Name: Pairwise crescita Concorso test per la determinazione della Fitness replica del virus dellimmunodeficienza umana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Scopri come determinare la fitness replicativa dell'HIV-1 con saggi di competizione di crescita pairwise. Questo metodo utilizza PCR quantitativa e sequenziamento Sanger per analizzare la dinamica virale.

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Questi studi sono stati finanziati dalle sovvenzioni dei servizi sanitari pubblici statunitensi P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 e dal Functional Profiling and Computational Biology Core del Center for AIDS Research (P30 AI027757) dell'Università di Washington.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Le opinioni qui espresse sono quelle degli autori e non devono essere interpretati come ufficiale o che rappresentano il punto di vista del Dipartimento della Difesa statunitense e il Dipartimento dell&#39;Esercito.

I protocolli presentati consisteva di due parti principali: costruzione di ricombinanti HIV-1 cloni molecolari e saggi di competizione crescita. Per distinguere due virus in coltura cellulare infettata doppiamente, è importante che i cloni molecolari concorrenti contengono tag di sequenza, che può essere rilevata da un RT-qPCR assay primer sonda o da Sanger sequenziamento. Questo protocollo fa uso di tag VIFA e VifB, che occupano la stessa regione del virus HIV-1 NL4-3 vif e codificano la stessa sequenza aminoacidica ma differiscono da sei mutazioni sinonimi. Queste mutazioni non hanno mostrato di influenzare virale replica fisica 20. Il metodo di clonazione PCR-based utilizzati in questo protocollo offre una maggiore flessibilità nella selezione dei siti clonazione, rispetto alla clonazione basata sito di restrizione. Tuttavia, l&#39;efficienza di clonazione PCR diminuisce all&#39;aumentare della dimensione dell&#39;inserto aumenta. Il limite di corrente della dimensione inserto è ~ 5 kb 34. Per clonazione PCR-based e sito diretto mutagenesis, l&#39;uso di una DNA polimerasi ad alta fedeltà è fondamentale per ridurre la probabilità di mutazioni supplementari. È anche raccomandato l&#39;uso di un numero minimo di cicli di PCR necessari a produrre adeguate quantità di prodotti. Nella nostra esperienza, non abbiamo rilevato alcun mutazioni in più dopo la clonazione e sito-passi mutagenesi basate sulla PCR qui descritti. Tuttavia i prodotti di PCR devono essere sequenziati per verificare eventuali mutazioni indesiderate. Idealmente, l&#39;intera regione codificante HIV dovrebbe essere resequenced. Almeno tre punti di tempo di campionamento dovrebbero essere esaminate entro la fase di crescita esponenziale 9. La cinetica di crescita virale devono prima essere stabilite mediante campionamento giornaliero di determinare il periodo della cultura e tempo di campionamento punti appropriati per il concorso di crescita. Un fattore che influenza la cinetica di crescita virale è la molteplicità di infezione (MOI). Questo protocollo utilizza un MOI totale di 0,005 per entrambi monoinfezione e la concorrenza la crescita, come è stato dimostrato per produrre più rorisultati busto di basso MOI 9. Tuttavia, MOI inferiore possono essere utilizzati per ottenere una fase di crescita esponenziale più se necessario, ma a scapito della consistenza risultato. Questo protocollo suggerisce un rapporto infezione iniziale di 50:50, supponendo che le differenze di idoneità dei virus sono generalmente sconosciuti anticipo. Tuttavia, l&#39;uso di tali rapporti ineguali sono appropriati quando ci sono dati preliminari suggeriscono differenze significative nella cinetica di replicazione virale. In questi casi, un rapporto di infezione di 70:30 è raccomandato per consentire il rilevamento di una grande differenza di fitness dove il virus meno allenati è posto in eccesso 9. Il protocollo per la determinazione della TCID 50, cinetica di crescita virale, e per l&#39;esecuzione di saggi di crescita della concorrenza sono stati ottimizzati utilizzando HIV-1 sottotipo B, NL4-3 COTB-p24 e PBMC da un singolo donatore il cui sangue periferico hanno dimostrato sensibilità coerente per HIV 1 infezione in vitro. Il periodo di colturae punti di tempo di campionamento presentate in questo protocollo sono suscettibili di essere adatto per studiare HIV-1 gruppo M virus in PBMC umani. Utilizzando PBMC da una singola fonte è altamente raccomandato per ottenere risultati coerenti come la replicazione virale può variare in diverse cellule del donatore 35. Sebbene meno desiderabile, PBMC raccolti da donatori multipli possono essere utilizzati come una sostituzione a condizione che la stessa piscina è utilizzata in tutti gli esperimenti. Un&#39;altra alternativa è l&#39;uso di linee cellulari. Il protocollo presentato qui è stato utilizzato con successo con la linea di cellule T CEMx174 23,36. Tuttavia, è importante che il numero di cellule seminate sono ri-ottimizzati per raggiungere la crescita delle cellule coerente. Cinetica di crescita virale devono essere ripristinati, in quanto può variare in diverse linee cellulari, per determinare i punti di tempo appropriati campionamento nei passaggi concorrenza crescita. Due metodi differenti per determinare il rapporto virale per calcolare fitness sono inclusi nel ProtoColo. Il primo utilizza RT-qPCR per misurare virale numero di copie di cDNA in ogni punto di campionamento. Viral idoneità replica stata quindi calcolata dal rapporto virale, basata sul numero di copia cDNA. In alternativa, il rapporto virale può essere determinato in base al rapporto tra l&#39;altezza di picco cromatogramma nei siti tag VifAB. I due metodi hanno fornito risultati comparabili (Figura 4). Il metodo altezza del picco cromatogramma può essere applicato ad altri ceppi HIV-1 senza un tag sequenza ingegnerizzato. Per RT-qPCR, l&#39;uso di primer o sonde per distinguere varianti virali deve prima essere attentamente valutato (vedi 20). Tuttavia, RT-qPCR conferendo una maggiore sensibilità per campioni con una piccola quantità di RNA virale, come quelli del primo punto temporale all&#39;interno della fase di crescita esponenziale. La misura diretta della cDNA virale permette anche la rilevazione di problemi tecnici che possono sorgere dalle operazioni di estrazione di RNA e sintesi del DNA. Utilizzo di cloni molecolari con sequence tags fornisce una soluzione conveniente to metodi RT-qPCR, come sono necessari solo due coppie di primer e sonde per studiare più virus. Questa strategia evita anche il problema della variazione di picco altezza in sequenza cromatogrammi causa di basi adiacenti 37, come sequenziamento viene eseguito nello stesso sito attraverso tutti i virus in studio. I prodotti di PCR prodotti per RT-qPCR e sequenziamento Sanger può anche essere utilizzato con altri metodi per determinare il rapporto virale, come massa sequenziamento del singolo clone 12,13, HTA 4,7,17,19 o saggio oligonucleotide legatura (OLA) 38 .

