparare il midollo spinale appoggiandolo su un foglio di Parafilm con il lato ventrale rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Pipettare circa 5 ml di soluzione di agarosio 5% sopra il lato ventrale del midollo spinale. Sia l&#39;agarosio solidificare per raffreddamento a temperatura ambiente. Solidificazione completa richiede circa 5 minuti. </li><li> Applicare un leggero strato di adesivo di tessuto per una copertura di slittamento piazza 22 millimetri. </li><li> Invertire il midollo spinale incorporato, posizionando il lato ventrale su parafilm. Il lato dorsale sarà ora rivolta verso l&#39;alto. Rispettare la polizza di copertura sul lato dorsale, e immergere l&#39;agarosio incorporato midollo spinale / copertura preparazione slittamento in RMPI per solidificare l&#39;adesivo. Rimuovere l&#39;eccesso solidificato agarosio con una lama di rasoio. </li></ol></li><li> Montaggio del midollo spinale sul palco microscopio <ol><li> Applicare vaselina sul fondo del vetrino. Questo stabilizzerà la preparazione durante la perfusione. </li><li> Posizionare la preparazione del midollo spinale in unl&#39;imaging bene sul palco microscopio con il lato ventrale rivolto verso l&#39;alto verso l&#39;obiettivo immersione 25X. Il pozzo di imaging costruito su misura è di circa 20 mm di profondità, 50 mm di lunghezza, e 50 mm di diametro. </li><li> Immagine mentre superfusing la preparazione con riscaldato (37 ° C), ossigenato (95: 5 ossigeno: anidride carbonica-CarboGen) medium RPMI-1640 senza siero. <ol><li> Supporti Pre-calda a 37 ° C nel bagnomaria e collegarlo alla pompa tubo inserendo il tubo nella bottiglia media. </li><li> Mantenere la temperatura del fluido a 37 ° C un dispositivo riscaldatore al collegamento del tubo alla camera. Mezzi Superfuse attraverso bene a 3 ml / min usando tubo collegato alla pompa tubo (Figura 1B). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 2P Imaging di ventrale del midollo spinale <ol><li> Setup Microscopio <ol><li> Acquisire le immagini da Thy1-EYFP midollo spinale con un Ultra Ti Chameleon: laser Sapphire sintonizzati a 900 nm. Attenuare potenza del laser inesemplare a &lt;5% per garantire la fototossicità minimo 16. Mantenere la temperatura mediante perfusione di ossigeno-perfuso RPMI-1640 ad una costante di 37 ° C utilizzando un unico riscaldatore soluzione di linea di garantire immagini stabili, e da evitare la dispersione dei tessuti e danno cellulare. </li><li> Per separare segnale fluorescente eGFP e EYFP, posizionare una 520 nm dicroico singolo-edge e un nm singolo bordo beam splitter dicroico 560 in serie per separare 2P emissione in tre canali, volutamente dividendo l&#39;emissione verde per migliorare la visibilità. NOTA: Questi canali sono indicati come blu-verde (emissione &lt;520 nm), verde-giallo (520-560 nm), e il rosso (emissione&gt; 560 nm). Tubi fotomoltiplicatori rilevano emessi luce in ogni canale. </li></ol></li><li> Aree di imaging di posizionamento di interesse <ol><li> Utilizzando l&#39;oculare e una fonte di luce campo chiaro, mettere a fuoco l&#39;obiettivo di immersione a bordo ventrale del midollo spinale per impostare un punto di riferimento. </li><li> Assicurarsi fonte di luce ambiente è sicuro spento e swprurito a 2P eccitazione aprendo l&#39;otturatore laser. </li><li> Se disponibile, durante la ricerca dei tessuti per le aree di interesse, di utilizzare un valore inferiore di risoluzione, un volume più alto senza zoom digitale, e velocità di scansione più elevata rispetto a quando l&#39;acquisizione di immagini finali. Le impostazioni tipiche con questo sistema durante la ricerca dei tessuti per una regione di interesse sono: Risoluzione: 256 pixels; Volume: x = 600 micron, y = 600 micron, z = 0-300 micron. </li><li> Osservare gli assoni EYFP vicino al bordo ventrale del midollo spinale. Secondo segnale armonico da collagene (blu) sarà più luminoso sul bordo del tessuto del midollo spinale. Individuare gli assoni EYFP solo dorsale per il secondo segnale armonica dal collagene e il segnale EYFP viene visualizzati nel canale verde-giallo. </li><li> Individuare il sito di trapianto nel centro longitudinale della preparazione del midollo spinale 14. Per i topi 1 giorno dopo eGFP-NPC trapianto, individuare il sito di trapianto puntando il percorso del fascio nel piano z in profondità nei tessuti. Il sito trapianto will variare leggermente tra gli animali, ma è generalmente trova ~ 200 micron dal bordo ventrale. Osservare i gruppi di eGFP-NPC nei tratti di sostanza bianca, più vicino ai bordi ventrali e laterali nei topi dopo giorno 1 post-trapianto. </li></ol></li><li> Acquisizione immagini finali <ol><li> Acquisire risoluzione di 512 pixel; Volume: x = 270 micron, y = 212 micron, e z = 100 micron utilizzando il software Slidebook 6. Compilare z-stack con l&#39;acquisizione di piani focali sequenziali in incrementi di 2,5 micron. </li><li> Eseguire una scansione bidirezionale con adeguata compensazione per garantire una rapida quantificazione di tutti gli oggetti che migrano nel midollo spinale interlacciato. Assicurarsi che il frame rate di acquisizione ideale per determinare la velocità cellulari all&#39;interno del midollo spinale è di circa 1 frame / sec. NOTA: le impostazioni di imaging possono essere modificate per le preferenze dei singoli utenti, quali frame rate di acquisizione, la risoluzione delle immagini e dei volumi di imaging. Volumi di imaging più grandi in genere più tempo per acquisire a un GIVRisoluzione en. </li><li> Analizzare, colture, liscio, e PseudoColor file immagine Slidebook con il software di analisi di immagine, come Bitplane Imaris 7.7. Produrre video finali time-lapse da pettinatura volumi di imaging consecutivi utilizzando un processo automatizzato in Slidebook e Imaris. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi concorrenti.

