Name: Preparazione di cella singola sospensioni per analisi citofluorimetrica provenienti da diverse regioni della pelle del mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Impara a preparare sospensioni di cella singola dalla pelle del topo per analisi citofluorimetrica. Questo metodo consente di isolare popolazioni di cellule immunitarie residenti preservando i marcatori di superficie per studi immunologici.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, IG14593, MFAG13235), della Fondazione Cariplo (Grant 2010-0678 e NANOVAC) e della Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica.

approvazione studio: I protocolli sperimentali sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano (Roma, Italia) secondo il Decreto legislativo 27 gennaio 1992, n. 116 &quot;Attuazione della Direttiva n. 86/609 / CEE in materia di Protezione degli Animali utilizzati a Fini Sperimentali o ad Altri Fini scientifici.&quot; 1. Ottenere campioni di pelle <ol><li> Eutanasia il mouse per dislocazione cervicale. </li><li> Orecchio: <ol><li> Tagliare la parte senza peli delle orecchie del mouse. </li><li> dorsali separate e lato ventrale tirandole a pezzi con una pinza. Rimuovere eventuali residui cartilagini raschiando delicatamente la parte interna delle orecchie con una pinza. </li></ol></li><li> la pelle del tronco: <ol><li> Shave tutta la pelle dell&#39;animale, sia con un rasoio elettrico e con delicata crema depilatoria. </li><li> Tagliare il campione di pelle desiderata (da 2 cm 2 fino a tutta la pelle animale). <ol><li> Se tagliare l&#39;intera dorsale e ventrale mouse pelle, fare un taglio verticale nel mezzo del mouse avanti e poi tagliare lungo i confini delle zone rasate intorno al corpo del mouse. </li><li> separare delicatamente la pelle dal peritoneo e muscoli della schiena, mantenendo il campione di pelle ancora con le pinze, mentre separa il campione di pelle con la punta bordi arrotondati chiuso di un forbici chirurgiche o un bisturi. </li></ol></li><li> Preparare una piastra di coltura cellulare 100 millimetri contenente 10 ml di ghiaccio freddo PBS. </li><li> Eliminare il grasso sottocutaneo immergendo il campione di pelle in PBS nel piatto preparato al punto 1.3.3 e raschiando il campione di pelle con una pinza. </li></ol></li><li> Coda: <ol><li> Tagliare la coda del mouse. </li><li> Effettuare un taglio verticale sulla coda con forbici chirurgiche o bisturi chirurgico, a partire dalla base della coda e raggiungendo alla punta della coda. </li><li> Utilizzare pinze per staccare la pelle dalla coda. Afferrare il bordo del taglio alla base della coda e tirare leggermente verso la punta tenendo lacorpo della coda con una pinza. </li><li> Rimuovere il grasso in eccesso raschiando delicatamente il campione di pelle. </li></ol></li><li> footpad <ol><li> Tagliare tutto il piede del mouse con le forbici chirurgiche. Evitando il taglio di qualsiasi pelle pelosa. </li><li> Tagliare la pelle del piede longitudinalmente dalla caviglia fino all&#39;inizio delle cifre. </li><li> Tenere le ossa della caviglia con una pinza oppure a mano mentre afferra la pelle con una pinza e tirare la pelle verso le cifre come se togliersi un guanto. </li></ol></li></ol> 2. Digestione <ol><li> Preparare il cocktail digestione dalla soluzione madre (preparata come in Materials List) con la seguente ricetta: Enzyme mix (vedi Materiali Lista per le specifiche) 300 mg / ml, DNAse1 50 U / ml. Diluire in RPMI 5% FBS. </li><li> Tritare campioni di pelle con le forbici in piccoli pezzi in un piatto 35 millimetri Petri con 2 ml di digestione cocktail (Per la pelle del tronco: 2 ml di digestione cocktail ogni 2 cm 2 di pelle, fino a 3 ml totale). </li><li>Incubare a 37 ° C per 90 min. Agitare delicatamente la