Viral idoneità replica è definita come la capacità di un virus per produrre progenie infettiva in un dato ambiente 1 ed è un fattore importante che contribuisce a determinare la prevalenza di una variante del virus a livello della popolazione nel tempo 2. Come studi in vivo di fitness non sono realizzabili con virus umani patogeni, come l&#39;HIV-1, vari in vitro e ex vivo replica dosaggi di fitness sono stati sviluppati per studiare gli effetti sul benessere derivanti dalla resistenza ai farmaci e le mutazioni di fuga del sistema immunitario, epistasi e l&#39;evoluzione delle popolazioni virali 3-6. Tra i diversi dosaggi di fitness, analisi della concorrenza crescita sono riconosciuti a produrre misure più sensibili e validi di differenze di fitness, come due o più varianti virali competono per la stessa popolazione di cellule sotto precisamente le stesse condizioni ambientali, come avviene in vivo 1,7,8. Prima di avviare esperimenti di competizione di crescita, molti variables necessario determinare, compreso l&#39;uso di diverse molteplicità di infezione (MOI), rapporto input virale, e tempi di campionamento per l&#39;analisi. Abbiamo studiato gli effetti di questi parametri sulla cinetica di crescita virale e sul risultato di esperimenti di competizione, e abbiamo individuato i fattori chiave necessari per le misure di resistenza del virus HIV-1 di fitness in coltura cellulare 9. In aggiunta alle variabili saggio, ci sono una varietà di metodi per la quantificazione varianti virali in esperimenti di competizione crescita. Bulk 10,11 o sequenziamento clonale 12,13 è stata utilizzata per determinare il rapporto dei virus concorrenti basati sulle frequenze nucleotidiche del sito (s) di interesse. Idoneità relativa è derivato da cambiamenti in questo rapporto nel tempo. Questo metodo è conveniente come servizi di sequenziamento del DNA sono ampiamente disponibili. Il metodo (PASS) allele-specifica sequenziamento parallelo permette il sequenziamento in più siti e l&#39;individuazione di ricombinanti 14 </sup&gt;, Ma richiede anche reagenti appositamente sviluppati e sistemi di rilevazione. Essenzialmente, questi metodi sono stati sviluppati per studiare ceppi virali con un piccolo numero di differenze nucleotidiche in una regione di interesse. Altri metodi usano un piccolo gene reporter 15 o sinonimi mutazioni 4,16-18 come tag per distinguere i virus concorrenti di sequenziamento, le analisi di monitoraggio eteroduplex (HTA) 4,7,17,19 o invertire in tempo reale reazione di trascrizione-quantitativo a catena della polimerasi (RT-qPCR) 15,16,18,20, ognuno dei quali può essere reso applicabile a studiare ceppi competere indipendentemente similarità di sequenza. Un passo ulteriore è necessario per introdurre modifiche in genomi virali e il saggio RT-qPCR richiede anche reagenti e strumentazioni specifiche. Abbiamo scoperto che il sequenziamento di massa rese Sanger risultati comparabili 9. A seguito di concorso crescita, virale idoneità replica viene presentata come il fitness parente, o un rapporto di idoneità tra two varianti virali. L&#39;idoneità relativa di un virus può essere definita come la percentuale finale di una variante virale viene normalizzato mediante la sua proporzione iniziale in inoculo o come la differenza netta tasso di crescita tra i due virus concorrenti. Abbiamo scoperto che il secondo metodo, utilizzando punti di dati longitudinali solo all&#39;interno della fase di crescita esponenziale, ha prodotto i risultati più robusti 9,20. In vitro fitness sono utilizzati principalmente per studiare cloni biologici 6-8 e cloni molecolari infettivi di HIV-1. Quest&#39;ultimo, essendo suscettibili di manipolazione genetica, sono spesso impiegati per studiare l&#39;effetto sulla forma fisica di particolari mutazioni o sequenze specifiche di interesse 3-5,21,22. I seguenti protocolli descrivono un flusso di lavoro dal punto di costruire nuovo full-length HIV-1 cloni molecolari infettivi usando HIV-1 vettori contenenti un tag sequenza, introducendo mutazioni di interesse, rendendo stock virali e stabilendo cinetica di crescita virale, Di eseguire il test concorso crescita e calcolando fitness relativa (Figura 1). Utilizzando i nostri procedure ottimizzate, abbiamo creato tre ricombinanti HIV-1 mutanti e determinato la loro idoneità replica. Il clone molecolare ricombinante è stato costruito sostituendo il gag-p24 regione HIV-1 gene di pNL4-3, un plasmide contenente un integrale genoma infettiva del virus HIV-1 ceppo NL4-3 laboratorio, con un COTB sintetico (Centro-Of Albero, sottotipo B) sequenza gag-p24 23 per creare il ceppo prototipo. Modifiche amminoacidi singoli (T186M, T242N e I256V) sono stati poi introdotti per creare tre cloni mutanti. Ogni mutante era gareggiato contro il virus prototipo per osservare l&#39;impatto idoneità di ogni mutazione nel data background genetico. I tre mutanti dimostrato una diversi livelli di replicazione fsitness da lieve a significativamente inferiore al virus prototipo. La mutazione T242N è stato precedentemente segnalato per avere è d moderatass costano 24-26, simile al risultato mostrato in questo studio. Il costo idoneità delle altre due mutazioni non era stato riportato in precedenza.