In tempo reale 2P imaging tessuto intatto è necessario per indagare cinetica NPC e interazioni seguenti trapianto nel topo demyelinated midollo spinale. L&#39;imaging intravitale 2P è comunemente usato per determinare le dinamiche cellulari sul lato dorsale del midollo spinale nei topi viventi, ed è stato utilizzato per studiare demielinizzazione dorsale in malattia demielinizzante 17-19. Tuttavia, poiché NPC trapiantate migrano alla materia bianca ventrale, che si trova troppo in profondità all&#39;immagine ...

Modelli murini di demielinizzazione, tra cui l&#39;encefalomielite sperimentale autoimmune (EAE) e l&#39;infezione intracranica con neuroadapted mouse virus dell&#39;epatite (MHV), sono ottimi strumenti per studiare percorsi molecolari e interazioni cellulari associati con la malattia. Essi hanno portato e sostenuto l&#39;efficacia della FDA ha approvato terapie farmacologiche, rivolti principalmente la cessazione di autoimmunità e infiammazione 1. Tuttavia, una volta che la rimielinizzazione endogena ha fallito, le terapie attualmente approvate non riparano efficacemente lesioni demielinizzati nel sistema nervoso centrale. Pertanto, le terapie di riparazione focalizzato in questa fase della malattia sono fondamentali per la riduzione dei sintomi cronici e il miglioramento della qualità della vita. Recentemente, le cellule precursori neurali (NPC) sono venuti alla ribalta come un potenziale rigenerativo modalità terapeutica per aree di infiammazione e demielinizzazione bersaglio. Diversi studi hanno evidenziato la capacità di NPC di indurre endogenonoi rimielinizzazione e partecipare direttamente rimielinizzazione 2-8. Perché NPC sono coinvolti in rimielinizzazione diretta, è fondamentale per capire le loro cinetiche e le interazioni con le cellule endogene successivi al trapianto. Dopo il trapianto, NPC migrano ventralmente ad aree di danno sostanza bianca, poi rostralmente e caudalmente relativi al sito di trapianto 5,9. La cinetica della migrazione differiscono in risposta a stimoli ambientali; NPC trapiantati in un midollo spinale danneggiato non hanno velocità maggiori rispetto NPC trapiantate in un midollo spinale danneggiato 6. Dopo un periodo migratorio, trasferiti NPC proliferano ampiamente, ad un tasso più elevato in un cavo danneggiato rispetto spinale per un midollo spinale intatto 6. Infine, la maggior parte degli NPC differenziarsi in oligodendrociti e avviare 4,6,9 rimielinizzazione diretta. La lesione demyelinated è complesso e può includere una popolazione eterogenea di cellule in diverse fasi di unctivation. Ad esempio, un sclerosi multipla (MS) lesione attiva può includere una frazione significativa di cellule T attivate, microglia e dei macrofagi M1 M1, ma un MS lesione cronica silente può essere costituito principalmente da astrociti reattivi con poche cellule infiammatorie 10-13. A causa della diversità delle cellule effettrici, a due fotoni (2P) per immagini in modelli murini di demielinizzazione è uno strumento estremamente utile per aiutare a capire le interazioni cellulari locali all&#39;interno della lesione. In MS e molti modelli di ricerca MS ampiamente utilizzati, la maggior parte delle lesioni si trovano sul lato ventrale del midollo spinale, una regione inaccessibile per l&#39;imaging intravitale 2P grazie alla profondità della lesione e l&#39;alto contenuto lipidico del midollo spinale. Per aggirare questi problemi e interazioni studio cellula-cellula all&#39;interno lesioni lungo il midollo spinale ventrale abbiamo sviluppato un semplice vivo 2P preparazione di imaging 6 ex. Questo studio fa seguito ad una precedente pubblicazione metodi, che ha mostratola procedura per il trapianto di proteine ​​maggiore fluorescente verde (eGFP) NPC esprimente nel midollo spinale dei topi dopo JHMV ceppo di demielinizzazione MHV-indotta 14. Cinque settimane di età i topi sono infettati con JHMV e trapiantati con eGFP-NPC a livello toracico 9 al giorno 14 dopo l&#39;infezione. Il protocollo presentato qui fornisce la procedura dettagliata su come estrarre il midollo spinale, fare un ex vivo agarosio preparazione, e di immagine trapiantato interazioni eGFP-NPC con proteine ​​maggiore giallo fluorescente (EYFP) assoni esprimente. Mice esprimenti EYFP sotto il promotore Thy1 specifico-neuronale sono stati utilizzati in questa procedura 15. Solo alcuni degli assoni esprimono EYFP, rendendolo utile per l&#39;imaging singoli assoni. Qui vi mostriamo midollo spinale rimossi a 7 giorni dopo il trapianto; tuttavia, midollo spinale possono essere estratti in qualsiasi punto nel tempo dopo il trapianto. Mentre noi mostriamo interazioni di NPC con assoni danneggiati, il nostro protocollo può essere utilizzato in combinazione con marcatori fluorescenti geneticidi altri tipi di cellule per indagare una moltitudine di interazioni cellulari che si verificano durante il mouse midollo spinale.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Piramal Critical Care, Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td> lama <td>affilata</td></tr><tr><td>per bisturi #10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>manico per bisturi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Luer rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Graefe pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15615-08</td><td></td></tr><tr><td>lama per bisturi #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>12-115F</td><td></td></tr><tr><td>agarosio, bassa temperatura di gelificazione</td><td>Sigma</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond (adesivo tissutale)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>22 mm quadrato vetrino coprioggetto</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td></td></tr><tr><td>25X, 1.1 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore per soluzione in linea singola</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>520 nm dicroico dicroico a bordo singolo</td><td>Semrock</td><td>FF520-Di02-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>560 nm dicroico dicroico a bordo singolo</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Brightline fotomoltiplicatore</td><td>tubi Hamamatsu</td><td>R928</td><td></td></tr><tr><td>C/L pompa per tubi a velocità variabile</td><td>Masterflex</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>termometro digitale</td><td>Comar Instruments</td><td>3501</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser&nbsp;</td><td>Coherent</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6 software</td><td>3i</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 7.7 software</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

due fotoni imaging di cellular dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

