Name: 3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Scopri la coltura organotipica 3D per le cellule epiteliali timiche midollari (mTEC) usando un scaffold fibrinoso con fibroblasti umani. Questo metodo migliora proliferazione, differenziazione e mantenimento dell'espressione genica promiscua rispetto ai sistemi 2D.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro Tedesco per la Ricerca sul Cancro (DKFZ), dal consorzio dell'UE "Tolerage", dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) e dalla Landesstiftung Baden-Württemberg.

Questo studio è stato approvato dal comitato etico del Regierungspräsidium Karlsruhe. Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni esenti da organismi patogeni specifici presso il Cancer Research Center tedesco (DKFZ). Per tutti i cuccioli di esperimenti di coltura del mouse che vanno da 1 a 7 giorni di età sono stati utilizzati. 1. Isolamento di mTECs da Timo NOTA: Le seguenti operazioni di digestione sono state eseguite come descritto in precedenza 1 in condizioni sterili con alcune modifiche come segue. <ol><li> Decapitare i cuccioli di topo e rimuovere il timo. Posizionare il thymi su ghiaccio in una piastra di Petri contenenti terreno RPMI 1640 (contenente 5% FCS). </li><li> Tagliare il thymi in sottili, piccoli pezzi e posto in una provetta a fondo tondo con ~ 5-30 ml RPMI media e mescolate delicatamente con un magnete per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> In seguito, decantare il surnatante contenente principalmente timociti e digerire la sequenza tessuto rimanente con un giro di collagenasé di tipo IV (0,2 mg / ml e 57 U / ml concentartion finale) per 15 minuti ciascuno a 37 ° C, seguita da collagenasi / dispasi (0,2 mg / ml e la concentrazione finale 1,2 U / ml) per 25 min a 37 ° ciascun C in un bagno d&#39;acqua con agitazione magnetica fino alla thymi sono completamente digerito. Usare 1 ml enzimatica per 2-3 thymi. </li><li> Agitare il tessuto volta ogni 7-10 minuti con una pipetta Pasteur. Si riuniscono gli collagenasi / frazioni dispasi e filtrare attraverso una garza di 70 micron. </li><li> Arricchire i mTECs da cellule magnetico ordinamento (MACS). Eseguire la purificazione di mTECs da cellule magnetico classificare come descritto in precedenza 11, e mostrato in Figura 1. NOTA: Per l&#39;ordinamento magnetico di mTECs abbiamo usato i seguenti anticorpi: anti-CD80-PE (16-10A1, uso a diluizione 1: 100) e anti-EpCAM-bio (G8.8, uso a diluizione 1: 100) 12. MTECs immaturi e maturi con MACS sono stati definiti come: CD45 - EpCAM + CD80 - e CD45 - CD80 + respectively. </li><li> Dopo MACS purificazione (purezza del mTECs immaturi = 83,1 ± 6,3% e mTECs maturi = 79.23 ± 3,42%), seminare i mTECs sulle colture organotipiche come descritto di seguito (punto 2.3). </li><li> In alternativa, ordinare mTECs di FACS (utilizzando 100 ugelli micron) dopo CD45 MACS esaurimento utilizzando i seguenti anticorpi: anti-CD45-PerCP (30-F11, l&#39;uso in diluizione 1: 100), anti-Ly51-FITC (6C3, utilizzare a 1 : 100 diluizione), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, uso in diluizione 1: 500) e l&#39;uso anti-CD80-PE (16-10A1, a diluizione 1: 100). Escludere le cellule morte con ioduro di propidio (1: 5.000) (4 ° giorno). MTECs immaturi e maturi utilizzando FACS sono stati definiti come: PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - e PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 +, rispettivamente. </li></ol> 2. 