<table><tbody><tr><td>Costruzione di cloni ricombinanti Primer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chimerico/mutageno/Sequenziamento Primer</td><td>IDT</td><td></td><td>Oligo DNA personalizzati</td></tr><tr><td>pNL4-3VifA e pNL4-3VifB Plasmide</td><td></td><td></td><td>Si prega di contattare il Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)DNA</td></tr> <tr><td>polimerasi ad alta fedeltà</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-549S Tampone</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ad alta fedeltàThermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Biosistemi applicati&reg; GeneAmp&reg; Sistema PCR 9700</td></tr><tr><td>Colorante di caricamento del DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus Scala di DNA</td><td>Invitrogen</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>DpnI enzima</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>TOP10 chimicamente competente Escherichia coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Luria Brodo base in polvere</td><td>Invitrogen</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Research Products International</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Maxi Kit di plasmidi EndoFree</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Trasfezione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 Reagente di trasfezione DNA</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T-17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>http://www.atcc.org/</td></tr> <tr><td>0.22 &#956; m tubo orizzontale filtrante</td><td>VWR International</td><td>89220-716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Coltura</td><td></td><td></td><td></td>cellulare</tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&prime; s Dulbecco modificato&prime; s Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 media</td><td>Life Technologies</td><td>61870-036</td><td></td></tr><tr><td>Fitoemoagglutinina (PHA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>Interleuchina umana-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>JR Scientific</td><td>43640</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina e streptomicina</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>VWR Scientific</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 48 pozzetti</td><td>VWR Scientific</td><td>62407-338</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-3015-4</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a fondo tondo a 96 pozzetti</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Tubo per microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Mt. Baker Bio</td><td>MBD-1500</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 1,5 ml con O-ring</td><td>VWR Scientific</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 ml</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C-3317-6</td><td></td></tr><tr><td>ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392</td><td></td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti-HIV-1 SF2 p24 antisiero</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>4250</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio HRP</td><td>KPL</td><td>474-1516</td><td></td></tr><tr><td>TMB Microwell Perossidasi Substrato</td><td>KPL</td><td>52-00-01</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300-500</td><td>Provoca gravi ustioni da tutte le vie di esposizione. Utilizzare dispositivi di protezione individuale. Utilizzare solo sotto una cappa chimica. Risciacquare immediatamente con abbondante acqua per almeno 15 minuti.</td></tr><tr><td>Programma standard HIV p24</td><td>per l'AIDS e il virus del cancro (NCI-Frederick)</td><td></td><td>Per i dettagli dell'ordine, contattare Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>VMax Kinetic ELISA Lettore di micropiastre</td></tr><tr><td>Isolamento dell'RNA Sintesi</td><td></td><td></td><td></td>del cDNA</tr><tr><td>QIAxtractor</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td></tr><tr><td>Mini kit di RNA virale QIAamp</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>SuperscriptIII</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Tampone del primo filamento&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNASI</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>RnaseH</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macchina qPCR in tempo reale</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>TaqMan&reg; Gene Expression Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>Primer diretto e inverso</td><td>IDT</td><td></td><td>Ordine personalizzato</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ordine personalizzato</td></tr><tr><td>Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti</td><td>Life Technologies</td><td>I19N3Q216</td><td></td></tr><tr><td>PCR+sequenziamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi (Biolasi)</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>tampone NH4&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>Primer per sequenziamento</td><td>IDT</td><td></td><td>Ordine personalizzato</td></tr><tr><td>QIAxcel</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system</td></tr><tr><td>Fornitore di servizi di sequenziamento del DNA</td><td>http://www.htseq.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumento web GRC</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Strumento web ChromatQuan</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pairwise crescita concorso test per la determinazione della fitness replica del virus dell&#39;immunodeficienza umana