piastra di Petri 1-2 volte durante l&#39;incubazione. </li><li> Versare campioni di pelle digeriti su un filtro 70 micron cella 66 millimetri Petri contenenti 1 ml di RPMI1640 5% FBS. </li><li> Lavare il filtro con 5 ml di RPMI 1640 5% FBS. </li><li> Comprimere il campione attraverso il filtro cella con uno stantuffo della siringa. </li><li> stantuffo Flush, capsula di Petri e il filtro con 20 ml di RPMI1640 5% FBS, trasferimento in tubo da 50 ml. </li></ol> 3. Anticorpi ed etichettatura <ol><li> Lavare la sospensione ottenuta due volte con 5 ml di PBS 1% FBS (o BSA). </li><li> Etichetta la sospensione cellulare ottenuta con gli anticorpi desiderati. <ol><li> Risospendere i campioni in 100 ml / campione di una miscela contenente 2 mg / ml di aCD16 / CD32 (2.4G2 clone) diluito in PBS 1% FBS. </li><li> Incubare per 15 minuti a 4 ° C per bloccare il legame non specifico degli anticorpi desiderati attraverso i recettori Fc. </li><li> Aggiungere gli anticorpi indicati nella tabella1. <ol><li> Preparare una miscela diluendo gli anticorpi desiderati in 100 microlitri / campione di PBS 1% FBS ad una concentrazione di 4 mg / ml. </li><li> Aggiungere 100 microlitri della miscela preparata in passaggio 3.2.3.1 per ciascun campione in modo che nel tubo, ci sarà un volume di 200 ml di miscela di anticorpi ad una concentrazione finale di 2 mg / ml. </li></ol></li><li> Incubare per 30 minuti a 4 ° C e coprire dalla luce. </li></ol></li><li> Lavare con 1 ml di PBS 1% FBS, centrifugare per 5 minuti a 400 xg, scartare il surnatante e risospendere in 300 ml di PBS 1% FBS. </li><li> Aggiungere DAPI ad una concentrazione finale di 2 mg / ml e incubare a 4 ° C, al riparo dalla luce per 10 min. </li><li> Analizzare i campioni ottenuti da FACS. <ol><li> Per isolare leucociti, utilizzare la seguente strategia di gating: <ol><li> In primo luogo eliminare eventuali cellule morte dalla gating sulla popolazione DAPI-. </li><li> Selezionare le canottiere nel FSC-A vs plot FSC W come indicato in figura 1 </strong&gt;. </li><li> Porta le cellule in base alle dimensioni e la granularità tipica dei leucociti di interesse. </li><li> Selezionare CD45 + cellule nel-A FSC plot CD45 come indicato in Figura 1. </li></ol></li><li> Distinguere le differenti popolazioni di leucociti mediante l&#39;espressione di marcatori di superficie come segue: <ol><li> Identificare DC come II cellule + CD11c + MHC. Questi possono essere successivamente analizzati per l&#39;espressione del CD207 di distinguere le cellule di Langerhans e CD207 + Dermal DC da CD207- Dermal DC. </li><li> Identificare macrofagi come / 80 + cellule CD64 + F4. </li><li> Identificare le cellule B come cellule CD19 + MHCII +. </li><li> Identificare le cellule T CD8 + come o cellule CD4 +. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Gopinathan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+skin+structure%3A+scratching+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">New insights into skin structure: scratching the surface.</a> Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).</li>
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<li>Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+functions+of+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Abbiamo descritto un metodo per la preparazione di sospensioni monocellulari da diverse regioni cutanee mouse. Il metodo della digestione abbiamo adottato, non solo dà alte rese, ma conserva anche l&#39;espressione dei marcatori di superficie, che è fondamentale per la successiva analisi FACS. L&#39;uso di un cocktail di collagenasi I e II e termolisina, garantisce lotto minima per differenze lotti nell&#39;attività enzimatica rendendo questo metodo altamente riproducibile. Altri metodi pubb...

