Normali e maligne trapianto muscolare cellulare in immunitario compromesso Zebrafish adulti

L'obiettivo generale di questo procedimento è dimostrare come preparare e trapiantare muscolo normale e maligno da zebrafish donatori transgenici a riceventi zebrafish privi di immunità rag2. Il trapianto muscolare prevede innanzitutto l'isolamento del muscolo marcato con fluorescenza mediante dissezione della muscolatura dorsale.

Dopo l'omogeneizzazione delle cellule muscolari del pesce zebra, queste vengono filtrate e sospese come singole cellule. Le cellule vengono quindi trapiantate per via intramuscolare in pesci zebra mutanti rag2, e la microscopia a fluorescenza epi viene utilizzata per seguire l'attecchimento del tessuto negli animali riceventi già a partire da 10 giorni dopo il trapianto. Analogamente, un sarcoma primario di rabdomiosarcoma embrionale può essere prelevato, sospeso e trapiantato per via intraperitoneale in pesci zebra mutanti rag2.

Successivamente, la microscopia viene utilizzata per seguire l'innesto del tessuto e le cellule tumorali propagate possono essere utilizzate in applicazioni successive. Il principale vantaggio dell'utilizzo del trapianto di cellule in zebrafish adulti immunocompromessi è che fornisce una piattaforma universale per il trapianto allotrapiantologico di diversi tessuti e tipi di tumore. I tessuti possono essere trapiantati da una varietà di background genetici del donatore senza la necessità di soppressione immunitaria nei pesci riceventi.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia delle cellule staminali e rigenerativa, come la capacità di autorenovamento dei progenitori. Possiamo inoltre utilizzare questi metodi per impiantare tumori in pesci privi di linfociti di tipo due mutanti, e successivamente identificare nuove sostanze chimiche che, ad esempio, inibiscano la crescita tumorale. La preparazione e il trapianto di cellule muscolari normali e maligne saranno illustrati da Chin, Tang e Anes, due brillanti studenti laureati del laboratorio LAL. Iniziare sacrificando pesci zebra donatori con muscolo marcato fluorescentemente.

I tipici pesci adulti donatori di actina alfa RFP producono da 500.000 a 2 milioni di cellule muscolari. Nel nostro esperimento esemplificativo, utilizziamo 30 pesci donatori per trapiantare in 20 pesci riceventi un milione di cellule ciascuno. Dopo l'eutanasia dei pesci donatori, asciugare l'animale posizionandolo su un tovagliolo di carta monouso.

Utilizzare una lametta per prelevare la muscolatura dorsale. Il taglio deve essere eseguito con un angolo di 45 gradi posteriormente alla regione anale, includendo ossa e tessuto cutaneo; trasferire 10 sezioni muscolari dorsali prelevate in una piastra di Petri pulita. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di tampone di sospensione 0,9 XPBS 5% FBS freddo.

Successivamente, tritare il tessuto fino a ottenere una sospensione omogenea, omogeneizzando completamente il tessuto utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri; aggiungere due millilitri di buffer di sospensione all'omogenato, quindi aspirare e rilasciare la sospensione attraverso la pipetta per 20 volte. Successivamente, filtrare la sospensione utilizzando un filtro da 40 micron e raccogliere le cellule in un tubo conico da 50 millilitri posto sul ghiaccio. Mantenere le cellule fredde per il resto della procedura.

Lavare il tessuto rimanente nel filtro con 2,5 millilitri di sospensione, tamponare ed eliminare nel tubo conico da 50 millilitri. A questo punto, contare il numero totale di cellule vitali utilizzando il trian blu e concentrarle mediante centrifugazione a 1000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, risospendere le cellule in 0,9 XPBS con il 5% di FBS a 333.000 cellule per microlitro.

Se il numero di cellule donatrici è limitato, anche soltanto 50.000 cellule iniettate possono portare a un innesto riuscito. Iniziare anestetizzando pesci carenti di rag2 di età compresa tra due e quattro mesi in trica. Quando i movimenti opercolari sono lenti e il pesce è immobile, spostare il pesce su un panno umido con il lato sinistro del pesce rivolto verso l'alto.

Ora utilizzare una micropipetta da 10 microlitri, calibro 26 s, pre-pulita per iniettare tre microlitri della sospensione di cellule muscolari preparata. Le iniezioni devono essere eseguite con un angolo di 45 gradi e direttamente nella muscolatura dorso-laterale dei pesci riceventi. È importante notare che, durante il trapianto intramuscolare, si deve iniettare un volume totale inferiore a tre microlitri nel pesce ricevente. Successivamente, trasferire con attenzione il pesce ricevente in un serbatoio di recupero contenente acqua pulita del sistema per pesci.