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

I test di idoneità in vitro sono strumenti essenziali per determinare l'idoneità alla replicazione virale per virus come l'HIV-1. Per estrapolare l'idoneità alla replicazione virale sono state utilizzate varie misurazioni, che vanno dal numero di particelle virali per unità infettiva, al tasso di crescita in coltura cellulare e all'idoneità relativa derivata da saggi di competizione di crescita a cicli multipli. I test di competizione per la crescita forniscono una misurazione particolarmente sensibile della fitness poiché i virus competono per bersagli cellulari in condizioni di crescita identiche. Ci sono diversi fattori sperimentali da considerare quando si eseguono saggi di competizione per la crescita, tra cui la molteplicità dell'infezione (MOI), i tempi di campionamento e i metodi di rilevamento virale e di calcolo dell'idoneità. Ogni fattore può influenzare il risultato finale e quindi deve essere considerato attentamente durante il disegno sperimentale. Il protocollo qui presentato include passaggi che vanno dalla costruzione di un nuovo clone ricombinante di HIV-1 all'esecuzione di saggi di competizione per la crescita e all'analisi dei risultati sperimentali. Questo protocollo utilizza valori di parametri sperimentali che in precedenza avevano dimostrato di produrre risultati coerenti e robusti. Vengono discusse le alternative, poiché alcuni parametri devono essere regolati in base al tipo di cellula e ai virus studiati. Il protocollo contiene due metodi alternativi di rilevamento virale per garantire la massima flessibilità, in quanto la disponibilità di strumenti, reagenti e competenze varia da laboratorio a laboratorio.