3D organotipiche co-culture (OTC) NOTA: I costrutti 3D-cutanea per la coltivazione organotipica di keratinocytes state preparate come descritto in precedenza 9,13. In tutte le fasi cellule sono state incubate a 37 ° C e 5% CO 2. I farmaci da banco che utilizzano mTECs sono stati preparati con lievi modifiche nel modo seguente. <ol><li> Preparazione di fibroblasti umani NOTA: i fibroblasti dermici umani sono stati ottenuti da colture espianto di de-epidermised derma come descritto in precedenza 9. <ol><li> In breve, tagliare le strisce di pelle umana (~ 5 cm di lunghezza) e trattare con termolisina (0,5 mg / ml in soluzione salina con 10 mM Hepes pH 7,4) O / N a 4 ° C. </li><li> Successivamente, separare l&#39;epidermide dal derma con pinze. </li><li> Tagliare finemente il derma in piccoli pezzi, posto in un piatto 10 centimetri Petri e lasciare asciugare per 1-2 ore sotto un flusso d&#39;aria sterile. Supplemento espianti regolarmente con DMEM contenente 20% FBS. </li><li> Dividere i fibroblasti crescita fuori quando confluenti (di solito circa 3 settimane) con 0,1% tripsina fare in modo che gli espianti continuano ad aderire alla piastra per ulteriori conturni consecutivi di conseguenza. </li><li> Espandere i fibroblasti dalle stesse espianti per un massimo di 3 volte in DMEM con 10% FBS e crio-conservare le 14. Utilizzare lo stesso lotto di fibroblasti per ogni serie sperimentale. NOTA: I fibroblasti non sono stati irradiati per il set-up degli equivalenti dermici. </li></ol></li><li> Preparazione del impalcatura <ol><li> Tagliare i 0,4-0,6 mm viscosa spessore, materiale fibroso non tessuto (dati del prodotto a sostegno foglio Excel) in ambienti ben delimitate con un netto 11 millimetri di diametro puncher metallo per adattarsi esattamente in 12 inserti bene col filtro. Poi inserirla nel pozzo 12 inserto del filtro (poliestere membrana capillare pori, 3 micron dimensione dei pori) da impalcatura. Posizionare la configurazione filtro completo in un 12-pozzetti sterili. </li><li> Preparare il gel di fibrina utilizzando una colla di fibrina-kit per la chirurgia costituito da una combinazione di fibrinogeno e trombina. Pre-diluire il fibrinogeno e la trombina-componente del kit a 8 mg / ml e 10Unità / ml, rispettivamente. Per un singolo pozzetto di una piastra 12 pozzetti procedere come segue. <ol><li> Diluire 100 microlitri fibrinogeno (8 mg / ml) con 100 ml di tampone fosfato salino (PBS) senza Ca 2 + e Mg 2 +, pH 7,0. Diluire 100 ml di trombina (10 unità / ml) con 100 microlitri FCS contenenti 270.000 fibroblasti. </li><li> Dispensare 200 microlitri della trombina contenente fibroblasti cellule preconfezionato sul ponteggio, a cui si aggiungono 200 pl fibrinogeno (miscela 1: 1), ottenendo una concentrazione finale di fibrinogeno di 2 mg / ml e di trombina di 2,5 unità / ml. Mescolare bene e distribuire in modo uniforme su tutta l&#39;area del ponteggio pipettando dolce (giorno 1). NOTA: Dopo 30 minuti a 37 ° C un coagulo che racchiude i fibroblasti sarà formata, riempiendo completamente gli spazi interni del ponteggio e formando una superficie superiore liscia. </li></ol></li></ol></li><li> Co-coltura con mTECs <ol><li> Per la pre-cultura, immergere le colture d&#39;organo aDMEM con 10% FBS, 50 mg / ml di acido L-ascorbico e 1 ng / ml di TGF-β1 con una variazione media ogni altro giorno per 4-5 giorni. </li><li> Il giorno della MTEC semina, sostituire il mezzo attraverso RFAD media (1: 1 DMEM + DMEM / F12) con 10% FBS, 10 -10 M tossina colerica, 0,4 mg / ml idrocortisone, 50 mg / ml di acido L-ascorbico, RANK ligando (0,1 mcg / ml) e 500 unità / ml di aprotinina, impedendo così fibrinolisi precoce da serina proteasi secrete da fibroblasti. </li><li> 7-8 ore più tardi, set-up