Preparazione di cella singola sospensioni per analisi citofluorimetrica provenienti da diverse regioni della pelle del mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare una sospensione di una singola cellula dalla pelle del topo per identificare le diverse popolazioni di cellule immunitarie residenti tramite analisi citofluorimetrica. Per identificare e isolare la diversa popolazione di cellule immunitarie residenti nella pelle. Utilizzando questa tecnica, i ricercatori possono facilmente digerire i campioni provenienti da diverse regioni della pelle del topo senza danneggiare le cellule immunitarie, i produttori di superficie di interesse.

Per ottenere campioni di pelle dall'orecchio del topo, tagliare le parti glabre delle orecchie e utilizzare una pinza per separare i lati dorsale e ventrale degli organi. Quindi, raschiare delicatamente l'orecchio interno per rimuovere la cartilagine rimanente. Per ottenere campioni di pelle a pezzi, radere tutti i peli dell'animale con un paio di tosatrici, seguito dall'applicazione di una lozione depilatoria.

Dopo qualche minuto, pulire la lozione e fare un taglio verticale al centro del dorso del topo, continuando l'incisione lungo i bordi delle aree rasate intorno al corpo del topo. Usando una pinza per tenere la pelle in posizione mentre si separa il campione con le punte chiuse e arrotondate di un paio di forbici chirurgiche o di un bisturi, separare delicatamente la pelle dal peritoneo e dai muscoli della schiena. Quindi immergere la pelle in una piastra di coltura cellulare da 100 mm contenente 10 ml di PBS ghiacciato e utilizzare una pinza per raschiare via il grasso sottocutaneo.

Per ottenere un campione di pelle della coda, tagliare la coda e utilizzare le forbici chirurgiche per eseguire un taglio verticale partendo dalla base della coda fino alla punta. Usando una pinza, afferra il bordo dell'incisione alla base della coda, quindi afferra il corpo della coda con un altro paio di pinze, tira delicatamente la pelle verso la punta. Rimuovere il grasso in eccesso raschiando delicatamente il campione di pelle.

Il piede del topo viene tagliato, quindi per ottenere un campione di pelle dal cuscinetto del piede, utilizzare le forbici chirurgiche per tagliare la pelle del piede longitudinalmente dalla caviglia all'inizio delle dita, facendo attenzione a evitare di tagliare i peli. Quindi afferrare le ossa della caviglia con una pinza mentre si afferra la pelle con l'altra e tirare la pelle verso le dita come quando si rimuove un guanto. Per etichettare le cellule della pelle, per ogni campione a turno trasferire il tessuto in una capsula di Petri da 35 millimetri contenente 2 millilitri di cocktail digestivo appena preparato.

Usando le forbici, tagliare il campione in piccoli pezzi e incubare i frammenti di tessuto a 37 gradi Celsius per 90 minuti con una o due scosse delicate durante il periodo di incubazione. Successivamente, versare il tessuto cutaneo digerito su un colino cellulare da 70 micron in una capsula di Petri da 66 millimetri contenente 1 millilitro di RPMI 1640 integrato con FBS per piastra. Lavare il colino con cinque millilitri di terreno fresco, quindi utilizzare uno stantuffo della siringa per spremere i campioni attraverso la maglia del colino.

Sciacquare lo stantuffo, il piatto e il colino con 20 millilitri di terreno fresco e trasferire l'impasto di tessuto in un tubo conico da 50 millilitri. Dopo che tutti i campioni sono stati processati, centrifugare le cellule e risospendere i pellet in 100 microlitri per campione di due microgrammi per millilitro di anticorpo bloccante anti CD16 CD32 in PBS più l'1% di FBS. Dopo 15 minuti a quattro gradi Celsius aggiungere 100 microlitri di anticorpi come indicato nella tabella ai campioni appropriati per 30 minuti a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce.

Al termine dell'incubazione lavare le cellule in un millilitro di PBS più FBS e risospendere i pellet in 300 microlitri di FBS PBS. Quindi etichettare le cellule con 2 microgrammi per millilitro di DAPI per 10 minuti a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce. Per isolare i leucociti, prima si esegue il gate della popolazione DAPI positiva per eliminare le cellule morte.

Quindi selezionare i singoletti in un'area di dispersione diretta mediante il grafico della larghezza di dispersione diretta e bloccare le cellule in base alle dimensioni e alla granularità dei leucociti di interesse. Successivamente, selezionare le cellule CD45 positive e quindi identificare per ciascun campione le popolazioni di cellule dendritiche cutanee in base alla loro espressione di CD11C e MHC di classe due. Identificare i macrofagi in base all'espressione di CD64 e F480, i linfociti B in base all'espressione di CD19 e MHC di seconda classe e i linfociti T in base all'espressione di CD4 o CD8.

L'isolamento delle cellule immunitarie della pelle, come appena dimostrato, produce una popolazione di oltre il 50% di cellule vitali provenienti da tutte le regioni della pelle, tra le 5.000 e le 15.000 per centimetro quadrato, di cui CD45 positive. Un numero sufficiente di cellule dendritiche, macrofagi, cellule B e cellule T è anche ottenibile per l'analisi a valle da un centimetro quadrato di pelle di topo, come indicato. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come digerire un tessuto cutaneo non infiammato e isolare i leucociti per l'analisi via fax.