Per studiare l&#39;impatto idoneità dei cambiamenti di aminoacidi singoli in HIV-1 Gag-p24, abbiamo usato oligonucleotide mutagenesi diretta a introdurre mutazioni in un plasmide pNL4-3 contenente il virus HIV-1 COTB-p24 gene 23,32,33. Scorte virali sono stati generati da trasfezione di cellule 293T e raccolte dopo 48 ore. Abbiamo stimato la dose del 50% coltura tissutale infettiva (TCID 50) di ciascun titolo virale con il metodo Reed-Muench 31. Il TCID50 del prototipo e virus mutanti variavano da 10 aprile - 10 MAGGIO UI / ml (Figura 3A). La cinetica di crescita del virus ricombinanti sono stati stabiliti in PBMC da un singolo donatore ad una MOI di 0,005. RT-qPCR è stato utilizzato per misurare il numero di copie virali cDNA al giorno per sei giorni. Tutti i virus mutanti e prototipi crescevano esponenzialmente tra il giorno 2 e il giorno 4, a seguito della quale la crescita virale rallentato, come indicato da una diminuita pendenza della crescita virale numero di copie di RNA (&lt;strong&gt; Figura 3B). La diminuzione cDNA numero di copie tra giorno 0 (corrispondente al inoculo) e il giorno 2 è dovuta all&#39;assorbimento di virus di cellule e la rimozione di virioni non legati dal giorno 1 di lavaggio (passo 5.1.6). Nella fase di crescita esponenziale, tutti tre mutanti avevano un tasso di crescita più lenta (g) che il virus prototipo (Figura 3C). Tutti e tre i mutanti sono stati gareggiato contro il virus prototipo nei test concorrenza crescita a un totale di 0.005 MOI. Cinetica di crescita virale in culture doppiamente infette erano simili a quelle di monoinfezione; la fase di crescita esponenziale virale era tra i giorni 2 e 4, e la crescita virale ha raggiunto un plateau intorno al giorno 5 (Figura 4A). Le differenze di crescita virale sono stati derivati ​​dalla variazione del rapporto virale nel tempo. Il rapporto virale è stato calcolato sulla base di cDNA numero di copie di riferimento e dei virus mutanti mediante RT-qPCR, e confrontando altezzein sequenza cromatogrammi in siti nucleotide distinguendo i due virus (Figura 4B). Le differenze di tasso di crescita determinati utilizzando la copia di RNA virale metodi numerici picco di altezza e hanno dato risultati simili (Figura 4C). Tutti e tre i mutanti avevano idoneità replica inferiore rispetto ai virus prototipo con il I256V mutante avere l&#39;idoneità più basso (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> Figura 1: Diagramma di flusso dei protocolli presentati in questo documento il virus protocolli Preparazione preoccupazione costruzione di HIV-1 cloni ricombinanti e la generazione di titoli virali.. I protocolli Assays fitness sono per stabilire cinetica di crescita virale e la determinazione fitness virale relativa. Le linee tratteggiate rappresentano flussi alternativi per i protocolli. Ad esempio, una mutazione può essere introdotto direttamente nella HIV-1 NL4-3clone molecolare senza generare un clone ricombinante. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> Figura 2:. Costruzione di HIV-1 NL4-3 COTB Gag-p24 cloni molecolari ricombinanti con estensione sovrapposizione PCR (A) Progettare i primer chimerici. Il 5 &#39;metà dei primer contengono la sequenza vettoriale NL4-3 e il 3&#39; metà contengono le estremità della sequenza dell&#39;inserto. (B) primer chimerici sono usati per amplificare il frammento dell&#39;inserto, COTB Gag-p24. (C) I frammenti inserti sono utilizzati come primers per una seconda PCR per generare un nuovo plasmide ricombinante. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> Figura 3:. Caratteristiche di crescita virale in PBMC (A) Accedi 10 TCID 50 </sub&gt; delle scorte virali. (B) cinetica di crescita virale in monoinfections iniziato con un MOI = 0,005. (C) i tassi di crescita virale in sei giorni, compreso la fase esponenziale di crescita (2-4 giorni) derivato da pannello (B). I valori riportati rappresentano la media di tre repliche da un esperimento. Le barre di errore rappresentano 95% intervalli di confidenza. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> Figura 4: crescita virale e relativa idoneità determinazioni (A) la crescita virale in colture PBMC doppiamente infette.. (B) Rapporti di T242N e prototipo virus determinati con RT-qPCR o il metodo di sequenziamento picco altezza. (C) differenze nette virali tasso di crescita (d) tra il mutante ei virus prototipo in culture doppiamente infette, come illustrato in (A). d valori sono stati calcolati fROM i dati riportati in rapporto virale (B). I valori riportati rappresentano la media di tre repliche da un esperimento. Le barre di errore rappresentano 95% intervalli di confidenza.

La competizione di crescita tra virus quasi isogenici fornisce una misura sensibile per determinare l'idoneità alla replicazione relativa. I protocolli qui descritti includono la costruzione di cloni ricombinanti di HIV-1, la competizione per la propagazione e la crescita del virus e metodi di analisi ottimizzati per produrre risultati sensibili e coerenti.