La microscopia a due fotoni (2P) viene utilizzata per rivelare le dinamiche e le interazioni cellulari in profondità all'interno di tessuti viventi intatti. Qui, presentiamo un metodo per l'imaging di cellule vive nel midollo spinale murino. Questa tecnica è particolarmente adatta per analizzare le dinamiche delle cellule precursori neurali (NPC) dopo il trapianto nel midollo spinale sottoposte a disturbi demielinizzanti neuroinfiammatori. Le NPC migrano verso i siti di danno assonale, proliferano, si differenziano in oligodendrociti e partecipano alla rimielinizzazione diretta. Le NPC sono quindi un trattamento terapeutico promettente per migliorare le malattie demielinizzanti croniche. Poiché le NPC trapiantate migrano verso le aree danneggiate sul lato ventrale del midollo spinale, l'imaging 2P intravitale tradizionale è impossibile e in precedenza erano disponibili solo informazioni sulle interazioni statiche utilizzando approcci di colorazione istochimica. Sebbene questo metodo sia stato generato per visualizzare le NPC trapiantate nel midollo spinale ventrale, può essere applicato a numerosi studi su cellule trapiantate ed endogene in tutto il midollo spinale. In questo articolo, dimostriamo la preparazione e l'imaging di un midollo spinale con assoni che esprimono proteine fluorescenti gialle potenziate e NPC trapiantate che esprimono proteine fluorescenti verdi potenziate.

<html> Mentre il protocollo di imaging midollo spinale espiantato può essere utilizzato per visualizzare alcuna fluorescenza all&#39;interno del midollo spinale, i nostri risultati dimostrano rappresentativi interazioni eGFP-NPC con EYFP-assoni. In primo luogo, noi mostriamo la preparazione ventrale del midollo spinale incorporato nella Figura 1A. Avanti, mostriamo la configurazione 2P microscopio e componenti chiave nella Figura 1B. Figura 2 dimostra eGFP e EYFP fluorescenza in una sing...

Un nuovo ex vivo preparazione per l&#39;imaging del midollo spinale di topo. Questo protocollo consente a due fotoni imaging interazioni cellulari vivi tutto il midollo spinale.