co-culture seminando 250.000 mTECs (sia mTECs completi, o CD80 e CD80 lo sottoinsiemi hi), in un volume di 100 ml per pozzetto in cima al ponteggio fibroblasti. Contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer (4 ° giorno). NOTA: In ogni momento le timo colture organotipiche 3D sono sommerse dai media a differenza OTC della pelle, che sono dotate di aria sollevato. </li><li> Dopo 24 ore di incubazione, di fornire le culture con medio (totale medio di cambio), come detto sopra (punto 2.3.2) ora containing ridotta quantità di Aprotinina, 250 unità / ml (Giorno 5). </li><li> Per valutare l&#39;attività proliferativa delle mTECs, aggiungere EdU (6,7 mM / ml, cioè, 10 mM / pozzetto) per OTCs per 4 ore prima della cessazione delle culture. Eseguire la colorazione di OTC crio-sezioni come descritto nel Kit EdU Imaging combinata con la co-colorazione di cheratina 14. Determinare gli indici proliferative mTECs, da una delle contando cellule K14 + EdU + in due sezioni di ogni esemplare la cultura o di flusso citometria (EdU citometria a flusso, Sezione 1.7 ma invece di Ly51-FITC utilizzano CDR1-PB 15 ad una diluizione 1: 100 e 2.3.6.4). </li><li> Dopo 4-7 giorni di co-coltura, terminare i farmaci da banco e il processo per l&#39;isolamento di RNA, crio-sezionamento o FACS analisi (giorno 8-11). <ol><li> Terminate le culture utilizzando una pinza, separando l&#39;equivalente scaffold / cutanea dal filtro dell&#39;inserto bene. </li><li> Per crio-sezionamento, incorporare l&#39;intero OTC in OCT e congelare in liquid vapori di azoto prima crio-sezionamento. Preparare 5-7 micron di spessore sezioni OTC utilizzando un criostato e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Per immunoistochimica di OTC crio-sezione usare anti-cheratina 14 (AF64, uso a 1: 1.000 diluizione), e anti-vimentina (GP53, uso a 1: 100 diluizione) anticorpi. Eseguire la colorazione immunoistochimica indiretta utilizzando i rispettivi anticorpi secondari. </li><li> Per l&#39;isolamento di RNA, aggiungere 1 ml di denaturazione soluzione (contenente fenolo e guanidina tiocianato) in un tappo a vite di un tubo libero 2 ml RNasi. Tagliare l&#39;intera OTC in pezzi con un bisturi e aggiungere nella provetta contenente soluzione denaturazione. Meccanicamente sminuzzare i OTCs con strumento FastPrep due volte per 30 secondi a una velocità di 6,0, inserire tra il ghiaccio per 2 min (il campione può essere conservato a -80 ° C dopo questo punto). Se congelato a -80 ° C, scongelare su ghiaccio. Centrifugare le provette a 11,500-13,000 rpm per 10 minuti a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta, incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e fprotocolli di isolamento RNA susseguirsi utilizzando guanidinio estrazione tiocianato-fenolo-cloroformio acido come descritto dal produttore. </li><li> Per l&#39;analisi FACS, rimuovere l&#39;impalcatura e separare la membrana della fibrina / fibroblasti / gel MTEC. Finemente tagliare il gel con un bisturi e digerire in un tubo FACS per ~ 20 minuti o fino a quando completamente digerito con 2 ml di collagenasi / dispasi a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua con agitazione magnetica. Agitare la soluzione enzimatica con una pipetta Pasteur volta ogni 5 min. Dopo completa digestione, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro 70 micron; macchiare la sospensione singola cella utilizzando gli anticorpi come descritto in 1.7 e analizzare mediante citometria a flusso. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano assenza di conflitto finanziaria o commerciale di interesse.