Pairwise crescita Concorso test per la determinazione della Fitness replica del virus dell&#39;immunodeficienza umana

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la fitness relativa di replicazione di ceppi di HIV-1 di interesse. Ciò si ottiene innanzitutto costruendo cloni molecolari virali o plasmidi di DNA contenenti sequenze complete di HIV-1 di interesse. Il secondo passaggio consiste nella generazione di stock virali per ciascun clone molecolare mediante trasfezione del DNA.Successivamente, la cinetica di crescita e la fase esponenziale di crescita di ciascun ceppo di HIV-1 vengono stabilite mediante campionamenti longitudinali di colture cellulari mono-infette. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire competizioni di crescita a coppie o infezioni doppie in colture cellulari. Infine, la trascrizione inversa, la PCR quantitativa in tempo reale e le altezze dei picchi dei cromatogrammi di sequenza del DNA ottenuti mediante sequenziamento del DNA di Sanger vengono utilizzati per determinare i rapporti virali, che a loro volta vengono impiegati per calcolare la capacità replicativa virale relativa.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'infezione para-mono o l'infezione doppia a due punti temporali, è che consente misurazioni più sensibili e robuste della differenza di idoneità replicativa tra due ceppi virali. I protocolli presentati in questo articolo comprendono la costruzione di cloni ricombinanti di HIV-1, l'introduzione di mutazioni di interesse mediante mutagenesi mirata, la preparazione di ceppi virali e l'esecuzione di saggi di idoneità per stabilire la cinetica di crescita virale e determinare l'idoneità virale relativa. Questo video illustrerà la competizione nella crescita e due metodi differenti.Per determinare il rapporto virale per il calcolo dell'adattamento, fare riferimento al testo del protocollo per tutte le altre procedure. Per preparare il saggio di competizione di crescita, seminare tre volte 10 alla quinta cellule mononucleate del sangue periferico stimolate con PHA, o PBMC, in un volume totale di 500 microlitri per pozzetto in una piastra a 48 pozzetti con fondo piatto. Mantenere la piastra a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% fino all'inoculazione. Successivamente, preparare tre millilitri di inocolo contenente 6.000 UI per ciascun virus.In un esperimento tipico vengono testati diversi mutanti, ma ai fini di questa dimostrazione verrà testato un solo mutante rispetto al virus prototipo. La corretta preparazione dell'inoculo virale rappresenta una fase fondamentale di questa procedura, poiché potrebbe essere necessaria una diluizione seriale del ceppo virale con un titolo infettivo molto elevato. Trasferire 1,5 millilitri di ciascun inoculo virale in un tubo sterile per creare l'inoculo di infezione doppia.Aggiungere 500 microlitri del doppio inocolo ai PBMC stimolati con PHA in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. Il volume finale di coltura è di un millilitro per pozzetto. Aliquotare 200 microlitri per pozzetto del doppio inocolo in due piastre a 96 pozzetti per l'isolamento dell'RNA. Conservare una piastra come riserva. Incubare le cellule inoculate a 37 gradi Celsius in un'atmosfera al 5% di anidride carbonica per 16-24 ore. Dopo 16-24 ore dall'inoculazione, lavare le colture, rimuovere e scartare 750 microlitri del sopranatante di coltura e aggiungere 750 microlitri di mezzo completo Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium fresco o cIMDM.Avvolgere la piastra con della pellicola trasparente e centrifugare per 10 minuti. A 300 ×g, rimuovere e scartare 750 microlitri del soprannatante. Aggiungere 750 microlitri di cIMDM fresco. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un'atmosfera al 5% di anidride carbonica. I tempi di campionamento devono essere scelti in modo da includere almeno tre punti temporali all'interno della fase esponenziale di crescita virale.Per raccogliere un campione, trasferire 500 microlitri di supernatante di coltura in un tubo da centrifuga da 1,8 millilitri e centrifugare per un minuto a 3000 g. Trasferire 200 microlitri di supernatante privo di cellule in due piastre campione da 96 pozzetti per l'isolamento dell'RNA. Nuovamente, conservare una piastra come riserva. Conservare i supernatanti a meno 80 gradi Celsius fino all'isolamento dell'RNA.Aggiungere 500 microlitri di cIMDM fresco a ciascuna coltura e reinserire la piastra nell'incubatore fino al successivo prelievo. Successivamente, l'RNA viene isolato dai campioni, seguito dalla sintesi di CDNA. Verranno illustrate due metodiche per determinare i rapporti virali.Il primo metodo utilizza la trascrizione inversa, la PCR quantitativa in tempo reale o RT qPCR, e il secondo si basa sulle altezze dei picchi del cromatogramma. Per la qPCR, preparare una serie di diluizioni seriali standard in triplice replicato del plasmide pNL4-3VifA, diluendo di dieci volte ad ogni passaggio, da tre volte 10 alla sesta copie per microlitro fino a 30 copie per microlitro. Allestire una piastra da 96 pozzetti per