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere immagini in tempo reale delle interazioni tra cellule precursori neurali, o NPC, trapiantate e fluorescentemente marcate, e assoni fluorescenti nel midollo spinale del topo. Questo risultato si ottiene rimuovendo con attenzione e incorporando il midollo spinale di topi trapiantati con NPC in un 5%aros e fissandolo su un coverslip. L'orientamento del midollo spinale può essere modificato per visualizzare la fluorescenza in qualsiasi regione del midollo spinale.Nel secondo passaggio, il preparato del midollo spinale viene posizionato sul palchetto di imaging a due fotoni per l'acquisizione di immagini di NPC vitali mentre viene superfusa con mezzo RPMI riscaldato ed ossigenato per un periodo fino a 10 ore. Viene utilizzato un opportuno splitter di fascio a singolo bordo per separare le emissioni di YFP e GFP. In definitiva, l'imaging a due fotoni consente la visualizzazione in tempo reale delle interazioni tra le NPC esprimenti GFP e gli assoni esprimenti YFP nel midollo spinale danneggiato.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurogenerazione, come ad esempio quali sono i segnali molecolari e cellulari necessari per la rimielinizzazione degli assoni danneggiati da parte di NPC trapiantati, e qual è la cinetica di questi eventi di rimielinizzazione? Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l’imaging a due fotoni intertidale, che può essere utilizzato solo per ottenere immagini del midollo spinale dorsale, è che questo metodo consente l’imaging di NPC trapiantati che si sono spostati in profondità nella regione ventrale del midollo spinale. Dopo aver confermato l’eutanasia mediante transezione spinale, inumidire il topo con etanolo al 70%, quindi utilizzare forbici fini e affilate per rimuovere il pelo e la pelle dalla schiena dell’animale, esponendo la colonna vertebrale da circa la lamina cervicale uno o C uno fino alla lamina sacrale quattro o S quattro.Successivamente, utilizzando un bisturi con lama numero 10, effettuare incisioni a sinistra e a destra della colonna vertebrale per separarla dal muscolo e dal tessuto adiposo circostante; rimuovere anche il tessuto in eccesso presente intorno e sopra la colonna vertebrale. Questo permetterà una rimozione più agevole delle vertebre. Poi, tenendo ferma la parte superiore delle vertebre spinali con pinze grigie rigate, inserire le forbici curve in titanio con la parte curva rivolta verso l'alto all'interno della colonna vertebrale esposta a C1, avendo cura di non toccare il midollo spinale.Fare scorrere le forbici fino all'estremità destra ed eseguire un piccolo taglio. Si dovrebbe sentire e percepire un lieve rumore di scricchiolio mentre le forbici recidono le vertebre. Ripetere questo taglio sul lato più a sinistra del midollo, avendo cura di non lavorare troppo velocemente né di eseguire un taglio eccessivamente ampio, poiché ciò potrebbe danneggiare il midollo.Dopo aver tagliato i lati delle vertebre, la singola lamina dovrebbe poter essere sollevata con la pinzetta. Ripetere i tagli destro e sinistro per ciascuna lamina fino a raggiungere S4. Continuare a tenere e tirare indietro le vertebre del midollo spinale.Le vertebre sopra il sito di trapianto potrebbero staccarsi una volta che la colonna vertebrale è stata recisa fino al sito di trapianto. Una volta raggiunta la vertebra S4, posizionare le vertebre in modo da poter visualizzare meglio la posizione del sito di trapianto e praticare un'incisione di circa 20 millimetri in senso rostrale e caudale rispetto al sito di trapianto. Utilizzare ora un bisturi con lama numero 11 per tagliare con attenzione i gangli sul lato destro e sinistro della superficie ventrale del midollo spinale, partendo dall'estremità rostrale.Quindi capovolgere e tenere l'animale in alto in modo che il midollo spinale sia rivolto verso il basso e utilizzare pinze emostatiche zigrinate chiuse per estrarre con attenzione il midollo spinale dall'estremità coddle. Successivamente, senza recidere il midollo spinale, tagliare con cura eventuali gangli residui in modo da poter sollevare il midollo spinale in un unico pezzo integro, e posizionare il cordone in un mezzo su ghiaccio per prepararlo all'analisi mediante imaging. Trasferire il tessuto nervoso su un foglio di param con il lato ventrale rivolto verso l'alto.Quindi pipettare circa cinque millilitri di soluzione di agar al 5% appena preparata a 37 gradi Celsius sopra il cordone e lasciarla solidificare a temperatura ambiente. Dopo circa cinque minuti, applicare un sottile strato di adesivo per tessuti su un coprioggetto quadrato da 22 millimetri e capovolgere il midollo