Funzionale e morfologica Valutazione della membrana innervazione da Phrenic Motor Neurons

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di valutare quantitativamente l'innervazione funzionale e morfologica del diaframma da parte dei motoneuroni frenici del midollo spinale cervicale. Ciò si ottiene conducendo la registrazione del potenziale d'azione muscolare composto dal diaframma emi negli animali anestetizzati dopo la stimolazione sovramassimale del nervo frenico omolaterale. Il passo successivo consiste nell'eseguire l'immunoistochimica del diaframma a montatura intera per valutare morfologicamente l'innervazione delle singole giunzioni neuromuscolari.

In definitiva, la combinazione del potenziale d'azione muscolare composto e delle analisi della giunzione neuromuscolare fornisce un potente approccio per lo studio quantitativo dell'innervazione diaframmatica in modelli di roditori del SNC e della malattia del SNP. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle lesioni del midollo spinale, ad esempio è possibile utilizzare interventi terapeutici per ripristinare con successo la funzione diaframmatica? Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia per malattie come la lesione traumatica del midollo spinale e l'ILS perché la funzione respiratoria diaframmatica svolge un ruolo chiave nell'esito del paziente in entrambe queste condizioni debilitanti, A dimostrare la procedura saranno il Dr.Kali, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio, Melanie Martin, una studentessa universitaria nel laboratorio del Dr.Wright, e Tamara Holla, un tecnico di ricerca nel mio laboratorio.

Dopo aver anestetizzato l'animale, posizionarlo sulla tavola chirurgica, con la parte dorsale rivolta verso il basso e fissare gli arti anteriori alla tavola. Quindi radere la superficie ventrale dalla base del cranio verso l'addome su entrambi i lati della linea mediana. Una volta che la pelle è stata pulita, posizionare gli elettrodi, fissare il terreno alla coda e posizionare l'elettrodo di riferimento nell'addome inferiore controlaterale per via sottocutanea.

L'elettrodo di registrazione deve essere preparato con gel conduttivo sulla parte autoadesiva e quindi fissato lungo il margine costale unilaterale. Posizionare ora gli elettrodi stimolanti, transcutanei a mezzo centimetro di distanza l'uno dall'altro, lateralmente alla trachea e superiormente alla clavicola. Dovrebbero entrare perpendicolarmente alla pelle e andare a circa un centimetro di profondità.

Questi elettrodi devono essere ben fissati, meglio se fatti a mano. Collegare tutti gli elettrodi agli stimolatori e agli amplificatori appropriati. I dati raccolti devono essere registrati su un computer.

Per l'analisi, impostare i parametri di stimolo della stimolazione unipolare su 0,5 millisecondi, impulsi super massimali di un hertz. L'ampiezza può variare da sei a otto volt. Impostare il tempo di stimolazione dell'interesse su 30 secondi e calcolare la media della risposta di 10 stimolazioni consecutive utilizzando la registrazione dell'ampiezza di base per il picco di ciascun animale circa una volta alla settimana, se lo si desidera.

La gestione degli animali è dettagliata nel protocollo di testo. Dopo l'eutanasia di un animale con un sovradosaggio di anestesia iniettabile, eseguire una laparotomia con bisturi o forbici. Praticare un'incisione dal processo xifoideo lungo la linea mediana.

Quindi, utilizzando un bisturi e una pinza, separare accuratamente la pelle e il tessuto connettivo dalla muscolatura. Rimuovere il diaframma tirando verso l'alto il processo xifoideo e tagliando il diaframma dall'osso circostante. Fare attenzione a non danneggiare il muscolo del diaframma.

Trasferire il lato superiore del diaframma verso l'alto su un piatto di silicone riempito con aldeide paraforma al 4% in PBS sotto uno stereoscopio. Fissare il tessuto che circonda il diaframma, tendendo il diaframma. Quindi rimuovere il tessuto connettivo dalla superficie superiore utilizzando pinze e forbici.

Lasciare agire il fissativo per 20 minuti e poi rimuoverlo con tre lavaggi da 10 minuti in PBS. Successivamente, applicare 0,1 molari di glicina con il 2% di BSA in PBS per 30 minuti. Quindi incubare il diaframma in una soluzione di bungalow alfa coniugato Domine per 15 minuti.