Accanto RTOCs, l&#39;OTC 3D sono stati di gran lunga superiore in termini di differenziazione TEC e PGE manutenzione / induzione (Tabella 1) rispetto ad altri (i) &#39;culture 3D semplificati&#39; utilizzando - fibroblasti da solo senza il patibolo; (Ii) i sistemi 2D utilizzando - cellule fibroblasti / alimentatore co-coltura con TEC 10, (iii) le cellule 3T3-J2 cui cloni TEC sviluppano, ma PGE è perso, (iv) matrigel o (v) componenti ECM (dati non pubblicati). PGE è stato mantenuto fino a 7 gi...

Timociti sviluppo costituiscono circa il 98% del timo, mentre il restante 2% è costituito da una varietà di cellule che compongono collettivamente stroma timico (cioè, cellule epiteliali, cellule dendritiche, macrofagi, cellule B, fibroblasti, cellule endoteliali). Le cellule epiteliali esterni corticali (CTEC) procurano immigrazione di cellule pro-T dal midollo osseo, induzione linea cellulare T in multipotenti cellule pre-T e selezione positiva di auto-MHC limitati timociti immaturi. Le cellule interne midollari timiche epiteliali (mTECs) sono coinvolti nella induzione della tolleranza di questi timociti con un alta affinità TCR per complessi auto-peptide / MHC da uno inducendo selezione negativa o loro deviazione nella linea cellulare T normativo. Nel contesto di induzione della tolleranza centrale, mTECs sono unici in quanto esprimono un ampio spettro di auto-antigeni tissutali-limitato (Tras) rispecchiando così il sé periferica. Questo fenomeno è chiamato espressione genica promiscua (PGE)1,2. La maggior parte degli studi in corso su questo tipo di cellule affascinante si basano su cellule isolate ex vivo, come i vari sistemi di coltura 2D a breve termine invariabilmente portato alla perdita di PGE e molecole regolatore chiave come MHC di classe II, FoxN1 e Aire entro i primi 2 giorni 3-6 . Rimase tuttavia poco chiaro, che particolari componenti e le caratteristiche del reticolo 3D intatto del timo mancavano in modelli 2D. La riaggregazione coltura dell&#39;organo timica (RTOC) è stato finora l&#39;unico sistema 3D che permette lo studio dello sviluppo delle cellule T, da una parte, e la biologia cellule stromali, d&#39;altra parte, in un microambiente timico intatta 7. Tuttavia, RTOCs hanno alcune limitazioni, cioè, essi contengono già una miscela complessa di cellule, richiederà il contributo delle cellule stromali fetali e sopportare un periodo di coltura massima di 5 a 10 giorni. La mancanza di riduzionista nei sistemi di coltura in vitro ha ostacolato lo studio didiversi aspetti di sviluppo delle cellule T e thymic organogenesi non ultima la regolazione molecolare di PGE e il suo rapporto con la biologia dello sviluppo di mTECs. A causa del primo relazionalità dell&#39;organizzazione strutturata delle cellule epiteliali della pelle e del timo, abbiamo optato per un sistema 3D cultura organotipica (OTC), che era stato sviluppato originariamente per emulare la differenziazione dei cheratinociti in vitro e creare un equivalente cutanea così. Il sistema OTC costituito da una matrice inerte scaffold sovrapposti con fibroblasti dermici che sono intrappolati in un gel di fibrina, su cui cheratinociti vengono seminate 8,9. Qui, abbiamo sostituito con cheratinociti mTECs purificati. Pur mantenendo le caratteristiche di base di questo modello, abbiamo ottimizzato alcuni parametri. Nel modello OTC adottato mTECs proliferato, ha subito la differenziazione terminale e mantenuto l&#39;identità MTEC e PGE, quindi mimando in vivo sviluppo mTECs <sup&gt; 10. Questa nota tecnica fornisce un protocollo dettagliato che permette la graduale messa a punto di OTC timo.