spinale incorporato con il lato ventrale verso il basso su un nuovo pezzo di perfil. Fissare il coprioggetto al lato dorsale esposto e immergere l'intero preparato in mezzo fresco per far solidificare l'adesivo.Quindi, utilizzare una lametta per rimuovere l'agarosio solidificato in eccesso. Successivamente, inserire il tubo collegato alla pompa peristaltica in una bottiglia contenente mezzo di coltura, mantenuta in un bagno termico a 37 gradi Celsius per riscaldarla adeguatamente. Far passare il mezzo riscaldato attraverso una camera di imaging personalizzata posta sul piatto del microscopio a una velocità di tre millilitri al minuto.Quindi posizionare il preparato del midollo spinale nella camera con il lato ventrale rivolto verso l'alto, in direzione dell'obiettivo immerso da 25x. Per acquisire immagini del midollo spinale ventrale mediante microscopia a due fotoni, utilizzare un laser al titanio-sapphire regolato a 900 nanometri, attenuando la potenza del laser sul campione a meno del 5% per garantire una fototossicità minima. Successivamente, utilizzando l'oculare e una sorgente luminosa a campo chiaro, mettere a fuoco l'obiettivo immerso sul margine ventrale del midollo spinale.Per impostare un punto di riferimento, assicurarsi che la sorgente luminosa ambientale sia spenta. Quindi aprire lo scatto del laser per commutare le due citazioni fotoniche, se disponibili. Quando si esplorano i tessuti alla ricerca di aree di interesse, utilizzare un'impostazione di risoluzione più bassa, un volume maggiore senza zoom digitale e una velocità di scansione più elevata rispetto a quella impiegata durante l'acquisizione delle immagini finali.Per individuare le cellule, è preferibile concentrarsi sul campione in illuminazione a campo chiaro sul margine del tessuto, inizialmente nel sito di trapianto, e successivamente passare alla fluorescenza. Si può quindi utilizzare un ampio campo X e Y con bassa risoluzione per visualizzare rapidamente un'area estesa mentre si sposta il fuoco più in profondità nel tessuto. Osservare gli assoni EYFP nelle vicinanze del margine ventrale del midollo spinale.Il segnale di seconda armonica proveniente dal collagene, osservato qui in blu, sarà più intenso ai margini del tessuto del midollo spinale. Ora, utilizzare un software di acquisizione immagini appropriato per ottenere le immagini finali ad alta risoluzione in piani focali sequenziali con incrementi di 2,5 micron, al fine di compilare gli stack Z. In questa rappresentazione, le NPC GFP sono visualizzate in blu e gli assoni YFP danneggiati sono visualizzati in giallo; una colorazione pseudocolore può essere eseguita successivamente utilizzando un software di editing, quindi effettuare una scansione bidirezionale con l'opportuno offset intercalato per garantire una rapida quantificazione di eventuali oggetti in migrazione nel midollo spinale, assicurandosi che la frequenza di acquisizione ideale per determinare la velocità cellulare all'interno del midollo spinale sia impostata a circa 1,7 fotogrammi al secondo.Infine, analizzare le immagini ottenute con un'elaborazione di smoothing e colorazione pseudocolorata mediante un software appropriato, e utilizzare processi automatizzati per esaminare i volumi di imaging consecutivi al fine di produrre i video finali in time lapse. Sebbene questo protocollo di imaging del midollo spinale espiantato possa essere impiegato per visualizzare qualsiasi fluorescenza all'interno del midollo spinale, queste immagini mostrano interazioni rappresentative tra cellule precursori neurali EGFP e assoni EYFP in un singolo stack Z all'interno della regione ventrale del midollo spinale. L'acquisizione di stack Z consecutivi può quindi essere assemblata per generare video in time lapse utili all'analisi della dinamica cellulare in tempo reale all'interno del tessuto integro.In effetti, l'uso di un divisore ottico dicromatico a singolo taglio a 520 nanometri e di un divisore ottico a singolo taglio a 560 nanometri permette di separare i segnali di EGFP ed EYFP, consentendo la colorazione finta dei singoli canali in verde e giallo tramite il software di imaging, come mostrato qui. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di rimuovere correttamente il midollo spinale dal topo senza eccessivo stiramento, compressione o taglio accidentale del tessuto nervoso. Con questo metodo, qualsiasi combinazione di cellule o assoni marcati fluorescentemente può essere acquisita in tempo reale per rispondere ad ulteriori domande scientifiche, ad esempio quali siano le cinetiche della migrazione o della rimielinizzazione sotto diversi trattamenti farmacologici o condizioni sperimentali.