Lavare via la tossina del bungalow con PBS come fatto per il fissativo. Quindi, cambia il bagno con metanolo freddo e raffredda il tessuto per cinque minuti a meno 20 gradi Celsius. Dopo cinque minuti prontamente, rimuovere il metanolo e lavare il fazzoletto con PBS come prima.

Ora, applica un blocco utilizzando una soluzione allo 0,2% TBP per un'ora. Cambiare la soluzione con l'anticorpo primario in 0,2% di TBP e lasciare incubare il tessuto per una notte a quattro gradi Celsius con una leggera agitazione. Il giorno successivo, utilizzare tre lavaggi di 10 minuti allo 0,2% di TBP per rimuovere l'anticorpo primario, quindi incubare il tessuto nella soluzione di anticorpi secondari per un'ora con dondolo e al buio in seguito, utilizzare tre lavaggi in PBS per rimuovere l'anticorpo secondario e mantenere il tessuto al buio.

Quindi, sotto uno stereoscopio, rimuovere più tessuto connettivo sulla superficie superiore del muscolo. Una volta pulito, montare e visualizzare il tessuto sotto un microscopio a epifluorescenza verticale, analizzare quantitativamente la morfologia del diaframma emi colorato. Utilizzare l'ingrandimento 20 e 40x Perché il diaframma viene analizzato nel suo insieme.

La maggior parte delle colorazioni fluorescenti è sfocata. Utilizzando un microscopio standard, è meglio condurre l'analisi in tempo reale. Al fine di valutare correttamente la morfologia del singolo NM js, dividere il muscolo in tre sezioni per l'analisi basata sui modelli di innervazione topografica del midollo spinale.

Partendo dalla regione più ventrale, analizza tutti i nj visibili lungo le fibre muscolari, non analizzare più in profondità delle prime tre o quattro fibre dalla superficie perché la penetrazione degli anticorpi non è mai completa. Un NMJ intatto ha un assone preterminale che è spesso e tutte le regioni del terminale nervoso si sovrappongono completamente ai recettori muscolari sottostanti dell'acetilcolina. Un NMJ parzialmente innervosito avrà alcune regioni dei recettori dell'acetilcolina sottostanti non occupate.

Un NMJ completamente denervato non mostrerà alcuna corrispondenza con i recettori dell'acetilcolina al terminale nervoso. Altri nj nella regione dovrebbero mostrare un'altra morfologia o il successo degli anticorpi La penetrazione sarebbe in discussione se più di un assone preterminale innerva un NMJ. L'NMJ si moltiplica.

In questo caso potrebbe essersi verificata una denervazione innervata, seguita da reinnervazione. Se c'è una sovrapposizione al terminale nervoso con i recettori dell'acetilcolina sottostanti e l'assone preterminale è molto sottile, allora l'NMJ è sottilmente innervato. Anche questo è un indicatore di reazione.

In un esperimento che ha coinvolto la SPRA adulta, i ratti Dolly hanno ricevuto una laminectomia mentre altri hanno ricevuto una lesione midollare monolaterale. Al C quattro. Cinque settimane dopo, è stata registrata l'ampiezza del picco di cmap dal diaframma emi omolaterale alla laminectomia o al sito della lesione.

È stato significativamente ridotto nei ratti con lesione midollare rispetto ai ratti di controllo con sola laminectomia in un esperimento diverso che ha coinvolto ratti che esprimono una proteina umana mutata, quindi D per fungere da modello di LS. La morfologia NMJ nel diaframma emi era completamente intatta negli animali di controllo wild type. Tuttavia, nei ratti transgenici, il njs ha mostrato una patologia significativa. Alcuni mostravano una denervazione completa contrassegnata dalla punta della freccia.

Altri nj erano parzialmente denervati come indicato dalla punta di freccia, e come si vede nel NMJ a destra, altri nj erano innervati più volte, e altri avevano sottili assoni preterminali qui contrassegnati da una punta di freccia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare quantitativamente l'innervazione sia funzionale che morfologica del diaframma da parte dei motoneuroni frenici. Grazie per aver guardato e buona fortuna con tutti i tuoi esperimenti.