<table><tbody><tr><td>Topi C57BL/6 in gravidanza</td><td>Colonne Charles River WIGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Colonne MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Microsfere,</td><td>topo Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere anti-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere di streptavidina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (G8.8 -Alexa 647 e -biotina)</td><td>Rif. 12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CD80-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>553769</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CD45-PerCP</td><td>BD Pharmingen</td><td>557235</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Ly51-FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553160</td><td></td></tr><tr><td>CDR1-Pacific Blue</td><td>Ref. 15</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Cheratina 14</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Vimentina</td><td>Progen</td><td>GP58</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-coniugato AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-coniugato AffiniPure F(ab')2 Frammento di capra anti-porcellino d'India IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>106-546-003</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 488</td><td>sonde molecolari coniugate (Invitrogen GmbH)</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Kit di imaging</td><td>Invitrogen</td><td>C10339</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit di test per citometria a flusso</td><td>Invitrogen</td><td>C10425</td><td></td></tr><tr><td>Inserti filtranti a 12 pozzetti (thincerts)</td><td>Greiner bio-one</td><td></td><td></td>657631</tr><tr><td>piastra a 12 pozzetti</td><td>Greiner</td><td>665180-01</td><td></td></tr><tr><td>Jettex 2005/45</td><td>ORSA, Giorla Minore, Italia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogeno TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trombina TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Serva</td><td>47302.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-049&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina (Trasylol)</td><td>Bayer</td><td>4032037</td><td></td></tr><tr><td>Tossina colera</td><td>Biomol</td><td>G117</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Seromed (Biochrom)</td><td>K3520</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&szlig; 1</td><td>Invitrogen</td><td>PHG9214</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>R& D systems</td><td>462-TR-010</td><td></td></tr><tr><td>Termolisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; T-7902</td><td></td></tr><tr><td>OCT Composto</td><td>TissueTek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (aka. Soluzione denaturante - Estrazione acida di guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio)</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep FP120</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo IV&nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS004189</td><td>0,2 mg/ml e 57U/ml conc.</td></tr><tr><td>Neutrale Proteasi (Dispasi)</td><td>CellSystems</td><td>LS002104</td><td>0,2 mg/ml e 1,2U/ml conc.</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11 284 932 001</td><td>25 &micro; g/ml conc. finale</td></tr></tbody></table>

3d organotipica co-cultura modello sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Lo sviluppo delle cellule T Intra-timico richiede un reticolo tridimensionale complessa composta da varie cellule stromali, cioè cellule non-T. Timociti attraversano questo patibolo in un ordine temporale e spaziale altamente coordinato, mentre in sequenza passa punti di controllo obbligatori, cioè, l&#39;impegno linea cellulare T, seguita da generazione repertorio recettore delle cellule T e la selezione prima della loro esportazione nella periferia. I due principali tipi di cellule che formano residente questa impalcatura sono cellule epiteliali del timo corticali (CTEC) e midollari (mTECs). Una caratteristica fondamentale di mTECs è la cosiddetta espressione promiscua di numerosi antigeni tissutali limitato. Questi antigeni tissutali con restrizioni vengono presentati immaturi timociti direttamente o indirettamente da mTECs o cellule dendritiche del timo, causando rispettivamente in self-tolleranza. Adatto in vitro modelli che emulano i percorsi di sviluppo e le funzioni di CTEC e mTECs sono attualmente lacre. Questa mancanza di adeguati modelli sperimentali è per esempio ostacolato l&#39;analisi dell&#39;espressione genica promiscua, che è ancora poco conosciuta a livello cellulare e molecolare. Abbiamo adattato una organotipica modello di co-coltura 3D per la cultura ex vivo mTECs isolati. Questo modello è stato originariamente concepita per coltivare cheratinociti in modo tale da generare un equivalente pelle in vitro. Il modello 3D conservato caratteristiche funzionali chiave di MTEC biologia: (i) la proliferazione e la differenziazione terminale di CD80 ecco, Aire-negativo in CD80 hi, Aire-positivi mTECs, (ii) la risposta a RANKL, e (iii) espressione sostenuta di FoxN1, Aire e geni tessuto-limitato a CD80 mTECs hi.

