Utilizzando Murine inducibile telomerasi alleli in Studi di Tissue Degeneration / Regeneration e il cancro

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di manipolare due alleli murini inducibili da mase knocking in vivo e in vitro per studi di degenerazione e rigenerazione tissutale e studi sul cancro. Ciò si ottiene impiantando compresse di idrossitamoxifene negli animali per riattivare la mase in vivo. In una seconda fase, le cellule staminali neurali vengono isolate da animali che vengono poi trattati con idrossitamoxifene per riattivare la mase in vitro.

fluorescenza dei telomeri nell'ibridazione C 2 o fish viene eseguita sia su cellule coltivate che su tessuti cerebrali incorporati in paraffina formale e fissa, al fine di controllare l'attività della mase. I risultati hanno mostrato che i trattamenti con idrossitamoxifene possono riattivare in modo robusto l'attività della mase, che può alleviare i fenotipi dell'invecchiamento e promuovere la formazione di tumori sulla base dell'esame istopatologico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'invecchiamento e del cancro, ad esempio se possiamo rallentare o meno il processo di invecchiamento modulando l'attività del trauma TH, o come indirizzare specificamente Thomas per trattare il cancro.

A dimostrare questa procedura saranno l'istruttore Dr.Takashi Shingu e un tecnico April Un del mio laboratorio. Iniziare questa procedura con la generazione del Turt ER e bloccare l'arresto blocca gli alleli di Turt come descritto nel protocollo di testo, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima dell'iniezione procedere all'anestesia dei topi come descritto nel protocollo di testo. Dopo aver raggiunto l'anestesia profonda, rimuovere l'animale anestetizzato dalla camera di induzione e tenere la testa all'interno del tubo collegato alla camera isofluoro.

Pizzica i cuscinetti dei piedi dei topi per assicurarti che l'animale sia profondamente anestetizzato. Metti anche un unguento su entrambi gli occhi Per evitare che gli occhi si aprano, pulisci la parte posteriore dei topi con una soluzione di iodio povidone. Quindi, iniettare un pellet di idrossitamoxifene a lento rilascio con un trocar di precisione sotto la pelle della schiena.

E spingi il pallino fino alla linea mediana tra due spalle. Sigillare l'incisione con un applicatore di clip per ferite e monitorare i topi per il recupero. Per l'anestesia.

Togliete i cervelli di un giorno dal topo e mantenete i quattro cervelli rimuovendo i bulbi olfattivi e il cervelletto. Conservare i quattro tessuti cerebrali in un millilitro di terreno di coltura freddo e conservarli a quattro gradi Celsius. Assicurati di elaborare il tessuto neurale entro un'ora.

Determinare il peso del tessuto per assicurarsi che il limite di 400 milligrammi per digestione non venga superato. Posiziona il cervello sul coperchio di una capsula di Petri di 35 millimetri di diametro e schiaccia il cervello usando un bisturi. Utilizzando un puntale per pipetta da un millilitro, aggiungere un millilitro di soluzione salina di Hank's balance o HBSS.

Quindi pipettare nuovamente i pezzi in una provetta da 15 millilitri dopo aver risciacquato con centrifuga HBSS a 300 volte G per due minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso con cura il surnatante, aggiungere 1.950 microlitri di enzima preriscaldato. Mescolarne uno per un massimo di 400 milligrammi di tessuto.

Incubare il campione nella provetta da 15 millilitri per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Mescolare il campione capovolgendo o agitando la provetta ogni cinque minuti. Quindi preparare 30 microlitri di enzima Mescolare due per campione di tessuto aggiungendo 20 microlitri di soluzione, da tre a 10 microlitri di soluzione quattro.

Quindi aggiungere al campione, invertendo delicatamente per mescolare, dissociare meccanicamente il tessuto utilizzando una pipetta in pasta lucidata a fuoco a punta larga, pipettando su e giù 10 volte, evitando lentamente la formazione di bolle d'aria. Incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti, capovolgendo la provetta ogni tre minuti. Quindi, applicare la sospensione cellulare su un filtro cellulare da 70 micron posizionato su una provetta da 50 millilitri.

Applicare 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS attraverso il colino cellulare. Quindi scartare il filtro cellulare e centrifugare la sospensione cellulare a 300 volte G per 20 minuti. Impostare la temperatura ambiente dopo la centrifugazione, aspirare completamente il surnatante.

Risospendere le cellule con il mezzo di cellule staminali al volume richiesto per ulteriori applicazioni per attivare il tele array nelle serrature, arrestare le serrature. Cellule staminali neurali di Turt. Trattare le cellule con 100 micromolari di idrossitamoxifene per due giorni per attivare l'emasi, e turt er cellule staminali neurali.

Mantenere le cellule in terreno di coltura con 100 micromolari di idrossitamoxifene per eseguire il pesce telomero. Innanzitutto, preparare i cromosomi in metafase da cellule in coltura per sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina o FFPE. Distribuire il campione in xilene e reidratarlo in una serie di etanolo per cinque minuti ciascuno e in PBS per cinque minuti.

Quindi postfissare le sezioni in un rapporto di tre a uno di metanolo e acido acetico per una o due ore. Disidratare le sezioni in una serie di etanolo freddo per cinque minuti ciascuna e lavare a secco all'aria in un XPBS a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, in natura, i cromosomi in formaldeide al 4% a 37 gradi Celsius per due minuti.

Disidratare le sezioni in una serie di etanolo freddo come prima e asciugare all'aria una volta asciutte, applicare da 12 a 25 microlitri della miscela di ibridazione dell'acido nucleico peptidico su ogni vetrino. Sigillare il vetrino coprioggetti con cemento di gomma che fissa i preparati cromosomici naturali e le sezioni di tessuto a 80 gradi Celsius per quattro minuti. Quindi ibridare a temperatura ambiente o 37 gradi Celsius per due o quattro ore in una camera umida.

Successivamente, lavare i campioni a temperatura ambiente con tampone di lavaggio per 15 minuti due volte. Quindi lavarli a temperatura ambiente per cinque minuti con PBS e interpolarli 23 volte. Infine, controcolorare i vetrini con DPI o fluorescenza rossa lontana per l'esame microscopico.

Quando i telomeri sono stati riattivati transitoriamente in topi disfunzionali dei telomeri, i fenotipi degenerativi potrebbero essere migliorati in più organi come il cervello e i testicoli per determinare l'impatto della riattivazione dei telomeri sulle cellule. Le cellule staminali neurali in vitro in coltura sono state isolate da topi ER G four lock stop lock, TURT e G four turt di ultima generazione. Quando i telomeri sono stati riattivati nelle cellule staminali neurali disfunzionali dei telomeri, la capacità di autorinnovamento è stata notevolmente aumentata.

Anche la neurogenesi in vitro è stata significativamente migliorata per determinare l'impatto della riattivazione della masi sulla tumorgenesi nel contesto della disfunzione dei telomeri, la riattivazione della masi mediante trattamento con tamoxifene è stata eseguita in un modello di tumore alla prostata. Modello di linfoma endottico a cellule T. Il trattamento ha portato a un notevole aumento della tumorgenesi in entrambi i modelli.

Infine, il pesce dei telomeri è stato eseguito su FFPE, tessuti cerebrali di topo e cromosomi in metafase. In queste immagini, il rosso indica il DNA, il verde indica la colorazione dei telomeri e il ciano indica la colorazione del centromero. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come attivare l'attività del trauma in mTOR ER e bloccare i blocchi, gli animali mTOR e le linee cellulari e come usarli per studiare le tue domande sul cancro e sull'agente.