La pelle è uno degli organi più grandi del corpo e la sua grande superficie è continuamente esposta all'ambiente esterno. Pertanto, la pelle deve proteggere l'organismo da potenziali minacce al fine di mantenere l'omeostasi, sia con mezzi fisici, sia fornendo una protezione attiva contro l'ingresso di potenziali agenti patogeni. In modo simile alla mucosa intestinale e polmonare, la pelle ospita una varietà di cellule immunitarie che interagiscono continuamente con l'epitelio al fine di mantenere la sorveglianza immunitaria. Questo complesso sistema che coinvolge sia le cellule immunitarie che quelle non immunitarie della pelle è stato riconosciuto fin dagli albori dell'immunologia, quando nel 1978 è stato coniato per la prima volta il termine "tessuto linfoide associato alla pelle" (SALT) 1 per descrivere tale complessità. 
Il gran numero di cellule immunitarie che risiedono nella pelle aiuta l'organismo non solo a combattere potenziali invasioni, ma anche a orchestrare la guarigione delle ferite e a mantenere la tolleranza verso gli autoantigeni e il microbiota cutaneo 2,3. 
Tra le cellule immunitarie residenti nella pelle, le cellule dendritiche (DC) hanno un ruolo cruciale nel modellare le risposte immunitarie e nel mantenere l'omeostasi 4. Le DC dermiche e le cellule di Langerhans rispondono prontamente alle invasioni di agenti patogeni e, dopo la migrazione ai linfonodi, attivano le cellule T e inducono l'espressione dei recettori di homing cutaneo sulle cellule T effettrici appena generate 5. Le DC hanno anche un ruolo fondamentale nella regolazione dell'omeostasi cutanea. Le DC che migrano dal derma ai linfonodi in condizioni omeostatiche trasportano antigeni sequestrati cutanei con lo scopo di indurre tolleranza alle cellule T principalmente attraverso la differenziazione di cellule T regolatorie (Treg) specifiche per gli antigeni cutanei 6-8. 
Le cellule T rappresentano la popolazione più abbondante di cellule immunitarie nella pelle. Non solo si infiltrano nella pelle durante un'infezione, ma rappresentano anche una popolazione stabile tra i linfociti residenti nella pelle 9,10. Sia le cellule T CD8+ che quelle CD4+ risiedono nella pelle e, a seguito di un'infezione, possono rispondere molto prima che le cellule T effettrici vengano reclutate dal sangue. Nella cute, inoltre, risiede una popolazione di Treg residenti nei tessuti in grado di mantenere la tolleranza verso gli antigeni cutanei e l'omeostasi tissutale. Queste cellule si attivano rapidamente e potentemente dopo l'esposizione al loro antigene affine e sono state quindi definite come Tregs della memoria 11,12. 
Insieme alle DC e alle cellule T, molte cellule immunitarie innate, come le cellule NK, le cellule T gamma delta, le ILC 13 del gruppo 2, i mastociti e i macrofagi, popolano la pelle e contribuiscono alla protezione dell'ospite. Per analizzare un ambiente così complesso, è obbligatorio ottenere sospensioni di singole cellule da campioni cutanei con elevata efficienza, preservando allo stesso tempo l'espressione di marcatori di superficie per l'analisi citofluorimetrica a flusso o il sorting. 
La pelle murina presenta uno strato epidermico esterno, costituito principalmente da cheratinociti, cellule di Langerhans e cellule T epidermiche dendritiche; e lo strato dermico sottostante. Il derma ospita la maggior parte delle cellule immunitarie ed è costituito da una matrice extracellulare in cui le fibre di collagene sono le più abbondanti, in particolare il collagene-I e il collagene-IV. A differenza della pelle umana, la pelle del topo è ricoperta di pelliccia e quindi più popolata da follicoli piliferi. È, inoltre, molto più sottile della pelle umana e contiene uno strato muscolare, il pannicolo carnoso, che aiuta la guarigione delle ferite 14. Queste caratteristiche rendono più difficile interrompere in modo efficiente la rete di collagene del derma al fine di espellere le cellule immunitarie.
In questo articolo forniamo un metodo adatto per digerire la matrice extracellulare che si basa su un cocktail di collagenasi 1 e 2 ad alta purezza e termolisina. Inoltre, poiché l'analisi della pelle di diverse regioni richiede diverse procedure sperimentali, mostreremo diversi metodi per ottenere in modo efficiente campioni di pelle dal piede, dalla coda, dall'orecchio e dal tronco. Etichetteremo quindi i campioni per valutare la presenza di DC (MHCII+CD11c+CD45+), macrofagi (CD11b+F4/80+CD45+), cellule T CD8+ e CD4+.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Integrato RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI1640 integrato con L-glu, penna-streptococco senza beta mercapto etanolo</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM (Enzyme Mix)</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>risospensione [2,5&nbsp; mg/ml] in dH2O; Conservare le aliquote a -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D4263-1VL</td><td>risospensione in RPMI 1640 senza siero [1.000&nbsp; U/ml]</td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Forbici</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiche</tr><tr><td>Pinze</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiche</tr><tr><td>Bisturi chirurgici Piastre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>di<td>Petri da 35 mm</td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 66 mm Piastre</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td>di Petri<td>da 100 mm</td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtri cellulari</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di digestione</td><td></td><td></td><td>Diluire in RPMI 5%</td></tr><tr><td>FBS LIberase TM</td><td></td><td></td><td>300 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>DNAse1</td><td></td><td></td><td>50 U/ml</td></tr><tr><td colspan="4">Antibodies</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Clone</td><td>Label</td></tr><tr><td>aCD45.2</td><td></td><td>104</td><td>PE-Cy5.5</td></tr><tr><td>aCD11c</td><td></td><td>N418</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>CD11b</td><td></td><td>M1/70</td><td>FITC</td></tr><tr><td>F4/80</td><td></td><td>A 3-1</td><td>APC-Cy7</td></tr><tr><td>aCD4</td><td></td><td>Gk1.5</td><td>APC-Cy7</td></tr><tr><td>aCD8</td><td></td><td>53-6.7</td><td>PE</td></tr><tr><td>aCD64</td><td></td><td>X54-5/7.1</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>aCD207</td><td></td><td>4C7</td><td>APC</td></tr></tbody></table>