Abbiamo adottato un organotipica co-coltura modello 3D (3D OTC) che era stato originariamente sviluppato per la cultura a lungo termine in vitro dei cheratinociti 9. MTECs MACS-arricchiti (vedi MACS arricchimento schema Figura 1) sono state seminate su un ponteggio composto da un gel di fibrina e fibroblasti intrappolati. I fibroblasti forniscono la matrice extracellulare essenziale (ECM) sostegno mTECs in vitro. MTECs sono state coltivate in OTC per 4-14 giorni, in presenza...

Lo studio delle cellule epiteliali midollari del timo in vitro è stato in gran parte infruttuoso, poiché gli attuali sistemi di coltura 2D non imitano lo scenario in vivo. Il sistema di coltura 3D qui descritto - un modello di coltura organotipica della pelle modificata - si è dimostrato superiore nella ricapitolazione della proliferazione, della differenziazione e del mantenimento dell'espressione genica promiscua di mTEC.

3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare cellule epiteliali timiche midollari, o mTEC, in un sistema di coltura organotipica tridimensionale, o OTC. Questo viene ottenuto posizionando innanzitutto il materiale della matrice fibrosa in un inserto filtrante da 12 pozzetti, seguito dallo strato di un gel di fibrina appena preparato contenente fibroblasti umani della pelle. Dopo quattro o cinque giorni di precoltura, gli MTS vengono posizionati sulla matrice e coltivati in condizioni di coltura sommersa.In definitiva, su colture co-coltivate possono essere eseguite immunoidrochimica, isolamento di RNA e analisi dei dati al fine di valutare lo sviluppo del mtech CED. Il vantaggio principale dei sistemi di co-coltura organotipica 3D rispetto ai sistemi di coltura 2D esistenti è che questi ultimi sono nettamente inferiori nel riprodurre la differenziazione del mtech, la proliferazione e il mantenimento dell'espressione genica promiscua. Oggi dimostrerà questa tecnica Iris Martin, un'assistente di laboratorio del nostro laboratorio collaboratore.Quando i fibroblasti dermici umani raggiungono la confluenza, preparare le fibre del scaffold facendo bollire, asciugare e stirare i pezzi di materiale fibroso non tessuto visco spessi da 0,4 a 0,6 millimetri. Utilizzare un perforatore metallico per tagliarli in cerchi da 11 millimetri. Posizionare il materiale fibroso tagliato tra due vetrini, avvolgere i vetrini nella stagnola e sterilizzarli in autoclave.Dopo la sterilizzazione, posizionare gli inserti in pozzetti di una piastra sterile a 12 pozzetti e quindi ciascun scaffold in un inserto corrispondente. Successivamente, mescolare 2,7 × 10⁵ fibroblasti in 100 µL di siero fetale di vitello con 100 µL di trombina appena diluita per ogni scaffold. Distribuire la miscela di trombina e fibroblasti su ciascuno scaffold, seguita da 200 µL di fibrinogeno appena diluito.Quindi, mescolare la sospensione cellulare in ciascun pozzetto distribuendo uniformemente la soluzione su tutta la matrice mediante pipettaggio delicato. L'immagine mostra la crescita dei fibroblasti dermici umani con il gel di fibrina al primo e al quarto giorno di coltura. Preparare un gel di controllo in un pozzetto senza matrice per monitorare nel tempo la formazione dei coaguli anche in questo caso.Valutare la formazione del coagulo utilizzando la punta di una pipetta o capovolgendo la piastra dopo che i fibroblasti, una volta coagulati, abbiano immerso le colture organotipiche in un mezzo supplementato con acido sorbico e TGF-beta uno per quattro-cinque giorni. Nel giorno della semina delle MT E, sostituire questo