la reazione di qPCR.Ogni piastra deve contenere almeno un controllo negativo, la serie di diluizioni standard in triplice replicato e duplicati di ciascun campione di cDNA. Utilizzare un primer probe vFIA per rilevare i segnali nei controlli negativi, nella serie di diluizioni standard e in un duplicato del campione di cDNA. Utilizzare il primer probe vIFB sull'altro duplicato del campione di cDNA; per ogni reazione di qPCR, impiegare 12,5 microlitri del mix master per qPCR, 0,2 micromolare del probe per qPCR, 0,8 micromolare ciascuno dei primer forward e reverse e un microlitro di cDNA; per la serie di diluizioni standard, aggiungere la diluizione in serie di pNL4-3VifA al posto del cDNA; per i controlli negativi, utilizzare acqua o tampone al posto del cDNA; impostare i parametri di ciclaggio PCR seguendo le istruzioni del produttore per l'utilizzo della macchina per qPCR. Calcolare la curva standard utilizzando i dati di amplificazione ottenuti dalla serie di diluizioni standard.Confrontare i dati di amplificazione dei campioni di cDNA con la curva standard per determinare il numero di copie. Utilizzare il calcolo del tasso di crescita virale o lo strumento web GRC per calcolare la fitness virale relativa. Inserire il numero di copie di cDNA ottenuto dal passaggio di RT qPCR nel formato specificato indicato. La selezione di calcola produrrà la differenza di tasso di crescita netto tra due virus in competizione. Per determinare i rapporti virali utilizzando le altezze dei picchi del cromatogramma, amplificare mediante PCR frammenti di HIV-uno VIF contenenti il marcatore di sequenza VIFAB utilizzando primer VIF forward e VIF reverse. Per ogni reazione PCR, utilizzare un microlitro di cDNA, tampone 1XNH-quattro, 1,5 millimolare di MgCl2, 0,2 millimolare di dNTP, 2,5 U di polimerasi Taq e 0,45 micromolare di ciascun primer.Aggiungere acqua fino a un volume finale di 50 microlitri. Impostare i parametri del ciclo PCR su tre cicli a 94 gradi Celsius per un minuto, 55 gradi Celsius per un minuto e 70 gradi Celsius per un minuto, seguiti da 34 cicli a 94 gradi Celsius per 15 secondi, 58 gradi Celsius per 30 secondi e 70 gradi Celsius per un minuto. Infine, una fase di mantenimento a quattro gradi Celsius. Successivamente, purificare i prodotti PCR utilizzando un kit commercialmente disponibile e inviare i prodotti PCR purificati a un fornitore di servizi di sequenziamento del DNA per il sequenziamento di Sanger.Verificare il punteggio medio della qualità delle letture fornito dal servizio di sequenziamento. Se l'accuratezza media delle chiamate di base è inferiore all'85%, ripetere l'amplificazione PCR, la purificazione dei prodotti PCR e il sequenziamento di Sanger. Utilizzare lo strumento web Chromat quantitative per calcolare il rapporto virale in ogni punto temporale.I dati richiesti sono la sequenza leader e il file del cromatogramma di sequenza in formato .ab1. Lo strumento misura l'intensità del picco nel sito specificato.Il rapporto tra le intensità dei picchi corrisponde al rapporto tra i due virus. Utilizzare lo strumento web GRC per calcolare la fitness virale relativa. L'input è l'altezza del picco del cromatogramma di sequenza ottenuta mediante lo strumento web Chromat quantitative nel formato specificato mostrato. Lo strumento web GRC calcolerà la differenza di tasso di crescita netta tra i due ceppi virali in competizione; sono stati costruiti un prototipo e tre virus mutanti dell'HIV e la loro crescita nei PBMC è stata caratterizzata. Il TCID50 variava da 10 alla quarta a 10 alla quinta UI per millilitro. Tutti i virus sono cresciuti in modo esponenziale tra il secondo e il quarto giorno.Nella fase di crescita esponenziale, tutti e tre i mutanti presentavano una velocità di crescita inferiore rispetto al virus prototipo. Ciascun mutante è stato messo in competizione con il virus prototipo in saggi di competizione per la crescita a un MOI totale di 0,005; la cinetica di crescita virale nelle colture doppio-infette è risultata simile a quella dell'infezione mono-infettiva. La fase esponenziale di crescita virale si è verificata tra il secondo e il quarto giorno, e la crescita virale ha raggiunto un plateau intorno al quinto giorno.Le differenze nel tasso di crescita virale sono state ricavate dalla variazione del rapporto virale nel tempo. Il rapporto virale è stato calcolato in base al numero di copie di cDNA dei virus di riferimento e mutante, utilizzando la RT-qPCR e confrontando le altezze dei picchi nei cromatogrammi di sequenza in siti nucleotidici che distinguono i due virus; in particolare, il mutante T242-N viene confrontato con il prototipo. In questo esempio, le differenze nel tasso di crescita determinate mediante i due metodi hanno prodotto risultati simili.Tutti e tre i mutanti presentavano una capacità replicativa inferiore rispetto al virus prototipo, con il mutante I256-V che mostrava la capacità più bassa. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire saggi di competizione alla crescita a coppie per determinare la capacità replicativa relativa dell'HIV-1.