Continuare ad iniettare i pesci rimanenti e posizionarli in un unico serbatoio di recupero. Successivamente, valutare i tassi di attecchimento a 10, 20 e 30 giorni dal trapianto utilizzando microscopia in campo chiaro e microscopia a fluorescenza in epifluorescenza. Elaborare ogni tumore separatamente.

Sacrificare un pesce affetto da rabdomiosarcoma embrionale. Posizionare il pesce in una piastra di Petri pulita e dissezionare il tumore dai tessuti non maligni utilizzando una lametta e pinzette fini. Una dissezione accurata intorno al tumore consentirà di ottenere una sospensione cellulare con maggiore purezza e minima contaminazione da tessuto muscolare circostante. Trasferire il tumore dissezionato in una nuova piastra e aggiungere 100 microlitri di buffer di sospensione 0,9 XPBS 5% FBS pre-raffreddato.

Quindi tritare il tessuto con una lametta fino a ottenere una sospensione omogenea. Aggiungere poi ulteriori 900 microlitri di tampone utilizzando una pipetta da un millilitro, seguiti da tritazione. Passare la sospensione attraverso la pipetta diverse volte per dissociare le cellule.

Ora filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 micron. Risciacquare la piastra aggiungendo da due a quattro millilitri aggiuntivi di sospensione, tampone, e filtrare attraverso lo stesso filtro cellulare. Concentrare le cellule come in precedenza.

Mantenere le cellule sul ghiaccio. Successivamente, risospendere le cellule in 100 microlitri di buffer e contare le cellule vitali utilizzando il trian blu. Regolare la concentrazione della sospensione cellulare a 5.000 cellule per microlitro.

Successivamente, anestetizzare due zebrafish immuno-compromessi donatori e posizionarli su un tovagliolo di carta pulito con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Utilizzando un ago per siringa sterile da 26 s, iniettare il volume desiderato nella cavità peritoneale degli zebrafish riceventi qui.

25.000 cellule vengono iniettate in cinque microlitri. Tuttavia, è possibile iniettare con successo fino a 10 microlitri. Lasciare i pesci iniettati riprendere in un serbatoio di recupero prima di reinserirli nel sistema principale.

In seguito, seguire i pesci riceventi per il trapianto mediante microscopia a fluorescenza in epifluorescenza e raccogliere le cellule per studi successivi. Utilizzando la procedura descritta, cellule del muscolo scheletrico provenienti da donatori transgenici alpha actin RFP sono state trapiantate in pesci zebra omozigoti privi di risposta immunitaria, con mutazione nel gene rag2. Il tessuto muscolare scheletrico ha prodotto una sospensione monocellulare contenente l'84,3% di cellule vitali, valutata mediante esclusione del DPI.

Successivamente all'analisi mediante citometria a flusso, le cellule positive per RFP costituivano il 35,3% di questa sospensione cellulare del donatore. Il trapianto delle cellule nel muscolo scheletrico dorsale di pesci riceventi RAG due mutanti omozigoti ha portato a un engraftamento consistente e marcato. Ciò è stato confermato dalla formazione di fibre muscolari fluorescenti multinucleate nei pesci riceventi; i pesci riceventi di tipo selvatico non hanno mostrato engraftamento di fibre muscolari.

Tuttavia, a 10 giorni dal trapianto, nove su 14 pesci zebra mutanti presentavano fibre muscolari positive per RFP nelle vicinanze del sito di iniezione. In modo significativo, il muscolo innestato positivo per RFP è persistito per almeno 30 giorni dopo il trapianto. Analogamente, un innesto robusto è stato ottenuto anche dopo il trapianto di pesci mutanti RAG2 con rabdomiosarcoma embrionale o ERMS.

Il ERMS trapiantato condivideva caratteristiche istologiche con il tumore ERMS primario; l'eterogeneità delle cellule tumorali è stata mantenuta, come valutato mediante analisi della fluorescenza. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire trapianti muscolari e trapianti intraperitoneali di tessuti normali e maligni utilizzando pesci adulti immunocompromessi come riceventi. Successivamente, altri metodi come il sorting cellulare attivato da fluorescenza, l'analisi del trapianto in diluizione limitante e la PCR in tempo reale possono essere eseguiti per valutare le differenze funzionali e molecolari tra diverse sottopopolazioni tumorali.

Complessivamente, il nostro approccio consente un'attecchimento robusto e a lungo termine di tessuto muscolare e tessuto maligno fluorescente in pesci immunocompromessi con mutazione RAG due. Il vantaggio di questo approccio è che l'attecchimento avviene in assenza di una precedente soppressione immunitaria nei pesci riceventi e non richiede l'abbinamento immunitario tra donatore e ricevente.