mezzo con mezzo RFAD contenente 500 unità per millilitro di proteinasi inibitore per prevenire una fibrinolisi precoce. Sette-otto ore dopo, seminare 2,5 × 10⁵ MT E sospese in 100 microlitri di RFAD sulla superficie di ciascun scaffold e incubare le colture co-colturali per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire il mezzo con mezzo fresco contenente 250 unità per millilitro di a proin per ulteriori quattro-sette giorni di coltura.Per valutare lo sviluppo dei m Texs mediante immunohistochimica al termine della coltura, utilizzare una pinzetta per separare l'equivalente dermico del scaffold dal filtro di ciascun inserto. Inserire gli OTC nel composto OCT ed immergerli. Congelare gli OTC nella fase gassosa sopra azoto liquido per isolare l'O-T-C-R-N-A.Dopo aver separato il tessuto dello scaffold dai filtri, utilizzare un bisturi per tagliare gli OTC in pezzi e trasferire i pezzi in una provetta da due millilitri priva di RNA contenente un millilitro di soluzione denaturante. Utilizzando uno strumento per estrazione rapida, sminuzzare meccanicamente gli OTC due volte a una velocità di 6,0 per 30 secondi ciascuna, con un periodo di riposo di due minuti sul ghiaccio tra un sminuzzamento e l'altro. Successivamente, isolare l'RNA mediante estrazione con tiocianato di guanidina acida, fenolo e cloroformio, come descritto dal produttore.Per analizzare le OTC mediante citometria a flusso, rimuovere la membrana e separare l'impalcatura dal gel di fibrina contenente i fibroblasti mtech. Successivamente, tagliare il gel con un bisturi come appena dimostrato. Trasferire il tessuto in un tubo FACS.Continuare aggiungendo due millilitri di collaghenasi dis posta. Quindi posizionare il tubo a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua con agitazione magnetica per 20 minuti. Agitare con la pipetta una volta ogni cinque minuti finché il tessuto non sarà completamente digerito.Filtrare la sospensione cellulare risultante attraverso un filtro da 70 micrometri e colorare le cellule utilizzando gli anticorpi appropriati come illustrato. Le MTS possono essere identificate mediante l'espressione della cheratina 14, il che le rende facilmente distinguibili dai fibroblasti positivi per menton. Curiosamente, le M Tex immature e mature mostrano in coltura schemi di crescita diversi ma altamente riproducibili.I mTec immaturi CD80 D low, ad esempio, formano tipicamente bilayer a stretto contatto con i fibroblasti. Mentre i mTec CD80 D high tendono a formare aggregati cellulari compatti delimitati dai fibroblasti, i sottogruppi mTec non solo sopravvivono, ma proliferano nelle condizioni 3D OTC dimostrate, come evidenziato dall'incorporazione di EDU. Interessantemente, i mTec CD80 low proliferano a un ritmo maggiore in presenza di RANKL.Mentre il contrario è vero per le MT.Tech ad alto contenuto di CD80, dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come coltivare le MT.Tech utilizzando OTC tridimensionali. Questo è un metodo molto superiore rispetto ai sistemi di coltura bidimensionali per quanto riguarda la differenziazione delle tech e il mantenimento e l'induzione del PGE, con la possibilità di studiare o manipolare diversi parametri delle take.

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Biologia dello sviluppo

In questo video la preparazione di 2-dGuo trattati reaggregate culture timo è dimostrata.

Reaggregate Culture Thymus

Questo video dimostra la dissezione e la rimozione del timo del feto e la preparazione delle colture ex vivo di 2-dGuo trattati con timo.