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Descriviamo un protocollo per identificare i ruoli chiave di molecole di segnalazione di accoglienza nella replicazione litica di un herpesvirus modello, gamma herpesvirus 68 (γHV68). Utilizzando ceppi di topi geneticamente modificati e fibroblasti embrionali per γHV68 replica litico, il protocollo consente sia la caratterizzazione fenotipica e molecolare del virus interrogatorio interazioni ospite-in replicazione virale litico.

Dissezione Host-virus Interazione in replica litico di un Herpesvirus modello

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Qui si descrive la citotossicità cellulare e singoli saggi di infettività rotonde che consentono lo screening rapido e preciso dei composti di determinare la loro citotossicità cellulare (CC 50) e valori di IC 50 contro WT e resistente di HIV-1 farmaco.

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

La patogenesi dell'HIV-1 è definita sia dalle caratteristiche virali che dai fattori genetici dell'ospite. Qui descriviamo un metodo robusto che consente misurazioni riproducibili per valutare l'impatto della variazione della sequenza genica gag sulla capacità di replicazione in vitro del virus.

Un enzima di restrizione metodo basato clonazione per valutare l&#39;<em&gt; In vitro</em&gt; Replica Capacità di HIV-1 Sottotipo C Gag-MJ4 chimerici virus

Vengono descritti i metodi per valutare l'efficacia e la tossicità delle molecole di RNA che mirano alle fasi post-integrazione del ciclo di replicazione dell'HIV-1. Questi metodi sono utili per lo screening di nuove molecole e l'ottimizzazione del formato di quelle esistenti.

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l&#39;uso in gene terapia farmacologica

Infezione dei tessuti umani con il virus di immunodeficenza umana (HIV) ex vivo fornisce un prezioso modello 3D della patogenesi del virus. Qui, descriviamo un protocollo per elaborare e infettare i campioni di tessuto da tonsille umane e delle mucose genitali femminile con HIV-1 e mantenerli nella cultura presso l'interfaccia liquido-aria.

Ex Vivo Infezione della Mucosa genitale umana del tessuto linfoide e donna con il Virus dell'immunodeficienza umana 1 e Histoculture

Descriviamo un'analisi basata sulle celle per segnalare il HIV-1 fusione tramite l'espressione della proteina fluorescente verde rilevabile da microscopia di flusso cytometry o fluorescenza. Può essere utilizzato per testare gli inibitori dell'entrata virale (in particolare presso il passo di fusione) in sistemi di infezione senza cellula e cellula--cellula.

Un High-throughput Cre-Lox attivato membrana virale Fusion test per identificare gli inibitori di fusione della membrana virale di HIV-1

Questo protocollo fornisce un metodo per stabilire topi umanizzati (hu-NSG) tramite iniezione intraepatica di cellule staminali ematopoietiche umane nella radiazione-condizionato topi NSG neonatali. Il mouse di hu-NSG è suscettibile di infezione da HIV e combinatorio antiretrovirale di combinazione (cART) e serve come un modello fisiopatologico adatto per le indagini di replica e la latenza di HIV.

Umanizzato NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse modello per studi di latenza e di replicazione dell'HIV

Qui, descriviamo alcuni metodi consolidati per determinare lo stress del reticolo endoplasmatico (ER) e l'attivazione della risposta proteica dispiegata (UPR), con particolare enfasi sull'infezione da HIV-1. Questo articolo descrive anche una serie di protocolli per studiare l'effetto dello stress ER/UPR sulla replicazione dell'HIV-1 e sull'infettività del virione.

Misurazione dello stress del reticolo endoplasmatico e della risposta proteica dispiegata nelle cellule T infette da HIV-1 e analisi del suo ruolo nella replicazione dell'HIV-1

Scopri come determinare la fitness replicativa dell'HIV-1 con saggi di competizione di crescita pairwise. Questo metodo utilizza PCR quantitativa e sequenziamento Sanger per analizzare la dinamica virale.

Pairwise crescita Concorso test per la determinazione della Fitness replica del virus dell'immunodeficienza umana

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