preparazione di cella singola sospensioni per analisi citofluorimetrica provenienti da diverse regioni della pelle del mouse

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

La pelle è un organo barriera che interagisce con l'ambiente esterno. Essendo continuamente esposti a potenziali invasioni microbiche, il derma e l'epidermide ospitano una varietà di cellule immunitarie sia in condizioni omeostatiche che infiammatorie. Gli strumenti per ottenere il rilascio di cellule cutanee per le analisi citofluorimetriche sono, quindi, molto utili per studiare la complessa rete di cellule immunitarie che risiedono nella pelle e la loro risposta agli stimoli microbici. Qui, descriviamo una metodologia efficiente per la digestione della pelle di topo per ottenere rapidamente ed efficacemente sospensioni a singola cellula. Questo protocollo consente di mantenere la massima vitalità cellulare senza compromettere l'espressione dell'antigene di superficie. Descriviamo anche come prelevare e digerire campioni di pelle da diverse posizioni anatomiche, come l'orecchio, il tronco, la coda e il cuscinetto plantare. Le sospensioni ottenute vengono quindi colorate e analizzate mediante citometria a flusso per discriminare tra diverse popolazioni di leucociti.

Pelle dalla diversa regione del corpo è stato digerito secondo il protocollo descritto e colorati con gli anticorpi indicati. La strategia di gating è rappresentato nella Figura 1. In primo luogo selezionare cellule vive (cellule DAPI-), poi porta il canottiere (FSC-A vs FSC-W) e su cellule con linfociti morfologia (FSC-A vs SSC-A). Quando indicato, vengono selezionate le cellule CD45 + di origine ematopoietiche. <p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

La pelle ospita una complessa rete di cellule immunitarie. Descriviamo una metodologia efficiente per la digestione della pelle di topo, proveniente da diverse parti del corpo dell'animale, al fine di ottenere una sospensione unicellulare e analizzare le diverse popolazioni leucocitarie residenti nella pelle mediante citometria a flusso.

Preparazione di cella singola sospensioni per analisi citofluorimetrica provenienti da diverse regioni della pelle del mouse

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare una sospensione di singole cellule dalla pelle del topo per identificare le diverse popolazioni di cellule immunitarie residenti mediante analisi citofluorimetrica, al fine di identificare e isolare le diverse popolazioni di cellule immunitarie residenti nella pelle. Utilizzando questa tecnica, i ricercatori possono facilmente digerire i campioni provenienti da diverse regioni della pelle del topo senza danneggiare i marcatori superficiali delle cellule immunitarie di interesse.Per ottenere campioni di pelle dall'orecchio del topo, tagliare le parti senza peli delle orecchie ed usare una pinzetta per separare i lati dorsale e ventrale degli organi. Quindi, raschiare delicatamente l'interno dell'orecchio per rimuovere qualsiasi cartilagine residua. Per ottenere campioni di pelle a pezzi, rasare tutti i peli dall'animale utilizzando un paio di forbici elettriche, seguite dall'applicazione di una lozione depilatoria.Dopo alcuni minuti, rimuovere la lozione ed eseguire un taglio verticale al centro della schiena del topo, proseguendo l'incisione lungo i margini delle aree rasate attorno al corpo del topo. Utilizzando una pinza per te

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Immunologia e Infezioni

Dissociare cellule di tipi di tessuto specifico richiede parametri specifici per aggitation tessuto per ottenere un elevato volume di vitali, cellule coltivabili. Il Miltenyi gentleMACS dissociatore ottimizza questa operazione con un semplice protocollo pratico. In questa pubblicazione l'utilizzo di questo apparecchio sul tessuto nerual è spiegato.