La preparazione di 2-dGuo-trattati Organ Culture Timo

Questo video mostra un protocollo per la generazione di cellule T funzionali antigene-specifiche da cellule T immature derivate da iPSC utilizzando un sistema di coltura timica tridimensionale. La co-coltura delle cellule T immature derivate da iPSC con lobi timici fetali di topi endogeni depleti di linfociti ha portato alla maturazione delle cellule T per formare emigranti timici derivati da iPSC CD8αβ+ MHC di classe I+ iPSC.

Sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigranti timici derivati da iPSC

Questo manoscritto descrive una tecnica di litografia morbida a base di ingegnerizzare matrici uniformi di tridimensionale (3D) tessuti epiteliali di geometria definita circondati da matrice extracellulare. Questo metodo è suscettibile di una grande varietà di tipi di cellule e contesti sperimentali e consente di high-throughput screening di replicati identici.

Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all&#39;interno di matrice extracellulare

Descriviamo la preparazione di fette timici che, in combinazione con la citometria di flusso, possono essere utilizzate per modellare selezione positiva e negativa di sviluppare cellule T. Fette timo possono anche essere adattati per l'analisi in situ della migrazione thymocyte, localizzazione, e la segnalazione tramite immunofluorescenza e microscopia a due fotoni.

Preparazione e applicazioni di colture organotipiche timica Slice

Questo articolo descrive un nuovo metodo per generare emigranti timici (iTE) derivati da cellule staminali specifiche dell'antigene tumorale del tumore da un sistema di coltura timica tridimensionale (3D). ITE sono un sottoinsieme omogeneo di cellule T strettamente correlate alle cellule T ingenue con la capacità di proliferazione, formazione della memoria, e la soppressione del tumore.

Un sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigrati timici derivati da murine

Qui vengono descritti quattro metodi per generare organoidi testicolari da cellule testicolari murine neonatale primarie, cioè matrice extracellulare (ECM) e ambienti di coltura 2D e 3D senza ECM. Queste tecniche hanno molteplici applicazioni di ricerca e sono particolarmente utili per studiare lo sviluppo testicolare e la fisiologia in vitro.

Generazione extra di organoidi testicolari murini basati su matrice cellulare ed extra cellulare

Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per stabilire organoidi murini dell'intestino tenue, isolare le cellule linfoidi innate di tipo 1 dalla lamina propria dell'intestino tenue murino e stabilire co-colture tridimensionali (3D) tra entrambi i tipi di cellule per studiare le interazioni bidirezionali tra le cellule epiteliali intestinali e le cellule linfoidi innate di tipo 1.

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Questo protocollo descrive l'isolamento dei timociti doppi negativi dal timo di topo seguito da trasduzione retrovirale e co-coltura sul sistema di co-coltura della linea cellulare stromale del midollo osseo a 4 esprimenti delta (OP9-DL4) per ulteriori analisi funzionali.

Co-coltura e trasduzione di timociti murini su cellule stromali esprimenti delta-like 4 per studiare oncogeni nella leucemia a cellule T

Qui, descriviamo un protocollo per la formazione di organoidi di timo derivati da iPSC umane cresciuti in idrogel di fibrina 3D con l'obiettivo di supportare la maturazione delle cellule epiteliali timiche (TEC) e il mantenimento prolungato, nonché la timopoiesi in vitro.

Formazione di organoidi di timo umano in idrogel di fibrina tridimensionali

Per studiare la differenziazione e la funzione in vitro delle cellule T CD8, le cellule T CD8 possono essere isolate dal topo per essere co-colte a lungo termine con organoidi epiteliali vaginali murini infetti preformati. Qui descriviamo questo processo e valutiamo l'acquisizione dei marcatori residenti delle cellule T della memoria durante la co-coltura.

In vitro Differenziazione delle cellule T CD8 della memoria residente utilizzando il sistema di co-coltura organoide-cellula T epiteliale

Scopri la coltura organotipica 3D per le cellule epiteliali timiche midollari (mTEC) usando un scaffold fibrinoso con fibroblasti umani. Questo metodo migliora proliferazione, differenziazione e mantenimento dell'espressione genica promiscua rispetto ai sistemi 2D.

3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

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