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Un protocollo minimamente invasiva per stabilizzare la colonna vertebrale del mouse ed eseguire...

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in topi svegli. J. Vis. Exp. (2022) Questo video mostra una procedura di microscopia a due fotoni per l'imaging dell'attività neuronale e della dinamica microgliale in un topo sveglio durante la stimolazione visiva, evidenziando i transitori del calcio e le interazioni cellulari.

Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in un topo sveglio

L'imaging time-lapse nell'animale vivente fornisce informazioni preziose sulla riorganizzazione strutturale nel cervello intatto. Qui, introduciamo una preparazione di cranio assottigliato che consente l'imaging transcranico di strutture sinaptiche marcate in fluorescenza nella corteccia di topo vivente mediante microscopia a due fotoni.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In questo video, si descrive un procedimento per impiantare una camera di imaging ottico cronica nel midollo spinale dorsale di un topo vivo. La camera, procedura chirurgica, e di imaging cronica sono rivisti e dimostrati.

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Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse

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Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

La microscopia A scattering Raman stimolato (SRS) consente l'imaging senza etichette di biomolecole in base alla loro vibrazione intrinseca di specifici legami chimici. In questo protocollo, viene descritta la configurazione strumentale di un microscopio integrato SRS e fluorescenza a due fotoni per visualizzare le strutture cellulari nel midollo spinale di topi vivi.

In vivo Imaging di tessuti biologici con fluorescenza combinata a due fotoni e microscopia a dispersione Raman stimolata

Qui, descriviamo un protocollo che combina l'iniezione di virus adeno-associato con l'impianto di finestre craniche per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

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