Generazione di Single-Cell Sospensioni dal tessuto neurale del mouse

Cancro fibroblasti associati (CAF) facilitare l'iniziazione del tumore, la crescita e la progressione attraverso la segnalazione che promuove la proliferazione, l'angiogenesi, e l'infiammazione. Qui si descrive un metodo per isolare popolazioni pure di fibroblasti normali e CAF dal topo freschi e tessuti umani mediante selezione delle cellule, utilizzando PDGFRα come marcatore di superficie.

Isolamento di fibroblasti normali e tumorali associata da tessuti freschi di fluorescenza activated cell sorting (FACS)

Questo video descrive il metodo rapido per isolare e coltivare contemporaneamente i melanociti e i fibroblasti dalla pelle del cucciolo di topo postnatale. Queste cellule possono essere mantenute e manipolate in vitro per studiare la biologia delle cellule della pelle, la guarigione delle ferite e il melanoma.

Coltura rapida di melanociti murini primari e fibroblasti: isolamento di melanociti e fibroblasti da un campione di pelle intera murina

Il video dimostra la preparazione di una sospensione unicellulare di cellule immunitarie da un tessuto cerebrale murino. Prevede la digestione enzimatica per rilasciare le cellule dal tessuto cerebrale, seguita dalla centrifugazione in gradiente di densità per isolare le cellule immunitarie in base alla loro densità per ottenere la sospensione di una singola cellula.

Preparazione di una sospensione unicellulare di cellule immunitarie da tessuto cerebrale murino

Descriviamo un protocollo per isolare in modo efficiente le cellule T residenti nella pelle da biopsie cutanee umane. Questo protocollo produce un numero sufficiente di linfociti residenti nella pelle umana vitali per l'analisi citofluorimetrica e la coltura ex vivo.

Linfociti Isolamento da Pelle umana per l&#39;analisi fenotipica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Il comportamento dei fibroblasti è alla base di uno spettro di entità cliniche, ma rimangono scarsamente caratterizzate, in gran parte a causa della loro intrinseca eterogeneità. La ricerca tradizionale sui fibroblasti si basa sulla manipolazione in vitro, mascherando il comportamento dei fibroblasti in vivo. Descriviamo un protocollo basato su FACS per l'isolamento di fibroblasti cutanei di topo che non richiede colture cellulari.

Murino Dermal fibroblasti Isolation di FACS

Un modello ideale per studiare la biologia delle cellule staminali adulte è il follicolo pilifero del topo. Qui presentiamo un protocollo per isolare diverse popolazioni di cellule staminali dei follicoli piliferi e cheratinociti epidermici, impiegando la digestione enzimatica della pelle dorsale del topo seguita dall'analisi FACS.

Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse

Questo rapporto descrive un protocollo CUBIC per chiarire tutto spessore del mouse biopsie cutanee, e visualizzare pattern di espressione delle proteine, le cellule proliferanti, e sebociti alla risoluzione di singola cellula in 3D. Questo metodo consente una valutazione accurata di anatomia e patologia della pelle, e di fenotipi epidermiche anomali nelle linee di topi geneticamente modificati.

Protocollo CUBIC Visualizza lo espressione della proteina a risoluzione singola cella di intere preparazioni della pelle Mount

Di seguito viene presentato un protocollo efficiente per l'isolamento di cellule satelliti di cellule di arto di topo (FACS) attivato dalla fluorescenza, adattato allo studio della regolazione della trascrizione nelle fibre muscolari mediante scissione sotto bersagli e rilascio mediante nucleasi (CUT&amp;RUN).

Un protocollo efficiente per l'analisi CUT&amp;RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS

Descriviamo i protocolli per la preparazione di sospensioni a singola cellula di cellule epiteliali timiche-di topo e la colorazione di molecole intracellulari per l'analisi citofluorimetrica.

Preparazione di sospensioni unicellulari di cellule epiteliali timiche di topo e colorazione di molecole intracellulari per analisi citofluorimetrica

Questo protocollo presenta un metodo dettagliato per isolare sospensioni monocellulari di alta qualità sia da tessuto polmonare murino sano che da quello con tumori. Questo protocollo può essere applicato a scRNA-seq, analisi della citometria a flusso e isolamento cellulare primario.

Preparazione ottimizzata del tessuto polmonare intero portante di tumori murini per la citometria di flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Impara a preparare sospensioni di cella singola dalla pelle del topo per analisi citofluorimetrica. Questo metodo consente di isolare popolazioni di cellule immunitarie residenti preservando i marcatori di superficie per studi immunologici.

Preparazione di cella singola sospensioni per analisi citofluorimetrica provenienti da diverse regioni della pelle del mouse

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